閆學艷，何后軍，劉寶生，李 昆，張錦華

(江西農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，江西 南昌 330045)

正常仔豬腸道微生物菌群是一個復雜的微生態(tài)系統(tǒng)。Kim等2011年研究表明哺乳動物胃腸道菌群總量約為1014個，由500～1 000種細菌組成［1］。通過菌群相互作用，使胃腸道這個復雜的微生態(tài)系統(tǒng)處于一個相對平衡的狀態(tài)。正常腸道菌群起著很重要的作用，如腸道的發(fā)育、營養(yǎng)消化與吸收、生物拮抗、免疫等作用。動物機體抵抗外界環(huán)境不利因素，防止機體造成傷害的第一道防線就是腸黏膜屏障，若腸道黏膜中的微生物數(shù)量和結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈變化，使機體內(nèi)微生物結(jié)構(gòu)失衡，機體將會出現(xiàn)腹瀉反應(yīng)。仔豬腹瀉是由多種原因引起的腹瀉癥狀的總稱，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失，目前己經(jīng)成為世界性的研究課題。仔豬在受到外界環(huán)境影響時，如病原微生物、應(yīng)激等，腸道菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)量等易發(fā)生改變，加之仔豬的生理結(jié)構(gòu)、腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能不健全，體質(zhì)較差的仔豬就可能腸道菌群失調(diào)，發(fā)生腹瀉［2］。仔豬發(fā)生腹瀉時，消化道固有菌群會發(fā)生改變，如乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量會降低，大腸桿菌的數(shù)量增加，腸球菌的數(shù)量無顯著差異［3］。同時有研究表明不同日齡，斷奶，以及飲食變化也影響仔豬腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)變化［4］。本研究利用傳統(tǒng)細菌平板計數(shù)的方法和PCR-DGGE技術(shù)比較了健康和腹瀉仔豬腸道菌群數(shù)量差異和菌群結(jié)構(gòu)變化，初步探討腹瀉對仔豬腸道菌群變化的影響。

1 材料方法

1．1 主要試劑、酶及引物

MRS 肉湯、平板計數(shù)瓊脂、TEMED、溶菌酶、Taq酶、10×PCR Buffer、dNTPs

表1 本研究所用引物序列Tab．1 List of DNA oligo nucleotides used in this study

依據(jù)王迪［7］的方法配制蛋白酶K溶液，3 mol/L NaAc，TE，20%SDS溶液，1%的瓊脂糖凝膠，磷酸鹽緩沖溶液，V(苯酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1，EDTA(0．5 mol/L，pH=8．0)，50×TAE 儲備液，40%丙烯酰胺貯存液，0%變性劑儲存液，100%變性劑儲存液，10%過硫酸銨，8×固定液，1×固定液，銀染液，顯影劑。

1．2 樣品采集

采集7、14、21、28、35日齡健康仔豬和腹瀉仔豬新鮮糞便，每個樣取兩份，一份用于細菌計數(shù)，另一份-20℃保存，進行PCR-DGGE總菌菌群多樣性及乳酸桿菌菌群多樣性分析。

1．3 細菌計數(shù)

將采集的7、14、21、28、35日齡三份健康仔豬和三份腹瀉仔豬新鮮樣品，以滅菌的0．85%生理鹽水進行稀釋，取4個連續(xù)的稀釋度，每個稀釋度混合物取100μL，涂布平板計數(shù)瓊脂平板進行細菌總數(shù)計數(shù)，涂布MRS平板，進行乳酸桿菌計數(shù)，每個稀釋度設(shè)兩個重復。涂布完畢，先正置10min，然后倒置放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細菌總數(shù)37℃，48 h計數(shù)，乳酸桿菌燭缸中37℃，24 h計數(shù)。計算出每克樣品中的細菌數(shù)。

1．4 仔豬腸道總細菌及乳酸桿菌的PCR－DGGE菌群多樣性分析方法

將保存于-20℃冰箱的糞便樣品按日齡，健康，腹瀉分類，某日齡健康的和腹瀉的糞便樣品至少分別提取3份樣品的DNA，并用核酸微量濃度測定儀對提取的DNA進行濃度測定，并保存于-20℃冰箱。

1．5 PCR擴增與樣品 DGGE

1．5．1 腸道總細菌的16S rDNA片段PCR擴增 用帶有GC夾子序列的細菌通用引物(U968-GC和L1401)對細菌總基因組DNA的16S rDNA V6-V8區(qū)進行PCR擴增。PCR體系(25μL)為ddH2O 17．25μL，10×PCR Buffer 2．5 μL，dNTPs 1．0 μL，上游引物 1．0 μL，下游引物 1．0 μL，rTaq DNA 聚合酶 0．25 μL，模板DNA 2．0μL，空白對照不加模板，加2．0μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序為94℃ 預變性5 min，94℃ 變性30 s，56℃ 退火20 s，68℃ 延伸40 s，35個循環(huán)，最后68℃延伸7 min。1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測。

1．5．2 乳酸桿菌的16S rDNA片段套式PCR擴增 用第一對引物(Bact0027和Lab0677)PCR擴增出16S rDNA700 bp左右的片段。PCR體系同腸道總細菌的16S rDNA片段PCR擴增，PCR反應(yīng)程序為94℃預變性5 min，94℃ 變性30 s，66℃退火20 s，68℃延伸40 s，35個循環(huán)，最后68℃延伸7 min。以第一對引物PCR擴增出的產(chǎn)物為模板，Uni0515-GC，Lab0159為引物PCR擴增出16S rDNA 440 bp左右的片段。PCR 體系(25 μL)為 ddH2O 18．75 μL，10×PCR Buffer 2．5 μL，dNTPs 1．0 μL，上游引物 1．0 μL，下游引物 1．0 μL，rTaq DNA 聚合酶 0．25 μL，模板 DNA 0．5 μL，空白不加模板，加 0．5 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序及檢測同腸道總細菌的16S rDNA片段PCR擴增。

1．5．3 樣品DGGE制備及其指紋圖譜分析 將兩塊玻板組裝成“三明治”結(jié)構(gòu)，以1．5%瓊脂糖封底，配制高濃度和低濃度膠液，灌膠，膠凝固后，將梳子拔下，將整個“三明治”結(jié)構(gòu)用夾子夾到電泳架上，加樣10μL，設(shè)定溫度為60℃，電壓為85 V，時間設(shè)為12 h，啟動。電泳完畢，將儀器電源全部關(guān)閉，取出電泳架，取下膠片，固定、銀染、顯色，條帶出現(xiàn)后相機拍照。利用Quantity One軟件對不同日齡的健康和腹瀉仔豬腸道總細菌及乳酸桿菌DGGE指紋圖譜進行聚類分析。

2 結(jié)果分析

2．1 細菌計數(shù)結(jié)果

本研究將樣品按日齡和健康腹瀉分類，計數(shù)各培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，計數(shù)結(jié)果以3個樣品的平均值取對數(shù)表示，結(jié)果如圖1，并利用等方差t檢驗對健康與腹瀉仔豬腸道菌群數(shù)進行分析，21日齡細菌總數(shù)差異極顯著，21日齡乳酸桿菌數(shù)差異顯著，其它日齡菌數(shù)差異均不顯著。

圖1 不同日齡健康和腹瀉仔豬腸道細菌總數(shù)，乳酸桿菌數(shù)的log值Fig．1 The log value of the number of total bacteria，lactobacillus of healthy and diarrhea piglets samples at different days

2．2 樣品中總細菌及乳酸桿菌的16S rDNA PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測

采用帶有GC夾子序列的細菌通用引物(U968-GC和L1401)對微生物總基因組DNA的16S rDNA V6-V8區(qū)進行PCR擴增，目標片段440 bp。目標條帶大小與預期結(jié)果一致，且擴增的目的片段條帶無拖尾和雜帶，可以進行DGGE。

用套式PCR擴增乳酸桿菌屬特異的 16S rDNA片段，先用引物(Bact0027和Lab0677)首先擴增出大概700 bp的片段，再用帶GC夾子的引物(Uni0515-GC和Lab0159)擴增出440 bp左右的片段，目標條帶大小與預期結(jié)果一致，且擴增的目的片段條帶無拖尾和雜帶，可以進行DGGE。

圖2 不同日齡健康腹瀉仔豬腸道菌群DGGE圖譜Fig．2 The DGGE fingerprint of bacteria flora of healthy and diarrhea piglets at different days

2．3 健康和腹瀉仔豬總細菌及乳酸桿菌16S rDNA DGGE及分析結(jié)果

根據(jù)預實驗結(jié)果確定總細菌DNA的PCR擴增產(chǎn)物DGGE變性劑的梯度為45%～65%，根據(jù)預實驗結(jié)果確定乳酸桿菌的DGGE變性劑的梯度為35%～55%。

總細菌DGGE圖譜如圖2，圖譜中的條帶比較豐富。不同日齡的健康和腹瀉仔豬腸道菌群的DGGE聚類分析如圖3，表明，健康樣品之間的相似性在68%～86%之間;相同日齡的健康和腹瀉仔豬樣品的相似性，14日齡最高，達到81%，21日齡最低，為65%。

圖3 不同日齡健康腹瀉仔豬腸道菌群DGGE圖譜的聚類分析Fig．3 The picture of the clustering on DGGE fingerprint of bacteria flora of the healthy and diarrhea piglets at different days

圖4 不同日齡健康腹瀉仔豬乳酸桿菌的DGGE圖譜Fig．4 The lactobacillus DGGE fingerprint of healthy and diarrhea piglets at different days

圖5 不同日齡健康腹瀉仔豬乳酸桿菌的DGGE圖譜的聚類分析Fig．5 The picture of the clustering on DGGE fingerprint of lactobacillus of the healthy and diarrhea piglets at different days

乳酸桿菌DGGE圖譜顯示如圖4，在條帶出現(xiàn)的主要區(qū)域內(nèi)，健康組樣品及腹瀉組樣品中條帶數(shù)均在13條左右。由圖5聚類分析可知，十組樣品的相似性在71%～96%之間，21日齡的健康與腹瀉的樣品相似度最低為71%，與其它日齡比，腹瀉導致的腸道菌群失調(diào)的嚴重程度比較高。其它日齡健康組與腹瀉組菌群相似度都比較高，以28日齡最高為94%。

3 討論與結(jié)論

PCR-DGGE方法研究腸道菌群的多樣性與傳統(tǒng)的體外培養(yǎng)技術(shù)相比具有優(yōu)越性，主要體現(xiàn)在:這種方法不依賴于微生物的分離培養(yǎng)，而是通過直接從樣品中提取DNA進行研究，研究對象既包括了可培養(yǎng)的微生物，也包括了存在但不可培養(yǎng)的微生物，這樣可以更全面的反映樣品中微生物的組成情況;這種方法與傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)相比，節(jié)省時間，直觀，可進行聚類分析。

同時PCR-DGGE方法研究腸道菌群多樣性也存在局限性，主要體現(xiàn)在:從樣品中提取到的DNA的質(zhì)量直接影響DGGE的結(jié)果，微生物種類在除雜質(zhì)及沉淀DNA等的過程中容易發(fā)生改變，這樣會影響DNA的提取效果［8］，使一些含量比較低的微生物在圖譜中無法反映出來;同時不同的DNA模板可能出現(xiàn)錯配，而且擴增效率也不一定相同，還有，圖譜反應(yīng)的情況可能與樣品中的微生物的情況有差異;試驗操作過程中，如變性劑的范圍，電泳的時間以及染色的方法和時間等都可能導致研究結(jié)果不準確;一些研究DGGE圖譜中的單一條帶常被鑒定為不同的菌，也就是條帶存在共遷移現(xiàn)象，將導致估計的樣品中的微生物種類數(shù)偏低［9］。研究發(fā)現(xiàn)［10］16S rDNA在單個菌株中常常有多個拷貝數(shù)，它們之間僅存在微小的差別，用單個菌株的DNA進行DGGE，在DGGE圖譜中會出現(xiàn)多個條帶，將導致估計的樣品中的微生物種類數(shù)偏高，而且只有500 bp以下的DNA片段才能在含變性劑的丙烯酰胺膠上得到分離［11］，所以如果片段過大，將得不到很好的分離。

PCR-DGGE技術(shù)有優(yōu)點也有不足，可以通過改進DNA的提取方法，優(yōu)化PCR條件，優(yōu)化變性劑梯度范圍等方法加以改進，同時可結(jié)合其它方法共同研究，使研究結(jié)果更可信。

魏華等實驗研究表明［12］對 HFA仔豬腸道各段優(yōu)勢細菌 PCR-DGGE與3個類群特異性PCRDGGE分析結(jié)果均提示，盲腸與結(jié)腸近端的黏膜黏附菌群組成非常相似。Eckburg等對3個美國健康成人的盲腸黏膜、橫結(jié)腸黏膜、升結(jié)腸黏膜、乙狀結(jié)腸黏膜、降結(jié)腸黏膜、直腸黏膜以及糞便分別構(gòu)建16S rDNA文庫，發(fā)現(xiàn)各段黏膜黏附菌的菌群組成差異很?。?3］。本試驗選擇既能反應(yīng)腸道菌群的真實情況，又方便易采的新鮮糞便為研究對象，通過傳統(tǒng)的平板計數(shù)法對不同日齡，健康腹瀉樣品的細菌總數(shù)和乳酸桿菌進行了計數(shù)。一般來說，腹瀉影響腸道菌群的構(gòu)成，并且隨著腹瀉的發(fā)展，最終使腸道微生物區(qū)系遭到嚴重破壞［14］。有研究顯示，仔豬發(fā)生腹瀉，仔豬腸道內(nèi)優(yōu)勢菌群數(shù)量會發(fā)生改變，如乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量會降低，大腸桿菌的數(shù)量增加，腸球菌的數(shù)量無顯著差異［15］。何明清等［16］使用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法計數(shù)下痢仔豬空腸和直腸中菌群數(shù)量研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌等需氧菌數(shù)量均增加、雙歧桿菌等厭氧菌數(shù)量均減少。本試驗計數(shù)結(jié)果表明健康組和腹瀉組的糞便樣品中的細菌總數(shù)腹瀉組較健康組均有下降，21日齡的差異極顯著，其它日齡組差異不顯著。乳酸桿菌數(shù)，腹瀉組較健康組均有所下降，21日齡的差異顯著，其它日齡差異均不顯著?？偩?，乳酸桿菌，21日齡組的差異顯著與相關(guān)研究［16］一致，差異不顯著腹瀉組可能處于腹瀉早期，還未發(fā)生菌群嚴重失調(diào)。

21日齡細菌總數(shù)腹瀉組較健康組數(shù)量減少，且差異極顯著，DGGE指紋圖譜分析，與其它日齡組相比21日齡健康與腹瀉仔豬樣品相似度最低;21日齡乳酸桿菌數(shù)腹瀉組較健康組數(shù)量減少，且差異顯著，DGGE指紋圖譜分析21日齡的健康與腹瀉仔豬樣品相似度最低，說明仔豬發(fā)生腹瀉，細菌總數(shù)變化與菌群結(jié)構(gòu)復雜程度變化可能存在一定的相關(guān)性。謝飛［17］研究表明仔豬腹瀉后，糞樣菌群的相似性呈下降趨勢，暗示糞樣中的菌群可能發(fā)生變化;仔豬糞樣中的總細菌、大腸桿菌和乳酸桿菌進行定量分析表明，與健康仔豬相比，腹瀉仔豬糞樣中的總細菌和乳酸桿菌數(shù)量顯著下降(P＜0．05)，而大腸桿菌的數(shù)量有增多的趨勢，但差異不顯著。本研究結(jié)果與之具有一致性。

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