徐兵強(qiáng)，賀庭琪，王力敏，王 丹，孫 勇，王旭初*，郭安平*

(1．海南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，海南 ?？?570228;2．中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101)

木薯(Manihot esculenta Crantz)為大戟科(Euphorbiaceae)木薯屬(Manihot Miller)植物，原產(chǎn)于熱帶南美洲地區(qū)，是世界3大薯類作物之一，為世界7億多人口提供基本食物，也是淀粉工業(yè)和生產(chǎn)燃料乙醇的主要來(lái)源［1］。木薯具有獨(dú)特的理化性能、重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值和相對(duì)較少的基因組，現(xiàn)逐漸成為熱帶作物研究的模式作物，其光合理化性質(zhì)明顯優(yōu)于其他熱帶作物，具有較高的凈光合速率、高光不飽和以及介于C3和C4結(jié)構(gòu)之間的結(jié)構(gòu)特征［2］。因此，研究其高光效機(jī)理是木薯基礎(chǔ)研究的重要目標(biāo)之一。

由于木薯基因型高度雜合且光合作用過(guò)程極其復(fù)雜，目前木薯光合作用研究主要集中在各種光合生理指標(biāo)的測(cè)定等方面，對(duì)于木薯光合作用特性及其高光效機(jī)理方面的研究相對(duì)較少。張楊等［3］從光合生理、葉片解剖結(jié)構(gòu)、光合作用轉(zhuǎn)錄組比較及部分關(guān)鍵基因表達(dá)分析探討栽培木薯高光效的機(jī)制及其與淀粉高效累積的關(guān)系。左應(yīng)梅等［4］從生理生態(tài)角度探討了木薯的光合特性及其對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)，初步認(rèn)為光飽和點(diǎn)(LSP)、胞間CO2濃度(Ci)、光補(bǔ)償點(diǎn)(LCP)等因子可作為木薯耐蔭性的評(píng)價(jià)指標(biāo)。另外，不同木薯品種光合產(chǎn)物分配、凈光合速率與Ci間關(guān)系以及葉綠素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)及參與光合作用中光系統(tǒng)Ⅱ相關(guān)蛋白差異表達(dá)等方面的研究也有相關(guān)報(bào)道［5-6］。蛋白質(zhì)組水平上，一方面，研究人員開(kāi)展了低溫、干旱、光照等脅迫下木薯葉片蛋白質(zhì)組研究，獲得了大量差異蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)，其中在持續(xù)光照和黑暗條件下從木薯葉片中成功鑒定了差異蛋白質(zhì)點(diǎn)129個(gè)(對(duì)應(yīng)104種蛋白質(zhì))，涉及10個(gè)功能類［7-10］;另一方面，進(jìn)行了木薯生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中葉片蛋白質(zhì)組學(xué)分析，如分析了木薯從纖維根到塊根過(guò)程中葉片蛋白質(zhì)組的變化，成功鑒定了39個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，涉及6個(gè)功能類［11］;同時(shí)，對(duì)二倍體和四倍體木薯葉片，木薯接穗和砧木葉片以及塊根也進(jìn)行了比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析［12-13］。

光照既是綠色植物唯一的能量來(lái)源，又是調(diào)節(jié)其生長(zhǎng)發(fā)育不可或缺的一種環(huán)境因子，如光照能夠調(diào)控葉綠體發(fā)育等。葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的器官，對(duì)葉綠體內(nèi)的各種生物過(guò)程人們已積累了許多知識(shí)，但對(duì)葉綠體蛋白質(zhì)的表達(dá)還所知相對(duì)不多［14-15］。目前，僅見(jiàn)賀庭琪等［16］采用改進(jìn)酚抽提法提取蛋白，通過(guò)雙向SDS-PAGE電泳，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF MS)，比較了不同木薯品種葉綠體的蛋白表達(dá)譜，并對(duì)已鑒定蛋白進(jìn)行了功能分類，為從“組學(xué)”方法大規(guī)模、系統(tǒng)性研究木薯葉綠體提供了借鑒。本研究以代表性種質(zhì)SC8木薯為試驗(yàn)材料，通過(guò)對(duì)木薯幼苗進(jìn)行1，3，5 d暗處理，應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，旨在研究在黑暗條件下木薯葉綠體中受光調(diào)控蛋白的變化，以期在蛋白質(zhì)水平篩選受光調(diào)控的基因，為后期深入研究提供數(shù)據(jù)支持和理論參考。

1 材料與方法

1．1 材料種植與處理

SC8木薯種莖由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所提供。當(dāng)年3月下旬扦插種植，正常生長(zhǎng)約3個(gè)月，植株高度約100 cm，選取生長(zhǎng)健壯和健康植株，置于相同人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行不同光照處理。分為2個(gè)處理組:正常光照處理(16 h光照，1．0×105lx/8 h黑暗，28℃/25℃;CK);黑暗處理(24 h黑暗，25℃;D，dark)，相對(duì)濕度均為70%。分別于處理后1，3，5 d取成熟葉片作為實(shí)驗(yàn)材料。采集的木薯葉片液氮速凍，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2 試劑

葉綠體提取緩沖液:1 mmol/L氯化鎂，0．3 mol/L山梨醇，50 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸/氫氧化鉀(pH 7．8)，2 mmol/L乙二胺四乙酸，體積分?jǐn)?shù)0．04% β-巰基乙醇和1 g/L交聯(lián)聚維酮。

葉綠體分離緩沖液:1 mmol/L氯化鎂，0．3 mol/L山梨醇，50 mmol/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸/氫氧化鉀(pH 7．8)，2 mmol/L 乙二胺四乙酸。

BPP法蛋白提取緩沖液:100 mmol/L Tris，100 mmol/L乙二胺四乙酸，50 mmol/L硼砂，50 mmol/L維生素C，10 g/L交聯(lián)聚維酮，體積分?jǐn)?shù)1%Triton X-100，體積分?jǐn)?shù)2% β-巰基乙醇和300 g/L蔗糖，pH 8．0。

蛋白裂解液:7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，20 g/L 3-［3-(膽酰氨丙基)二甲氨基］丙磺酸內(nèi)鹽，13 mmol/L二硫蘇糖醇，體積分?jǐn)?shù)1%IPG buffer。

標(biāo)準(zhǔn)Laemmli buffer:62．5 mmol/L Tris-HCl，20 g/L十二烷基磺酸鈉，體積分?jǐn)?shù)10%甘油，體積分?jǐn)?shù)5% β-巰基乙醇，0．01 g/L 溴酚藍(lán)。

膠條平衡液:50 mmol/L Tris-HCl，6 mol/L尿素，體積分?jǐn)?shù)30%甘油，20 g/L十二烷基磺酸鈉，0．02 g/L溴酚藍(lán)。

GAP凝膠染色液:1．25 g/L考馬斯亮藍(lán)G-250，100 g/L硫酸銨，體積分?jǐn)?shù)5%磷酸，體積分?jǐn)?shù)30%乙醇，體積分?jǐn)?shù)10%甲醇;

凝膠脫色液:體積分?jǐn)?shù)30%乙醇，體積分?jǐn)?shù)5%乙酸。

酶緩沖液:1 mmol/L氯化鈣，25 mmol/L碳酸氫銨，pH 8．5。

1．3 方法

1．3．1 葉綠體分離 木薯葉綠體的分離方法采用Percoll梯度密度離心法［16-17］。

1．3．2 葉綠體蛋白提取 基于酚抽法［18］改進(jìn)的BPP(Borax/PVPP/Phenol)法，具體操作步驟參考Wang 等［19］的方法。

1．3．3 蛋白定量 主要參考Bradford方法［20］，每個(gè)樣品至少重復(fù)3次。

1．3．4 SDS-PAGE凝膠電泳 一維凝膠電泳(1-DE):采用不連續(xù)膠SDS-PAGE法［21］，濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為12．5%，每孔蛋白上樣量約為30μg，與2倍標(biāo)準(zhǔn) Laemmli buffer等體積混勻后上樣。在Hoefer SE600X標(biāo)準(zhǔn)垂直板電泳儀上進(jìn)行，電泳條件為16℃恒溫電泳3 h左右，電泳參數(shù)設(shè)置為3W/gel 50 min，6 W/gel 2 h。

二維凝膠電泳(2-DE):2-DE蛋白上樣量約為1 200μg，上樣總體積為455μL。蛋白樣品在水化盤(pán)內(nèi)使24 cm的pH 4-7線性IPG干膠條被動(dòng)吸脹，水化16 h左右，膠條上覆蓋礦物油防止樣品揮發(fā)。第一向等電聚焦程序設(shè)定為:250 V，3 h;500 V，2 h;1 000 V，1 h;1 000 V升至10 000 V，3 h;10 000 V，130 000 Volt hour(Vhr)，每根膠條限流50μA。聚焦結(jié)束后，用含1%DTT的平衡液和含4%碘乙酰胺的平衡液各平衡膠條15 min，平衡結(jié)束后在Ettan Daltsix電泳儀(GE Healthcare)中進(jìn)行第二向SDSPAGE，電泳條件為 16 ℃恒溫電泳約 4．5 h，電泳參數(shù)設(shè)置為 1．5W/gel 1 h，8W/gel 3．5 h。

1．3．5 凝膠染色及圖像采集分析 凝膠染色主要采用Wang等［22］改進(jìn)的考馬斯亮藍(lán)染色法。凝膠染色后用ImageScanner III掃描儀(GE Healthcare)進(jìn)行掃描和圖像采集。用ImageMaster 2D Platinum軟件(Amersham Bioscience)進(jìn)行分析，包括蛋白點(diǎn)檢測(cè)、凝膠匹配和統(tǒng)計(jì)分析等，獲得差異表達(dá)蛋白點(diǎn)。

1．3．6 蛋白點(diǎn)膠內(nèi)酶解 具體步驟參考王旭初等［23］的簡(jiǎn)化膠內(nèi)酶解方法。挖取的蛋白點(diǎn)酶解后收集上清液，可直接用于質(zhì)譜鑒定。

1．3．7 酶解產(chǎn)物質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)庫(kù)搜索 酶解產(chǎn)物質(zhì)譜鑒定采用Bruker公司的基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS/MS II，Bruker)，具體操作參考Shen等［24］的方法。所得數(shù)據(jù)通過(guò)Mascot Distiller軟件分析，分析結(jié)果利用Matrix science網(wǎng)站(http://www．matrixscience．com)的搜索引擎進(jìn)行數(shù)據(jù)搜索和匹配。檢索參數(shù)設(shè)置為:

Databases為 NCBInr、Taxonomy為 Viridiplantae(Green plants)、Enzyme為 Trypsin、Fixed modifications為 Carbamidomethyl(C)、Missed cleavages為 1、肽質(zhì)量性質(zhì)為單電荷和［MH+］、variable modifications為Oxidation(M)、Peptide tol．為±300 μg/mL。軟件設(shè)定檢索蛋白匹配達(dá)到大于95%的可信度(P＜0．05)，鑒定得到蛋白具體信息。

2 結(jié)果與分析

2．1 木薯葉綠體蛋白質(zhì)組2-DE圖譜分析

利用ImageMaster 2D Platinum軟件對(duì)黑暗條件下木薯葉綠體差異表達(dá)蛋白質(zhì)組圖譜進(jìn)行分析，自動(dòng)檢測(cè)結(jié)合人工去除，分別檢測(cè)出(439±19)個(gè)、(501±22)個(gè)和(415±17)個(gè)高清晰且重復(fù)性強(qiáng)的蛋白點(diǎn)，經(jīng)對(duì)這些蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)豐度進(jìn)行差異檢測(cè)，共獲得差異蛋白點(diǎn)186個(gè)(表達(dá)豐度變化1．5倍以上)，包括46個(gè)時(shí)間特異性蛋白點(diǎn)和140個(gè)豐度表達(dá)蛋白點(diǎn)(圖1)，具體分布情況如圖2，與對(duì)照樣品相比，僅在處理后1天表達(dá)的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)12個(gè)(下調(diào)表達(dá)的5個(gè))、處理后3天表達(dá)的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)15個(gè)(下調(diào)表達(dá)的14個(gè))、處理后5天表達(dá)的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)19個(gè)(下調(diào)表達(dá)的9個(gè))。

圖1 木薯葉綠體總蛋白質(zhì)雙向電泳結(jié)果Fig．1 2-DE maps of cassava chloroplast proteins

2．2 質(zhì)譜鑒定及生物信息學(xué)分析

分別選取不同處理時(shí)間下15個(gè)重復(fù)性好且分離性好的代表性差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶解，隨后進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜鑒定，獲得了比較好的PFF和PMF圖譜(圖3-A)。由于熱帶作物木薯沒(méi)有專用蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，因此將質(zhì)譜結(jié)果通過(guò)Mascot Distiller軟件分析后，利用Matrix Science搜索引擎(http://www．matrixscience．com/search)在 NCBInr(NCBI-National center for biotechnology information non-redundant database)綠色植物總庫(kù)中進(jìn)行搜索，經(jīng)一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜，共鑒定差異蛋白質(zhì)點(diǎn)28個(gè)，最終有8個(gè)蛋白點(diǎn)的一級(jí)質(zhì)譜搜庫(kù)得分值超過(guò)了72分可信值(P＜0．05%)，有20個(gè)蛋白點(diǎn)的二級(jí)質(zhì)譜搜庫(kù)得分超過(guò)43分可信度(P＜0．05%)。結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。

對(duì)搜庫(kù)得到的可信蛋白理論等電點(diǎn)和分子質(zhì)量與實(shí)驗(yàn)測(cè)得等電點(diǎn)和分子質(zhì)量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)值和理論值基本一致，在雷達(dá)示意圖中比值都集中在1附近(圖3-B)。只有少數(shù)蛋白的等電點(diǎn)和分子質(zhì)量出現(xiàn)偏差，例如C1，鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些蛋白是某些蛋白的亞基，而執(zhí)行生物學(xué)功能的蛋白通常是由多亞基組成，在進(jìn)行變性膠電泳時(shí)可以將其各個(gè)亞基分離。因此，等電點(diǎn)和分子質(zhì)量會(huì)出現(xiàn)偏移現(xiàn)象。

參照擬南芥蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)信息，利用KABOS2．0系統(tǒng)進(jìn)行了參與的生物途徑分類，結(jié)合文獻(xiàn)相關(guān)信息，根據(jù)鑒定的28個(gè)差異蛋白功能，可將蛋白質(zhì)分為9類(圖3-C):捕光復(fù)合體/葉綠素結(jié)合蛋白(7%)、光系統(tǒng)Ⅱ(11%)、光合電子傳遞(7%)、光系統(tǒng)Ⅰ(7%)、能量代謝(14%)、Calvin循環(huán)(21%)、氨基酸代謝(4%)、脅迫防御(11%)和未知功能(18%)。

圖2 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)在各處理時(shí)間中的分布情況Fig．2 Distribution of differentially expressed proteins in the processing time

圖3 暗處理下木薯葉綠體中典型差異蛋白點(diǎn)MALDI-TOFMS質(zhì)譜鑒定分析Fig．3 MALDI-TOFMSanalysis of typical variable protein spots from cassava chloroplast under dark treatment

表1 差異蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定結(jié)果Tab．1 Putative identities of the MALDI-TOF-MS identified proteins

續(xù)表1

3 結(jié)論與討論

本研究鑒定結(jié)果表明，差異蛋白質(zhì)幾乎涵蓋了如碳同化和光合作用等主要的葉綠體代謝調(diào)控途徑中所涉及的蛋白質(zhì)。

3．1 光反應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)

筆者鑒定得到了光反應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)13個(gè):光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)蛋白4個(gè)、光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)蛋白4個(gè)、Cyt b6f復(fù)合體蛋白1個(gè)和ATP合酶復(fù)合體蛋白4個(gè)(表1)。其中，(1)捕光復(fù)合體相關(guān)蛋白質(zhì)。PSⅠ中的葉綠素a/b結(jié)合蛋白Lhca3(C1)在暗處理后，表達(dá)量為先下調(diào)后上調(diào)，PSⅡ中的捕光復(fù)合物蛋白Lhcb1(C2)表達(dá)量逐漸上升。有研究［25-27］表明，作為捕光復(fù)合體的重要組成部分，捕光色素結(jié)合蛋白的降解受光調(diào)控。這與在不同光照強(qiáng)度下玉米和小黑楊類囊體膜上捕光色素結(jié)合蛋白變化趨勢(shì)相同。(2)PSⅡ中放氧復(fù)合體的外周蛋白質(zhì)。放氧增強(qiáng)蛋白(oxygen-evolving enhancer protein，OEE)主要功能是催化水裂解而放出氧氣，還原質(zhì)體醌，產(chǎn)生跨膜質(zhì)子梯度。研究［28-29］表明，當(dāng)植物受到嚴(yán)重脅迫時(shí)與光合作用相關(guān)蛋白會(huì)發(fā)生降解，而OEE就是光合相關(guān)蛋白的降解產(chǎn)物，且OEE2表達(dá)量的升高可以修復(fù)因降解造成的蛋白結(jié)構(gòu)破壞，保證氧循環(huán)正常。OEE1(C3)、OEE2(C4)和OEE3(C5)在暗處理后表達(dá)量均先上調(diào)后下調(diào)。這初步說(shuō)明，暗處理后光合相關(guān)蛋白降解發(fā)生到一定程度，OEE2表達(dá)水平雖有所提高，但最終仍抑制了水的分解，減少了分子氧的積累。在擬南芥響應(yīng)光照脅迫過(guò)程中OEE蛋白的表達(dá)也發(fā)生了變化［30］。(3)細(xì)胞色素 b6f(Cyt b6f)相關(guān)蛋白質(zhì)。Cyt b6f含有 Cyt f、Cyt b6和鐵-硫蛋白(RfeS)，在PSⅡ和PSⅠ光反應(yīng)復(fù)合體間執(zhí)行電子傳遞功能，氧化質(zhì)醌，形成跨膜質(zhì)子梯度為ATP合成提供原動(dòng)力［31］。RfeS(C6)表達(dá)量呈先下調(diào)后升高。推測(cè)可能是暗處理后光合電子傳遞鏈相關(guān)組分的合成受到了抑制，導(dǎo)致PSⅡ電子傳遞速率下降，進(jìn)而影響色素的正常合成。(4)PSⅠ反應(yīng)中心相關(guān)蛋白質(zhì)。PSⅠ在光反應(yīng)中的主要功能是驅(qū)動(dòng)質(zhì)體蘭素(Pc)與氧鐵硫蛋白(Fd)之間的氧化還原反應(yīng)，促使電子從Pc傳遞到Fd。本實(shí)驗(yàn)鑒定了PSⅠ蛋白3個(gè)(C7-C9)，表達(dá)量呈先下調(diào)后升高，其中鐵氧還蛋白-煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸還原酶(FNR)的催化產(chǎn)生還原力NADPH是葉綠體中光反應(yīng)電子鏈的最后一步。暗處理后FNR蛋白(C9)表達(dá)量呈先下調(diào)后升高，可能抑制了NADPH的產(chǎn)生，從而阻礙了同化作用。(5)ATP合酶亞基蛋白質(zhì)。葉綠體ATP合酶屬于F型ATP合酶家族，是能量代謝的關(guān)鍵酶，其主要功能是控制類囊體腔內(nèi)質(zhì)子流出，其表達(dá)量變化會(huì)影響葉綠體光能轉(zhuǎn)化能力［32］。ATP合酶蛋白(C10-C13)表達(dá)量在暗條件下表達(dá)量先升高后降低，光照環(huán)境的變化可能是抑制ATP合酶的正常表達(dá)，減少ATP能量的釋放，并與FNR共同作用產(chǎn)生了光合逆境。

類囊體膜是植物光合作用中光能轉(zhuǎn)化成化學(xué)能的主要部位，以上4種復(fù)合體都定位在類囊體膜上，絕大多數(shù)蛋白在暗處理后表達(dá)量上升，這說(shuō)明木薯中定位于類囊體膜上的部分蛋白含量受光調(diào)控，且木薯會(huì)通過(guò)調(diào)控類囊體膜類蛋白質(zhì)以適應(yīng)光照不足的環(huán)境，這與很多文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相同［10，26-27，33-34］。4種多亞基的復(fù)合物通過(guò)聯(lián)合作用，共同參與光能吸收、傳遞與轉(zhuǎn)化、電子傳遞、H+輸送和ATP合成等反應(yīng)，最終產(chǎn)生ATP和NADPH。但NADPH和ATP并不是同時(shí)產(chǎn)生的，ATP的產(chǎn)生對(duì)于NADPH的生成，相互之間是怎樣的作用關(guān)系和促進(jìn)作用，仍有待進(jìn)一步研究［35］。

3．2 Calvin循環(huán)相關(guān)蛋白質(zhì)

黑暗處理影響了碳固定關(guān)鍵酶的表達(dá)。筆者鑒定出Calvin循環(huán)相關(guān)蛋白質(zhì)4個(gè)，包括核酮糖1，5二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基(RuBisCO LSU)、RuBisCO小亞基(RuBisCO SSU)、磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase，PGK)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(triosephosphate isomerase，TPI)、磷酸核酮糖激酶(phosphoribulokinase，PRK)。其中，RuBisCO是植物C3途徑中催化Calvin循環(huán)中碳固定的第一步反應(yīng)，由大小兩種亞基組成。筆者鑒定了RuBisCO大亞基和小亞基各1個(gè)(C14-C15)，暗處理后表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)。PGK是糖酵解的關(guān)鍵酶，其自身及其催化的產(chǎn)物3-磷酸甘油酸，在呼吸代謝途徑中與能量的產(chǎn)生有密切的關(guān)系。PGK(C16)在暗處理后表達(dá)量下調(diào)。TPI是糖酵解重要酶，催化磷酸二羥丙酮和甘油醛-3-磷酸之間的可逆反應(yīng)。TPI(C17)在暗處理后表達(dá)量先下調(diào)后上調(diào)，且1天顯著下調(diào)。PRK是Calvin循環(huán)特有的酶，是其第3個(gè)階段的最后一步，即受體的再生，它催化5-磷酸核酮糖再生RuBP，是不可逆反應(yīng)。PRK(C18)暗處理后表達(dá)量呈先下降后上調(diào)。Calvin循環(huán)中碳固定相關(guān)4種關(guān)鍵酶的表達(dá)模式幾乎相同，即佐證了它們處于同一循環(huán)中的功能相關(guān)性及其前后銜接關(guān)系，也清楚地表明了碳固定發(fā)生的組織部位，這些蛋白質(zhì)同時(shí)出現(xiàn)、協(xié)同配合、共同完成碳代謝過(guò)程［10，27，36］。

此外，碳酸酐酶是一種重要的適應(yīng)脅迫條件的光合碳代謝調(diào)節(jié)酶，主要參與C4途徑的碳同化過(guò)程，主要作用是通過(guò)催化CO2的可逆水合反應(yīng)來(lái)促進(jìn)CO2向RuBisCO擴(kuò)散，提高RuBisCO的羧化速率［37］。本研究中，碳酸酐酶(C19)暗處理后表達(dá)量先下調(diào)后顯著上調(diào)，推測(cè)這既提高光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能效率，也說(shuō)明木薯可能啟動(dòng)C4途徑的碳同化過(guò)程，而為滿足木薯生長(zhǎng)需要提供更多能量。

3．3 脯氨酸代謝相關(guān)蛋白質(zhì)

谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)是植物體內(nèi)氮元素代謝關(guān)鍵酶，它催化由氨基酸轉(zhuǎn)化的谷氨酸與NH4+同化成谷氨酰胺，起到轉(zhuǎn)氨作用，而給植物供給營(yíng)養(yǎng)，其表達(dá)受環(huán)境(光、氮、CO2)和發(fā)育因子的影響［38］。本研究中，GS(C20)在暗處理后表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。初步說(shuō)明木薯葉綠體中GS表達(dá)受光調(diào)控，與擬南芥和木薯葉片中的研究報(bào)道一致［10，39］，推測(cè)GS通過(guò)影響葉綠體中氮的積累，使葉綠素合成受阻，而影響光合速率。

3．4 脅迫防御相關(guān)蛋白質(zhì)

本研究中，筆者鑒定出3個(gè)參與調(diào)節(jié)氧化還原過(guò)程的蛋白質(zhì)，其中Fe-超氧化物歧化酶(C21)、過(guò)氧化物氧化還原酶(C22)和硫氧還蛋白(C23)在暗處理后表達(dá)量均上升，但幅度不一，前兩種酶是酶促防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，能夠清除植物體內(nèi)的過(guò)多的活性氧和自由基以提高植物的抗逆性;后一種酶是通過(guò)保護(hù)葉綠體的結(jié)構(gòu)來(lái)對(duì)抗暗處理下引起的氧化脅迫，說(shuō)明暗處理可能引起木薯細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)性氧化物水平升高，抗性蛋白表達(dá)量上升起到抵抗氧化壓力的保護(hù)作用，使細(xì)胞免于過(guò)早死亡［10，36，40］。

葉綠體是植物光合作用的場(chǎng)所，光合作用是木薯產(chǎn)量和品質(zhì)的基礎(chǔ)，深入研究木薯光合作用對(duì)于了解和發(fā)現(xiàn)木薯高光合效率具有重要意義。盡管木薯基因組測(cè)序已經(jīng)完成，但絕大多數(shù)基因的功能是未知的。本研究中，通過(guò)闡述木薯葉綠體在黑暗條件下的蛋白質(zhì)組變化，在蛋白質(zhì)水平上鑒定出部分蛋白質(zhì)的表達(dá)可能受光調(diào)控，為后續(xù)深入研究搭建了數(shù)據(jù)和技術(shù)平臺(tái)，但是由于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究是以基因組學(xué)產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，尤其是基因組序列，所以仍有許多差異蛋白未鑒定，這些蛋白中可能也存在著許多有價(jià)值的關(guān)鍵蛋白，需要在今后的研究中進(jìn)一步做功能鑒定分析。

致謝:仝征、莊盈婷、周承、常麗麗和王紅巖給予了實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)和幫助，謹(jǐn)致謝意!

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