雷 蕾，潘顯強(qiáng)，4，張 露*，黃少偉，趙 衡，易 敏，賴 猛

(1．江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江西 南昌 330045;2．華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，廣東 廣州 510642;3．廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642;4．南昌市林業(yè)局，江西 南昌 330000)

松脂主要由單萜、倍半萜烯、二萜組成，其生物合成是以類戊二烯(C5)為底物，經(jīng)由磷酸甲基赤蘚糖(methyl-erythritol 4-phosphate，MEP)途徑形成萜類化合物的各類前體，再在萜稀合成酶(terpene synthases，TPS)的參與下合成松脂［1］。TPS 基因有 6 大類(Tpsa、Tpsb、Tpsc、Tpsd、Tpse、Tpsf)，其中 Tpsd 是裸子植物特有的相對獨(dú)立的基因家族，Tps-d1、Tps-d2、Tps-d3分別是單萜合成酶、倍半萜稀合成酶和二萜合成酶，這3個(gè)亞家族的基因序列高度相關(guān)［2］。α-蒎烯(α-pinene)和β-蒎烯(β-pinene)是松脂中含量最多的兩種成分，與松樹抗蟲、抗機(jī)械創(chuàng)傷關(guān)系密切［3］。β-蒎烯因其在合成工業(yè)中步驟少的特點(diǎn)備受育種家的關(guān)注，有兩種同分異構(gòu)體:(+)β-蒎烯和(-)β-蒎烯，它們分別在兩種不同的TPS作用下合成，松脂中的β-蒎烯以左旋居多。

濕地松(Pinus elliottii)原產(chǎn)美國東南部潮濕地區(qū)，我國于20世紀(jì)30年代開始引種栽培。近10年來，隨著松脂產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，高產(chǎn)脂濕地松種子園紛紛建立，產(chǎn)脂性狀的研究也成為熱點(diǎn)［4］。濕地松產(chǎn)脂量高、松脂品質(zhì)極好，因其β-蒎烯含量高，成為最受關(guān)注的采脂樹種［5-6］。本研究同源克隆了濕地松的(-)β-蒎烯合成酶基因，分別命名為PeTPS-(+)Apin、PeTPS-(-)Apin和PeTPS-(-)BPin，分析了其序列同源性，并預(yù)測了其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，旨在為更深入的研究濕地松產(chǎn)脂性狀提供重要的候選基因。

1 材料與方法

1．1 材料來源與引物設(shè)計(jì)

濕地松嫩葉樣品于2013年3月采集自江西省吉安縣白云山林場，位于東經(jīng)26°51′，北緯115°11′，海拔90m，亞熱帶氣候，年均氣溫18．6℃，極端高溫38．3℃，極端低溫-4．4℃，年均降雨1 646mm，無霜期308 d。

下載GeneBank數(shù)據(jù)庫中已有的松屬物種(主要是火炬松、北美短葉松和北美扭葉松)的(-)-β-蒎烯合成酶((-)-beta-pinene synthase)的cDNA序列，與火炬松全基因組比對，在其上下游1 kb以內(nèi)設(shè)計(jì)巢式引物，引物序列見表1。

表1 用于同源克隆的引物序列Tab．1 Primer sequences used for homology cloning

1．2 基因組DNA的提取與PCR擴(kuò)增

采用CTAB+吸附柱法提取DNA，藥品配置及具體操作參照李義良［8］針對濕地松的CTAB快速提取法，沉淀DNA后，用CB3吸附柱(天根公司試劑盒)吸附，用TE洗脫，稀釋至50 ng/μL，4℃保存。

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系:1×PrimeSTAR buffer、0．2 mmol/L dNTPs、0．2 μmol/L primes、2 ng/μL DNA、0．02 U/μL PrimeSTAR HSDNA Ploymerase。第一輪擴(kuò)增(outer primes)用10 μL 體系，第二輪擴(kuò)增(inner primes)用50μL體系，產(chǎn)物直接測序。

PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5min，94℃預(yù)變性10 s，55～65℃退火10 s，72℃延伸45 s～4 min 30 s，72℃延伸7min，10℃保溫，循環(huán)34次。

1．3 主要試劑與儀器設(shè)備

主要試劑:PrimeSTAR HSDNA Ploymerase、dNTPMixture、DL5000 DNA Marker、DL10000 DNA Marker購自TAKARA公司，DNAsecure Plant Kit購自天根生化科技(北京)有限公司，CTAB、瓊脂糖、EDTA、Tris購自上海生物工程有限公司，引物合成及測序由上海生工完成。

儀器設(shè)備:MM301磨樣儀(Qiagen公司)、Thermo SCIENTIFIC NanoDrop 1000核酸分析儀、PTC-200 PCR擴(kuò)增儀、DYC Z-30電泳槽、DYY-12電泳儀、EPPENDORF CENTRIFUGE 5810R高速低溫離心機(jī)、Bio RAD Gel Doc XR凝膠圖像采集與分析系統(tǒng)、Grant XB70制冰機(jī)、H．H．S2電熱恒溫水浴鍋、New Brunswick Scientific 410超低溫冰箱。

1．4 數(shù)據(jù)分析

測序結(jié)果拼接完成后，用 BLAST 在線程序(http://blast．ncbi．nlm．nih．gov)同源比對，用 WEBGENE在線程序(http://www．itb．cnr．it/sun/webgene/)分析內(nèi)含子。用 ORF finder在線程序(http://www．ncbi．nlm．nih．gov/gorf/)翻譯成氨基酸序列。氨基酸的基本理化性質(zhì)用Expasy Protparam在線程序(http://web．expasy．org/cgi-bin/protparam/)預(yù)測。蛋白質(zhì)親/疏水性用 ProtScale 在線程序(http://www．expasy．org/cgi-bin/protscale．pl)預(yù)測。前導(dǎo)肽用 TargetP 1．1 Server在線程序(http://www．cbs．dtu．dk/services/TargetP/)預(yù)測。磷酸化位點(diǎn)用 NetPhos 2．0 Server在線程序(http://www．cbs．dtu．dk/services/NetPhos/)分析。蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域用 NCBI的 CDD 程序(http://www．ncbi．nlm．nih．gov/Structure/cdd/)預(yù)測。用PSIPRED軟件分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。用SWISS-MODEL軟件分析蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)功能性位點(diǎn)用ELM在線程序(http://elm．eu．org/)預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2．1 DNA提取與PCR擴(kuò)增

DNA提取效果較好，核酸檢測 OD260/280均在1．7～1．9，OD260/230均為2．0左右。PCR 擴(kuò)增效果較好，條帶清晰、單一。圖1為DNA及PCR產(chǎn)物的電泳圖。

2．2 序列同源性與進(jìn)化分析

序列分析結(jié)果顯示:PeTPS-(-)BPin基因全長3 574 bp，有9個(gè)外顯子10個(gè)內(nèi)含子，共編碼627個(gè)氨基酸。同源性分析結(jié)果表明:PeTPS-(-)BPin基因與其他松屬植物之間的序列同源性達(dá)90%～93%，氨基酸序列具有2個(gè)長的保守區(qū)(＞50a．a(chǎn)．)。與松科其他屬之間的同源性為89%，氨基酸序列具有5個(gè)短的保守區(qū)(＞15a．a(chǎn)．)。與裸子植物其他 TPS基因的同源性為73%～76%，氨基酸序列具有1～2個(gè)短的保守區(qū)(＞15a．a(chǎn)．)。

研究表明，各種TPS基因序列的外顯子和內(nèi)含子位置分布幾乎一致，其蛋白質(zhì)同源性較高，由一個(gè)共同的祖先進(jìn)化而來，參與初生代謝和次生代謝的TPS的分支，發(fā)生在被子植物與裸子植物分離之前［9］。裸子植物的TPS基因是TPS基因家族中較獨(dú)立的成員Tpsd，Tpsd又可以進(jìn)行亞分類:Tpsd1(單萜合成酶)、Tpsd2(倍半萜烯合成酶)、Tpsd3(二萜合成酶)［2］。本研究下載了NCBI中已發(fā)表的3種萜烯合成酶基因序列，與濕地松的序列比對，構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如下:被子植物和裸子植物的TPS基因被聚為兩大類，關(guān)系較遠(yuǎn)，兩大分支的置信度均為100，可靠性高(圖2);裸子植物的TPS分為3個(gè)亞支，分別對應(yīng)3種TPS基因，3大分支的置信度為98～100，可靠性較高;濕地松與火炬松、扭葉松、班克松等松屬物種親緣關(guān)系較近，聚為一類，而與松科的云杉屬(Picea)、黃杉屬(Pseudotsuga)距離逐漸疏遠(yuǎn)(圖3)，這與國外文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致［10-11］。

圖1 左:DNA電泳圖(DL10 000 Mark);右:PCR產(chǎn)物電泳圖(DL5 000 Mark)Fig．1 DNA electrophoresis figure(DL10 000 Mark)on left，PCR product electrophoretogram(DL5 000 Mark)on right

圖2 不同物種的TPS基因序列的進(jìn)化樹Fig．2 Phylogenetic tree of TPS gene in difference species

2．3 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測

PeTPS-(-)BPin的蛋白質(zhì)分子式為 C3197H4972N862O957S32，分子量為71．74 ku，等電點(diǎn)為5．73，含20種基本氨基酸，含量最高的是L(9．4%)和S(8．8%)，帶負(fù)電荷殘基89個(gè)(14．15%，包括Asp和Glu)，帶正電荷的殘基92個(gè)(14．63%，包括Arg、Lys和His)，水溶液吸光系數(shù)為91 970，不穩(wěn)定系數(shù)為43．38，脂肪系數(shù)為82．80，平均總親水性為-0．398，疏水氨基酸占 35．1%，親水氨基酸占 65．1%，定位在葉綠體，包含37個(gè)磷酸化位點(diǎn)(包括20個(gè)絲氨酸(Ser)，9個(gè)蘇氨酸(Thr)，8個(gè)酪氨酸(Tyr)。

圖3 裸子植物TPS基因序列的進(jìn)化樹Fig．3 Phylogenetic tree of TPS gene in gymnospermae

2．4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測

左旋β-蒎烯合成酶蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中含有4個(gè)不規(guī)則卷曲，24個(gè) α-螺旋。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)同源建模結(jié)果顯示:左旋β-蒎烯合成酶與紫杉二烯合成酶、冷杉二烯合成酶和某倍半萜烯合成酶有著相似的三級結(jié)構(gòu)，比對得分分別為 428、395、438。

保守結(jié)構(gòu)域分析表明，左旋β-蒎烯合成酶含有一個(gè)cd00684保守域，屬于類異戊二烯生物合成酶基因家族，主要參與次級代謝的生物合成途徑。根據(jù)已知該家族成員的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，可知萜烯合成酶定位在真核生物的細(xì)胞質(zhì)或葉綠體中，最多可以結(jié)合3個(gè)鎂/鉀離子，催化位點(diǎn)由兩個(gè)富含天冬氨酸(Asp-rich)的區(qū)域和一個(gè)大的反向α-螺旋構(gòu)成的中央腔組成，該位點(diǎn)高度保守。其蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)及其保守結(jié)構(gòu)域如圖4。

圖4 蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域Fig．4 Protein tertiary structure and CDD predicted for candidate genes

2．5 蛋白質(zhì)功能預(yù)測

ELM工具和NCBI的CDD工具相結(jié)合，共搜索出7個(gè)可能的功能域(圖5)。第1個(gè)功能域?yàn)镃LV_NDR_NDR_1，是一個(gè)NDR切割位點(diǎn)(NDR cleavage site)，由兩個(gè)精氨酸組成，出現(xiàn)在第68、69位氨基酸。第2個(gè)功能域?yàn)長IG_FHA_1，是一個(gè)FHA磷酸肽配體(FHA phosphopeptide ligands)，由7個(gè)氨基酸組成，出現(xiàn)在第611～617位氨基酸。第3個(gè)功能域?yàn)長IG_FHA_2，出現(xiàn)在第622～627位氨基酸。第4個(gè)功能域?yàn)長IG_PDZ_Class_2，是一個(gè)PDZ配體(PDZ ligands)，由6個(gè)氨基酸組成，出現(xiàn)在第622～627位氨基酸。第5個(gè)功能域?yàn)長IG_SH2_PTP2、LIG_SH2_SRC、LIG_SH2_STAT5，是一個(gè)SH2配體(SH2 ligand)，由4個(gè)氨基酸組成，出現(xiàn)在第283～286位氨基酸。第6個(gè)功能域?yàn)镸OD_GSK3_1，是一個(gè)GSK3磷酸化位點(diǎn)(GSK3 phosphorylation site)，由8個(gè)氨基酸組成，出現(xiàn)在第293～300和606～613位氨基酸。第7個(gè)功能域?yàn)镸OD_PKA_2，是一個(gè)PKA磷酸化位點(diǎn)(PKA Phosphorylation site)，由7個(gè)氨基酸組成，出現(xiàn)在第43～49位氨基酸。

圖5 蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig．5 Protein function structure domain predicted

3 結(jié)論與討論

3．1 濕地松PeTPS-(-)BPin基因的結(jié)構(gòu)和功能分析

萜烯合成酶(TPS)一般由550～850個(gè)氨基酸組成，絲氨酸和蘇氨酸含量高，酸性氨基酸含量低，相對分子質(zhì)量為50～100 ku［12］。TPS在三維結(jié)構(gòu)上有很高的相似度，由α-螺旋、連接環(huán)、拐角等結(jié)構(gòu)組成。酶的活性中心是6個(gè)α-螺旋組成的C-末端疏水區(qū)，N-末端沒有特殊的功能元件［13］。這些研究與本研究結(jié)果相符。

國外報(bào)道，所有單萜合成酶序列靠前段都存在連續(xù)的2個(gè)精氨酸，功能未知，可能與GPP異構(gòu)化有關(guān)［9］。濕地松PeTPS-(-)BPin基因的在第68、69位出現(xiàn)了這個(gè)保守結(jié)構(gòu)，并在該區(qū)搜索到一個(gè)NDR切割位點(diǎn)，該位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)于小鼠大腦和睪丸的金屬內(nèi)肽酶(metalloendopeptidase)，它能夠斷裂Arg的N末端殘基［14］。因此猜測，裸子植物單萜合成酶的RR保守結(jié)構(gòu)能夠在第二個(gè)R的N末端斷裂并與底物結(jié)合，從而參與底物異構(gòu)化。

幾乎所有的TPS都含有一個(gè)Asp富集基序(DDxxD)，這個(gè)基序被認(rèn)為起到結(jié)合金屬離子的作用，它定位在活性位點(diǎn)的入口處，若基序發(fā)生突變則導(dǎo)致酶催化活性下降，因此推測是二磷酸脂的結(jié)合部位［12］，本研究在第380～384位出現(xiàn)了這個(gè)保守域，但未能在該區(qū)搜到相關(guān)的功能位點(diǎn)。本研究預(yù)測的兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)分別位于第302位和623位，可見，基于生物信息學(xué)的功能預(yù)測只能作為后期實(shí)驗(yàn)的理論依據(jù)，并不是完全可靠，要更準(zhǔn)確的了解TPS的功能還需更多的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。

3．2 火炬松全基因組序列的公開可直接用于其他松屬植物

對有親緣關(guān)系的松屬樹種來說，不僅是葉綠體DNA(cpDNA)序列，核DNA(nDNA)序列的保守程度也很高，其基因的同源克隆和比較作圖比被子植物容易得多［15］?；鹁嫠傻腅STP標(biāo)記已被用于濕地松［16］、海岸松［17］、歐洲赤松［18］，甚至被用于黃杉屬的花旗松［19］。本研究比較了不同松屬植物的 3 個(gè)TPS基因cDNA序列，相似度極高，同源性達(dá)到90%以上。濕地松TPS基因與松科其他屬之間的同源性在80%以上。裸子植物不同TPS基因之間的同源性在70%以上。將3個(gè)基因與火炬松全基因組比對，并在濕地松基因組上擴(kuò)增成功，再次證明松屬植物基因序列的高保守性，火炬松全基因序列的公開給其他研究相對滯后的松樹提供了極為有利的條件。

對于基因的同源克隆來說，最常用的方法是利用植物特定時(shí)空的材料提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用同源引物(有時(shí)需設(shè)計(jì)簡并引物)擴(kuò)增得到同源的cDNA序列。本研究直接在火炬松基因組上設(shè)計(jì)巣式引物，直接用于濕地松的基因組，并獲得成功。生物信息學(xué)上的驗(yàn)證思路類似于人類基因組的未知基因的發(fā)掘［20］，對拼接結(jié)果進(jìn)行內(nèi)含子分析，去除內(nèi)含子翻譯成氨基酸序列，進(jìn)行一級、二級、三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，通過同源建模找到功能結(jié)構(gòu)域，預(yù)測其蛋白質(zhì)功能。結(jié)果證明所克隆的基因正是目的基因，這種方法只需提取基因組DNA，大大簡化了克隆的過程。

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