Let-7a/g/i在骨肉瘤細(xì)胞中靶向調(diào)控Aurora-B表達(dá)

周云飛，劉家明，陳宣銀，朱糧博，龍新華，周 揚(yáng)，張志宏，劉志禮南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，江西 南昌 330006

背景與目的：微小RNA(microRNA，miRNA)是一類具有重要調(diào)控作用的非編碼小分子RNA，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。該研究探討可能在骨肉瘤細(xì)胞中調(diào)控Aurora-B激酶表達(dá)的miRNA，并為進(jìn)一步探討Aurora-B在骨肉瘤細(xì)胞惡性表型中的作用及調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法：采用生物信息學(xué)預(yù)測軟件(http://www.targetscan.org)以及熒光海腎素實驗探討可能靶向調(diào)控Aurora-B的miRNA；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)和蛋白[質(zhì)]印跡法(Western blot)進(jìn)一步驗證骨肉瘤細(xì)胞系U2-OS和HOS細(xì)胞中調(diào)控Aurora-B表達(dá)的miRNA。結(jié)果：生物信息學(xué)預(yù)測和熒光海腎素實驗顯示，Aurora-B基因可能是let-7a/b/c/d/e/f/g/i的靶基因；RTFQ-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，上調(diào)let-7a/g/ i的U2-OS和HOS細(xì)胞中Aurora-B mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著低于陰性對照組(陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞)；但是上調(diào)let-7b/c/d/e/f的U2-OS和HOS細(xì)胞中Aurora-B mRNA和蛋白的表達(dá)水平和陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：Let-7a/g/i可能負(fù)向調(diào)控Aurora-B在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)。

骨肉瘤；Let-7；Aurora-B

本研究的前期研究發(fā)現(xiàn)Aurora-B在骨肉瘤細(xì)胞中過度表達(dá)并且與肺部轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，抑制Aurora-B能顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞遷移侵襲［1-3］。但是，Aurora-B在骨肉瘤中過度表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測、熒光海腎素實驗、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)和蛋白[質(zhì)]印跡法(Western blot)檢測Let-7a/g/i在骨肉瘤細(xì)胞中靶向調(diào)控Aurora-B基因表達(dá)，為進(jìn)一步研究Aurora-B在骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株

人源骨肉瘤細(xì)胞系U2-OS和HOS細(xì)胞株，購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基和DMEN/F12 1∶1培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，胎牛血清、cDNA第一鏈合成試劑盒及RTFQ-PCR試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，Transwell侵襲小室購自美國Corning公司，基質(zhì)膠購自美國BD公司，Western blot上樣蛋白Marker和PVDF膜購自美國Formentas公司，一抗(兔抗人Aurora-B IgG，1∶5 000，鼠抗人β-actin IgG，1∶5 000)購自美國Santa Cruz公司，二抗(羊抗兔IgG和兔抗鼠IgG，1∶5 000)購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 生物信息學(xué)預(yù)測

采用靶基因在線預(yù)測軟件(http://www. targetscan.org)對指定基因Aurora-B進(jìn)行預(yù)測(表1)。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

U2-OS和HOS細(xì)胞分別用含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基和DMEM/F12 1∶1培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

表1 Aurora-B基因序列及突變后序列Tab. 1 Nucleotide sequences of Aurora-B gene before and after mutation

1.3.3 轉(zhuǎn)染

按照LipofectamineTM2000說明書提供的步驟進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前1 d以(3×105～4×105)個/mL細(xì)胞懸液接種6孔板，每孔總體積為2 mL。當(dāng)細(xì)胞達(dá)50%融合時轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染前用無抗菌藥物、不含血清的OPTI-MEM(購自美國Gibco公司)培養(yǎng)基培養(yǎng)3～4 h。取10 μL Mimics、5 μL LipofectamineTM2000(6孔板每孔的量)，用OPTIMEM培養(yǎng)基分別稀釋至250 μL，后者室溫溫育5 min，然后將兩者混合均勻，室溫溫育20 min，然后逐滴加入培養(yǎng)板孔中，邊滴加邊“十”字晃動培養(yǎng)板，混合均勻。常規(guī)培養(yǎng)48 h后做表達(dá)檢測(轉(zhuǎn)染后6 h換含抗菌藥物和血清的培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng))。

1.3.4 熒光海腎素實驗

轉(zhuǎn)染48 h后，將6孔板從培養(yǎng)箱中取出，小心吸去細(xì)胞培養(yǎng)上清液，PBS洗滌2次，將細(xì)胞用細(xì)胞裂解液裂解后，取5 μL細(xì)胞裂解液與螢火蟲熒光素酶緩沖液及底物5 μL(按Promega雙熒光報告系統(tǒng)測量試劑盒說明書操作)混勻測量熒光強(qiáng)度，然后加入熒光海腎素酶反應(yīng)緩沖液及腔腸素底物5 μL，混勻再次測得熒光海腎素酶活性。將每個樣品按照螢火蟲熒光素酶活性進(jìn)行均一化處理，比較熒光海腎素酶活性。

1.3.5 RTFQ-PCR檢測

轉(zhuǎn)染48 h 后收集各組細(xì)胞，用TRIzol法分別提取總RNA。將提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：16 ℃變性30 min，42 ℃延伸30 min，85 ℃終延伸10 min。結(jié)束后立即將cDNA產(chǎn)物取出，快速置于冰上冷卻，后續(xù)所有步驟均在冰上進(jìn)行。將cDNA產(chǎn)物稀釋3～4倍，然后混勻并從中吸取2 μL(20 μL體系)做為模板，剩余產(chǎn)物存放于-20 ℃。RTFQ-PCR反應(yīng)在ABI7500 RTFQPCR反應(yīng)儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性12 s，62 ℃延伸1 min，共40個循環(huán)；95 ℃終延伸15 s。在進(jìn)行RTFQ-PCR定量時制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和融解曲線等。不同時間重復(fù)6次實驗。

1.3.6 Western blot檢測蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染后48 h收集各組細(xì)胞，RIPA裂解，提取總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗室溫溫育2 h，TBST洗膜3次，加入二抗室溫溫育1 h，TBST洗膜3次，4℃過夜，ECL顯影觀察轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對靶基因蛋白的影響。不同時間重復(fù)6次實驗。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

表2 引物信息Tab. 2 Primer information

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)預(yù)測

為探討可能調(diào)控Aurora-B基因的miRNA分子，本研究采用靶基因在線預(yù)測軟件(http:// www.targetscan.org)對指定基因Aurora-B進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果顯示，Aurora-B可能是let-7a/b/c/d/e/f/ g/i、miR-98、miR-4458以及miR-4500的靶基因(圖1)。

2.2 Aurora-B基因可能是Let-7家族成員Let-7a/b/c/d/e/f/g/i的靶基因

熒光海腎素實驗對let-7家族進(jìn)行預(yù)測分析結(jié)果顯示，let-7a/b/c/d/e/f/g/i突變型中的熒光海腎素酶活性相對于野生型顯著增高(圖2)。

2.3 let-7a/g/i負(fù)向調(diào)控Aurora-B基因在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)

為驗證let-7a/b/c/d/e/f/g/i是否負(fù)向調(diào)控Aurora-B基因在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)，我們分別采用let-7a/b/c/d/e/f/g/i mimics轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞系U2-OS和HOS細(xì)胞，RTFQ-PCR檢測細(xì)胞中l(wèi)et-7a/b/c/d/e/f/g/i及Aurora-B mRNA的表達(dá)；Western blot檢測Aurora-B相關(guān)蛋白的表達(dá)。與陰性對照組相比，let-7a/g/i表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞中Aurora-B mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低；結(jié)果顯示，在骨肉瘤細(xì)胞中，let-7a/g/i表達(dá)上調(diào)可以抑制Aurora-B的表達(dá)(圖3～5)。

圖1 靶基因在線預(yù)測結(jié)果(http://www.targetscan.org)Fig. 1 The result of the bioinformatics prediction (http://www.targetscan.org)

圖2 熒光海腎素實驗結(jié)果顯示Aurora-B可能是let-7a/b/c/d/e/f/g/i的靶基因Fig. 2 The result of Luciferase assays showed that Aurora-B may be the target gene of let-7a/b/c/d/e/f/g/i

圖3 RTFQ-PCR檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染mimics細(xì)胞中l(wèi)et-7a/b/c/d/e/f/g/i的表達(dá)量顯著高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞Fig. 3 The result of RTFQ-PCR showed that the expression level of let-7a/b/c/d/e/f/g/i in U2-OS and HOS cells transfected with mimics was significantly higher compared to the control group

圖4 上調(diào)let-7a/b/c/d/e/f/g/i后U2-OS和HOS細(xì)胞中Aurora-B mRNA水平Fig. 4 The relative Aurora-B mRNA level in let-7a/b/c/d/e/f/g/i up-regulated U2-OS and HOS cells

圖5 Western blot檢測let-7a/g/i表達(dá)上調(diào)后Aurora-B蛋白在骨肉瘤細(xì)胞系U2-OS及HOS中的表達(dá)水平Fig. 5 The expression of Aurora-B in let-7a/g/i up-regulated U2-OS and HOS cells by Western blot

3 討 論

骨肉瘤是好發(fā)于兒童和青少年的一種惡性骨腫瘤，大約占惡性骨腫瘤的35%［4］。隨著新輔助化療藥物的出現(xiàn)，骨肉瘤患者生存時間顯著延長，但是近幾十年來全球骨肉瘤的5年總生存率仍然徘徊不前［5］，其根本原因在于骨肉瘤患者在臨床確診時，80%的患者已經(jīng)發(fā)生肺轉(zhuǎn)移［6］。而肺轉(zhuǎn)移是骨肉瘤患者最主要的死亡原因。因此，深入研究骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制對提高骨肉瘤轉(zhuǎn)移的療效具有特殊意義。

有研究［7-8］表明，Aurora激酶家族成員參與細(xì)胞有絲分裂中的多個過程，包括著絲粒的復(fù)制、雙極紡錘體的形成等，其家族成員中的Aurora-B激酶位于染色體17p13.1，是一類負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞有絲分裂的絲氨酸/蘇氨酸激酶，它在有絲分裂的過程中起著調(diào)節(jié)染色體濃縮、雙極定向和分離、調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)分裂的作用。Aurora-B的過表達(dá)會在有絲分裂的過程中產(chǎn)生多處缺陷，包括失去著絲點附著微管和未經(jīng)過分裂后期及細(xì)胞質(zhì)分裂就完成有絲分裂、細(xì)胞染色體數(shù)目加倍、再經(jīng)過多輪復(fù)制染色體發(fā)生隨機(jī)丟失和產(chǎn)生非整倍染色體、進(jìn)而導(dǎo)致癌變的可能等。由于Aurora-B激酶的生物學(xué)功能注定了其原癌基因的角色，故已引起研究者的重視。Aurora-B在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，如肝癌［9］、多發(fā)性骨髓瘤［10］及肺癌［11-12］等，這都意味著Aurora-B可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系，被認(rèn)為扮演著原癌基因的角色［13］。本研究的前期研究發(fā)現(xiàn)，Aurora-B在骨肉瘤組織中過度表達(dá)，并且可能與肺部轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而抑制Aurora-B在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制增殖及遷移、侵襲［14］。

近年microRNA的發(fā)現(xiàn)為研究腫瘤轉(zhuǎn)移的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了新的視角。在真核生物中，除了反義RNA在翻譯水平的調(diào)節(jié)作用以及RNA干擾(RNA interference，RNAi)機(jī)制在轉(zhuǎn)錄后水平通過降解特異mRNA阻遏基因表達(dá)外，microRNA在基因調(diào)控中同樣也起著重要作用。microRNA具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、死亡(主要是凋亡)、發(fā)育和代謝等功能。這些生物學(xué)效應(yīng)是通過調(diào)控信號分子(如細(xì)胞因子、生長因子及轉(zhuǎn)錄因子等)的表達(dá)而實現(xiàn)。近年來，大量研究證實，microRNA不僅參與腫瘤的發(fā)生、增殖及凋亡，并且對腫瘤的轉(zhuǎn)移具有調(diào)節(jié)作用［15-17］。至今為止，已發(fā)現(xiàn)超過1 000種人類microRNA，據(jù)推測它們可能調(diào)控著人類基因組內(nèi)1/3以上基因的表達(dá)，尋找microRNA分子及其靶基因的研究已成為基因調(diào)控研究領(lǐng)域的重要分支和熱點。近期的研究顯示，let-7的表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［17-18］。本研究采用生物信息學(xué)預(yù)測及熒光海腎素實驗分析發(fā)現(xiàn)，Aurora-B基因很可能是let-7a/b/c/d/e/f/g/i的靶基因。為探討在骨肉瘤細(xì)胞中Aurora-B基因是否受let-7a/b/c/d/e/f/g/i的調(diào)控，本研究采用let-7家族成員mimics轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞系U2-OS細(xì)胞和HOS細(xì)胞，經(jīng)RTFQ-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，Aurora-B在let-7a/g/i表達(dá)上調(diào)細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著低于其在陰性對照細(xì)胞中的表達(dá)，但是，在let-7d/b/c/e表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞中Aurora-B表達(dá)水平無明顯下調(diào)(與陰性對照細(xì)胞組比)，這提示let-7a/g/i能負(fù)向調(diào)控Aurora-B在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)。

總之，本研究結(jié)果提示let-7a/g/i可以負(fù)向調(diào)控Aurora-B在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)，這為進(jìn)一步研究Aurora-B在骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及調(diào)控機(jī)制提供了幫助。

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Let-7a/g/i targeted to Aurora-B in human osteosarcoma cells

ZHOU Yunfei, LIU Jiaming, CHEN Xuanyin, ZHU Liangbo, LONG Xinhua, ZHOU Yang, ZHANG Zhihong, LIU Zhili (Department of Orthopedics, the 1stHospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China)

LIU Zhili E-mail: zgm7977@163.com

Background and purpose:MicroRNA(miRNA) is a class of small non-coding RNA playing an important regulatory role in many tumors. This study investigated which miRNA might negatively regulate the expression of Aurora-B in osteosarcoma cells, and to lay the foundation for the further investigation of the effort and regulation of Aurora-B in osteosarcoma malignant phenotype.Methods:Bioinformatics prediction software (http:// www.targetscan.org) and luciferase assays were used to investigate which miRNA might target to modulate the Aurora-B. Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (RTFQ-PCR) and Western blot assay were used to further verify which miRNA could negative regulate the expression of Aurora-B gene.Results:Bioinformatics prediction showed let-7 family have the possibility to modulate the expression of Aurora-B; Luciferase assays showed that Aurora-B might be the target gene of let-7a/b/c/d/e/f/g/i; RTFQ-PCR and Western blot analysis testified that both the expression levels of Aurora-B mRNA and Aurora-B protein were significantly decreased in Let-7a/g/i up-regulated U2-OS and HOS cells, compared to the cells in the negative control group; but in Let-7b/c/d/e/f up-regulated U2-OS and HOS cells, the expression levels of Aurora-B mRNA and Aurora-B protein have no significant difference, compared to the cells in the negative control group.Conclusion:Let-7a/g/i may downregulate the expression of Aurora-B in human osteosarcoma cells.

Osteosarcoma; let-7; Aurora-B

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.12.008

R738.6

A

1007-3639(2015)12-0966-06

2014-07-09

2014-09-16）

劉志禮 E-mail:zgm7977@163.com