王 睿，王 嵐，黎明新，朱明艷，劉 新

1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 沈陽(yáng)110024；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110034

血清PARP-1蛋白高表達(dá)在胃癌中的臨床意義

王 睿1，王 嵐2，黎明新1，朱明艷1，劉 新2

1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 沈陽(yáng)110024；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110034

背景與目的：PARP-1與惡性腫瘤密切相關(guān)。該研究旨在考察血清PARP-1蛋白水平在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的臨床意義。方法：收集145例胃癌患者血樣以及112例健康體檢者血清樣本，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)血清中幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)特異性IgA和PARP-1蛋白水平，并分析血清PARP-1蛋白水平與胃癌臨床特征的相關(guān)性。結(jié)果：與健康人相比，胃癌患者血清PARP-1蛋白顯著增高［(407±139) pg/mLvs(258±120) pg/mL，P=0.014］；Hp陽(yáng)性胃癌患者PARP-1的表達(dá)水平顯著高于Hp陰性患者(P＜0.001)；血清PARP-1蛋白水平與胃癌患者的胃癌家族史(P=0.033)和飲酒史(P=0.015)有著顯著正相關(guān)性；與血清PARP-1蛋白陰性的患者相比，PARP-1蛋白陽(yáng)性的胃癌患者的總體生存期顯著縮短(P=0.011)；多變量COX回歸分析未發(fā)現(xiàn)血清PARP-1蛋白水平為影響胃癌患者總體生存期的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。結(jié)論：血清PARP-1蛋白高表達(dá)可能參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展，抑制PARP-1有可能成為治療胃癌的潛在新靶點(diǎn)。

胃癌；PARP-1；血清；幽門螺桿菌

胃癌是嚴(yán)重影響人們健康的常見惡性腫瘤之一。雖然近年來(lái)胃癌的治療方法取得了較大發(fā)展，但胃癌在我國(guó)仍然屬于常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死率均居于各種惡性腫瘤前列。PARP-1［poly(ADP-ribose)polymerases 1］是催化聚ADP 核糖化的重要功能酶，在DNA損傷修復(fù)、基因組穩(wěn)定性、細(xì)胞周期調(diào)控、能量代謝、凋亡和腫瘤發(fā)生的過(guò)程中均發(fā)揮重要作用［1］。PARP-1與多種惡性腫瘤密切相關(guān)，在胃癌領(lǐng)域，目前多見PARP-1基因單核酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與胃癌的相關(guān)性研究［2-3］，PARP-1蛋白水平與胃癌的相關(guān)性研究國(guó)內(nèi)外均鮮見報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)胃癌患者及健康體檢者的血清標(biāo)本中PARP-1蛋白含量，分析PARP-1水平與胃癌的發(fā)病以及相關(guān)臨床特征的相關(guān)性，探討血清PARP-1蛋白水平在胃癌中的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 病例血清標(biāo)本

本課題組集中收集了2008年1月—2009年12月在沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院檢驗(yàn)科送檢的血液樣本，包括確診為胃癌的患者殘留化驗(yàn)血樣145例，以及健康體檢者殘留的化驗(yàn)血樣112例。對(duì)于殘留的血樣標(biāo)本，每例收集1 mL，室溫靜置30 min后離心收集血清，血清樣本于-80 ℃深度冷凍冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)血清中幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)特異性IgA水平

取出－80 ℃保存的血清樣本，解凍后應(yīng)用ELISA檢測(cè)試劑盒［KA0964，中國(guó)臺(tái)北亞諾法生技股份有限公司］檢測(cè)血清中人Hp特異性IgA水平，具體操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品所作的質(zhì)控曲線相關(guān)系數(shù)R2為0.999 3。

1.3 ELISA法檢測(cè)血清中PARP-1蛋白水平

血清樣本解凍后應(yīng)用ELISA檢測(cè)試劑盒［ABIN367354，聯(lián)世生物科技(上海)有限公司］檢測(cè)血清中人PARP-1蛋白水平，具體操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品所作的質(zhì)控曲線相關(guān)系數(shù)R2為0.999 0。

1.4 ELISA檢測(cè)結(jié)果的分層

對(duì)于通過(guò)ELISA法測(cè)得的Hp特異性IgA水平和PARP-1蛋白水平，采用ROC曲線分析法，在檢測(cè)值的診斷靈敏度與特異度之和最大時(shí)，判定上述兩個(gè)指標(biāo)在診斷胃癌時(shí)的分界值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果數(shù)據(jù)分析均采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行操作。ELISA法檢測(cè)結(jié)果以表示，確定計(jì)量資料診斷二分類資料的分界值時(shí)采用ROC曲線分析法，計(jì)量資料的組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進(jìn)行，計(jì)數(shù)資料之間的相關(guān)性分析采用Pearson卡方檢驗(yàn)(χ2test)、Fisher確切概率法或Pearon相關(guān)分析進(jìn)行，采用logrank檢驗(yàn)繪制Kaplan-Meier曲線，采用Cox回歸進(jìn)行多變量生存分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者病例臨床特征及預(yù)后資料

145例胃癌患者均為未經(jīng)放化療治療的首診患者。其中男性89例，女性56例，年齡22～74歲，有胃癌家族史(患者所在家族有多人患有胃癌)者32例，有吸煙史(連續(xù)或累積吸煙大于等于6個(gè)月)者76例，有飲酒史(每日酒精攝入量大于125 mL，持續(xù)時(shí)間大于等于6個(gè)月)者62例。根據(jù)胃癌Borrmann分型：Ⅰ型患者12例，Ⅱ型患者20例，Ⅲ型患者98例，Ⅳ型患者15例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者89例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者56例；TNM分期Ⅰ期患者23例，Ⅱ期患者35例，Ⅲ期患者53例，Ⅳ期患者34例。同時(shí)，我們還收集了患者通過(guò)13C尿素呼氣試驗(yàn)診斷的Hp感染情況，其中Hp陽(yáng)性88例，Hp陰性57例。112例健康體檢者中，男性70例，女性42例，年齡25～75歲。

145例胃癌患者給與臨床治療后，課題組定期隨訪患者預(yù)后情況，隨訪期6～68個(gè)月，定義患者確診后至患者死亡或隨訪終點(diǎn)的時(shí)間為總生存期(overall survival，OS)?；颊咧?1例因癌癥死亡，平均OS為(47.9±18.5)個(gè)月。

2.2 胃癌患者血清中Hp特異性IgA和PARP-1蛋白水平

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，145例胃癌患者血清中Hp特異性IgA含量為0.44±0.13(D值)，112例健康體檢者血清中Hp特異性IgA含量為0.28±0.11(D值)。與健康人相比，胃癌患者血清中Hp特異性IgA含量顯著增高(P=0.008，圖1A)。ROC曲線分析顯示，Hp特異性IgA含量大于等于0.37時(shí)有患胃癌的趨勢(shì)，故定義大于等于0.37為Hp特異性IgA陽(yáng)性，小于0.37為Hp特異性IgA陰性(圖1B)。按照該分層標(biāo)準(zhǔn)，胃癌患者中Hp特異性IgA陽(yáng)性者92例，陰性者53例，與應(yīng)用13C尿素呼氣試驗(yàn)法診斷的Hp感染情況除僅有10例結(jié)果相悖外，有135例完全吻合(r=0.855，P＜0.001)，其中85例為Hp陽(yáng)性，50例為Hp陰性。

145例胃癌患者血清中PARP-1蛋白含量為(407±139) pg/mL，112例健康體檢者血清中PARP-1蛋白含量為(258±120) pg/mL，與健康人相比，胃癌患者血清中PARP-1蛋白含量顯著增高(P=0.014，圖1C)。ROC曲線分析顯示，PARP-1蛋白含量大于等于366 pg/mL時(shí)有患胃癌的趨勢(shì)(圖1D)，故定義大于等于366 pg/mL為PARP-1蛋白陽(yáng)性，小于366 pg/mL為PARP-1蛋白陰性。按照該分層標(biāo)準(zhǔn)，胃癌患者中PARP-1蛋白陽(yáng)性者108例，陰性者37例。

按照ELISA法和尿素呼氣試驗(yàn)法均診斷為Hp陽(yáng)性的85例胃癌患者中，PARP-1蛋白陽(yáng)性者74例(87.1%)，Hp陰性的50例患者中PARP-1蛋白陽(yáng)性者28例(56.0%)，可見Hp陽(yáng)性患者PARP-1的表達(dá)水平顯著高于Hp陰性者(P＜0.001)。

2.3 胃癌患者血清PARP-1蛋白水平與臨床特征的相關(guān)性

應(yīng)用Pearson卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法分析胃癌患者血清PARP-1蛋白水平與臨床特征的相關(guān)性(表1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在有胃癌家族史(P=0.033)和飲酒史(P=0.015)的胃癌患者中，PARP-1蛋白水平顯著增高。PARP-1蛋白水平在不同Borrmann分型的胃癌間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。而在具有不同年齡段、性別、吸煙史的胃癌患者中，PARP-1蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.4 胃癌患者血清PARP-1蛋白水平對(duì)患者生存期的影響

圖 1 ELISA法檢測(cè)血清中Hp特異性IgA和PARP-1蛋白水平Fig. 1 The Hp specific IgA level and PARP-1 protein level detected by ELISA method in the serum samples

采用log-rank檢驗(yàn)繪制Kaplan-Meier曲線分析血清PARP-1蛋白水平對(duì)胃癌生存期的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與血清PARP-1蛋白陰性者相比，PARP-1蛋白陽(yáng)性的胃癌患者具有較短的OS(P=0.011)。單變量Cox回歸進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)(表2)，胃癌家族史、吸煙史、飲酒史、Borrmann分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、Hp感染(尿素呼氣試驗(yàn)法和ELISA法)、血清PARP-1蛋白均是影響患者OS的危險(xiǎn)因素；進(jìn)一步納入此8項(xiàng)參數(shù)，以年齡進(jìn)行校正，進(jìn)行多變量Cox回歸生存分析發(fā)現(xiàn)(表2)，胃癌家族史(P=0.030)、Borrmann分型(P=0.025)、TNM分期(P=0.044)、Hp感染(尿素呼氣試驗(yàn)法，P=0.027；ELISA法，P=0.042)為影響患者OS的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。

表 1 血清PARP-1蛋白水平與胃癌患者臨床特征的相關(guān)性Tab. 1 The association of serum protein level with clinical pathological characters in gastric cancer patients

表 2 COX回歸分析臨床參數(shù)與胃癌患者OS的相關(guān)性Tab. 2 Cox regression analysis of clinical data correlated with OS in gastric cancer

圖 3 PARP-1蛋白表達(dá)水平對(duì)胃癌患者OS的影響Fig. 3 The inf l uence of PARP-1 protein level on OS in gastric cancer

3 討 論

本研究首次檢測(cè)了血清PARP-1蛋白水平對(duì)于胃癌的臨床意義。我們通過(guò)ELISA法檢測(cè)并比較了健康人群和胃癌患者的血清PARP-1蛋白水平，發(fā)現(xiàn)胃癌患者的血清PARP-1蛋白水平顯著增高。Hp是公認(rèn)的胃癌發(fā)病相關(guān)因子之一，因此我們收集了患者的Hp診斷結(jié)果(13C尿素呼氣試驗(yàn))。同時(shí)我們進(jìn)一步應(yīng)用ELISA法檢測(cè)了血清中Hp特異性IgA含量，以判斷患者Hp感染情況。通過(guò)尿素呼氣試驗(yàn)和ELISA法聯(lián)合對(duì)比，我們選取了兩種方法診斷結(jié)果一致的135例患者，分析PARP-1與Hp感染的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hp陽(yáng)性患者PARP-1的表達(dá)水平顯著高于Hp陰性患者。Nossa等［4-5］的研究發(fā)現(xiàn)Hp感染可激活PARP-1活性，上調(diào)其表達(dá)水平。我們的結(jié)果與之一致，這說(shuō)明PARP-1可能在與Hp感染密切相關(guān)的胃癌發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮一定的作用。

本研究進(jìn)一步分析了血清PARP-1蛋白水平與胃癌患者的臨床特征及生存期的相關(guān)性。我們發(fā)現(xiàn)，有胃癌家族史和飲酒史的胃癌患者的血清PARP-1蛋白水平均顯著增高。這可能是因?yàn)橛屑易迨返幕颊唧w內(nèi)PARP-1蛋白調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)異常，導(dǎo)致血清PARP-1蛋白水平升高；而長(zhǎng)期飲酒者，酒精造成胃黏膜等的刺激損傷，可能會(huì)激發(fā)參與DNA修復(fù)、維持細(xì)胞存活的PARP-1蛋白表達(dá)上調(diào)。并且，血清PARP-1蛋白水平與主要依據(jù)組織學(xué)浸潤(rùn)深度而劃分的胃癌Borrmann分型密切相關(guān)，浸潤(rùn)較深的Ⅲ、Ⅳ型有較高的血清PARP-1蛋白水平；另外，血清PARP-1蛋白陽(yáng)性的胃癌患者DFS及OS顯著縮短。可見PARP-1與胃癌的發(fā)病關(guān)系密切，其陽(yáng)性表達(dá)是造成患者生存期縮短的危險(xiǎn)因素。但是多變量Cox回歸進(jìn)行生存分析，未發(fā)現(xiàn)PARP-1是影響DFS或OS的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，這可能是由于PARP-1與Hp感染、胃癌家族史和飲酒史等顯著相關(guān)的原因。

PARP-1通過(guò)對(duì)DNA損傷進(jìn)行修復(fù)，進(jìn)而參與細(xì)胞的多種生物學(xué)行為，其高表達(dá)在多種疾病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，因而抑制PARP-1功能活性成為治療許多疾病的新靶點(diǎn)［6-7］。在胃腸道疾病領(lǐng)域，Sánchez-Fidalgo等［8］在用化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)結(jié)腸潰瘍大鼠模型研究的結(jié)果顯示，應(yīng)用PARP-1抑制劑可以顯著下調(diào)損傷組織中過(guò)氧化物酶活性和前列腺素E2的表達(dá)水平，可能有益于潰瘍的治療；Le等［9］發(fā)現(xiàn)PARP-1抑制劑可以提高順鉑對(duì)人胃癌細(xì)胞的毒性；Liu等［10］研究發(fā)現(xiàn)木鱉子提取物可通過(guò)下調(diào)PARP-1表達(dá)，顯著抑制人胃癌細(xì)胞的存活率。因此抑制PARP-1有可能成為胃癌治療的潛在靶點(diǎn)。

我們的研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者存在血清PARP-1蛋白高表達(dá)，并且與患者的Hp感染、胃癌家族史和飲酒史等臨床特征顯著相關(guān)，與患者無(wú)潰瘍生存期縮短顯著相關(guān)，這說(shuō)明PARP-1可能參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，抑制PARP-1有可能成為治療胃癌的新方向。

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The clinical significance of serum PARP-1 protein high expression in gastric cancer

WANG Rui1, WANG Lan2, LI Mingxin1, ZHU Mingyan1, LIU Xin2(1. Department of Laboratory, the Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College, Shenyang 110024, Liaoning Province, China;2. Department of Pathogenic Biology, Shenyang Medical College, Shenyang 110034, Liaoning Province,China)

LIU Xin E-mail: sy_liuxin2000@126.com

Background and purpose: PARP-1 is closely related to malignant tumors. This study aimed to explore the clinical significance of serum level of PARP-1 protein in onset and progression of gastric cancer. Methods: The serum samples from 145 patients with gastric cancer and 112 healthy check-up cases were collected. The serumHPspecificity IgA and PARP-1 protein levels were detected using enzyme-linked immunosorbent assay method. The correlation of serum PARP-1 protein levels with clinical characteristics of gastric cancer was analyzed. Results: Compared with healthy people, serum PARP-1 protein levels were significantly higher in gastric cancer patients [(407±139) pg/mLvs(258±120)pg/mL,P=0.014). Serum PARP-1 protein levels were significantly higher inHp(+) gastric cancer patients than those in patients withHp(-) (P＜0.001). Serum PARP-1 protein levels were positively correlated with family gastric cancer history(P=0.033) and alcohol intake history (P=0.015) in gastric cancer patients. Compared with serum protein PARP-1 negative patients, PARP-1 protein positive patients had a significantly shorter cancer-free survival (P=0.011). However serum PARP-1 protein level was not found to be an independent risk factor for the overall survival of gastric cancer patients using multivariate COX regression. Conclusion: High expression of serum PARP-1 protein may be involved in the pathogenesis and progression of gastric cancer. Inhibition of PARP-1 may be potential new target for the treatment of gastric cancer.

Gastric cancer; PARP-1; Serum;Helicobacter pylori

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.12.009

R735.2

A

1007-3639(2015)12-0972-06

劉 新 E-mail:sy_liuxin2000@126.com

2015-05-20

2015-11-10）