陳靜，Luo Jing，Hitchcock Peter

（1.福建師范大學生命科學院，福州 350117；2.美國密歇根大學安娜堡分?？唆敻裱劭浦行模材缺?48103）

研究報告

Midkine-a通過限制心肌細胞總數(shù)的方式阻礙斑馬魚胚胎心臟生長

陳靜1*，Luo Jing2，Hitchcock Peter2

（1.福建師范大學生命科學院，福州 350117；2.美國密歇根大學安娜堡分?？唆敻裱劭浦行?，安娜堡 48103）

目的探討一種可溶性的外分泌因子midkine-a在斑馬魚胚胎心臟發(fā)育過程中的功能。方法 在整體胚胎上做midkine-a RNA的原位雜交實驗；利用原有的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系Tg（pmidkine-a：EGFP），動態(tài)觀察胚胎從出生到心臟發(fā)育成形這一段時間心臟熒光表達情況；將原有的轉(zhuǎn)基因斑馬魚體系Tg（phsp：midkine-a：EGFP）胚胎進行熱休克而過表達midkine-a，觀察胚胎心臟表型；利用Tg（pcm lc2：dsRed）魚系胚胎的心肌細胞核帶有紅色熒光，能進行單個心臟心肌細胞計數(shù)這一特點，將雜合的Tg（phsp：midkine-a：EGFP）魚系與純合的Tg（pcmlc2：dsRed）魚系交配，以得到Tg（phsp：midkine-a：EGFP/pcmlc2：dsRed）的雜合胚胎，對其進行熱休克而過表達midkinea，計算每個胚胎心臟內(nèi)心肌細胞的總數(shù)；用嗎啉寡聚核苷酸（morphonino，MO）阻礙新生胚胎內(nèi)的midkine-amRNA表達，觀察胚胎心臟表型。結(jié)果原位雜交試驗證實midkine-a在胚胎48 hpf（hour post fertilization，受精后，用來標記斑馬魚胚胎年齡）大時表達于心臟；轉(zhuǎn)基因Tg（pmidkine-a：EGFP）胚胎在72 hpf時其EGFP表達于心臟；Tg（phsp：midkine-a：EGFP）胚胎在過表達midkine-a后心臟變??；嗎啉寡聚核苷酸敲除midkine-a對胚胎心臟發(fā)育無影響；最后在Tg（phsp：midkine-a：EGFP/pcmlc2：dsRed）魚系胚胎內(nèi)過表達midkine-a導致其單個心臟內(nèi)心肌細胞數(shù)目變少，與其小心臟外形吻合。結(jié)論midkine-a在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中表達于胚胎心臟；過表達midkine-a導致胚胎心臟內(nèi)心肌細胞總數(shù)減少及心臟變?。磺贸齧idkine-a則對胚胎心臟發(fā)育無影響。

斑馬魚胚胎；心臟發(fā)育；midkine-a；心肌細胞池

midkine是一種可溶性細胞生長因子，能與小分子肝素結(jié)合，并在調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、分化及存活方面起著重要的多樣化的作用［1］。它是一個13 kda的分泌分子，由兩個結(jié)構(gòu)域組成，C端結(jié)構(gòu)域能與肝素結(jié)合，N端結(jié)構(gòu)域能與受體結(jié)合，兩個結(jié)構(gòu)域之間以雙硫鍵相連［1］。Midkine-a廣泛地表達于神經(jīng)系統(tǒng)［2］、免疫系統(tǒng)、腫瘤組織及心臟等器官或組織內(nèi)。midkine能促進神經(jīng)元生長［3］，促進細胞分裂、存活、抗細胞凋亡、促進腫瘤細胞趨藥現(xiàn)象發(fā)生等［1］。

不同于哺乳動物只有一種midkine，由于基因重復(fù)的結(jié)果midkine在斑馬魚體內(nèi)有2種亞型：a型和b型［3］。midkine-a首先表達于斑馬魚胚胎尾芽期的胚胎的軸旁中胚層，而后midkine-a表達逐漸開始集中于神經(jīng)組織如頭部的神經(jīng)外胚層、神經(jīng)管及脊髓［3］。在16 hpf時，midkine-a開始出現(xiàn)在體節(jié)中［3］。故而人們普遍地認為midkine-a在神經(jīng)組織形成及胚胎正常發(fā)育中起著重要的作用［2，3］。有文獻報道m(xù)idkine-a亦表達于斑馬魚視網(wǎng)膜的干細胞之內(nèi)，并作為Id2a信號通路的主要成員調(diào)節(jié)動態(tài)的細胞周期進程［4］。此外midkine-a也存在于成年哺乳動物的心臟［5］，可能通過其抗細胞凋亡的功能在心肌缺血時保護心臟［6］。在成年斑馬魚受到心肌損傷而導致的心臟再生過程中，再生心肌內(nèi)midkine-a基因的轉(zhuǎn)錄水平升高，故而其可能在心臟再生中也起著一種積極的保護性［7］。我們的研究表明midkine-a也表達于斑馬魚胚胎心臟區(qū)域內(nèi)，盡管如此，midkine-a在胚胎心臟發(fā)育過程中的功能尚不明了，而且不一定與它在成年心臟或心肌再生中的作用平行一致。由此促使我們開始探索midkine-a在心臟發(fā)育中的作用。類似于midkine-a，midkine-b也是一種能與小分子肝素結(jié)合的可溶性細胞生長因子，在體外細胞培養(yǎng)中表現(xiàn)出促進神經(jīng)生長和血管新生的作用［1］。有報道表明midkine-b在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的原腸胚期中起著促進神經(jīng)板圖式形成的作用，它能調(diào)節(jié)神經(jīng)板邊緣的干細胞的分化［6］。在斑馬魚胚胎內(nèi)，midkine-a和midkine-b分別表達于互不重疊的區(qū)域［3］。而我們的前期數(shù)據(jù)表明midkine-b并不表達于斑馬魚成年或胚胎心臟，故在本系列實驗設(shè)計時忽略midkine-b。

斑馬魚的胚胎心臟發(fā)育可分為如下過程：心臟前區(qū)形成，心臟前體細胞遷移，心腔形成及心袢形成。在斑馬魚胚胎原形形成之前心臟前體細胞分散在胚胎腹側(cè)及側(cè)面的區(qū)域內(nèi)［7］。在胚胎受精后12 h（12 hpf，hours post fertilization），胚胎兩側(cè)的心臟前體細胞向中線前部遷移，形成一個平行對稱的心臟前區(qū)域［8］。而后心臟前區(qū)域分化出位于中間的心內(nèi)膜前體細胞群，及位于側(cè)部的心肌前體細胞群［8］。在胚胎處于13-原節(jié)期時（15.5 hpf），心臟前區(qū)域分出前心室前體細胞群及前心房前體細胞群。在19 hpf時心肌前體細胞層在中線上匯集并形成一個圓錐形結(jié)構(gòu)［8］。該圓錐形結(jié)構(gòu)在22 hpf時進一步演化成一個位于胚胎前后軸上的初始心管。到48 hpf時，這個心管歷經(jīng)心腔形成，右向心袢形成，心瓣膜生成，血循環(huán)形成，形成一個成熟的有功能的心臟［8］。

我們初步的研究表明：①原位雜變試驗證實midkine-a表達于發(fā)育中的心臟；②Midkin-a基因5’端上游2.2 kb長的DNA序列能引導EGFP在胚胎體內(nèi)普遍表達，包括心臟或的表達；③過表達midkine-a導致斑馬魚胚胎心臟變小；④MO敲除midkine-a對胚胎心臟發(fā)育沒有影響。⑤過表達midkine-a導致心臟內(nèi)心肌細胞總數(shù)減少，與小心臟的表型一致。這些數(shù)據(jù)表明，midkine-a在斑馬魚胚胎心臟的發(fā)育中起著重要的作用，能通過限制心肌細胞總數(shù)的方式調(diào)整發(fā)育中的心臟生長。

1 材料與方法

1.1 斑馬魚飼養(yǎng)

所有實驗斑馬魚及胚胎均為清潔級，來源于野生型AB品系［10，11］。用于交配的30只斑馬魚均為24月齡，體重0.11～0.23 kg。實驗操作地址為美國密歇根大學安娜堡分?？肆_格眼科中心。斑馬魚胚胎存放于27℃的海鹽水（60μg/mL Instant Ocean Salts；Aquarium Systems，Mentor，OH）中。房間明暗周期為14 h/10 h［12］。轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（phsp：midkine-a：EGFP）是實驗室原有的魚系。其轉(zhuǎn)入的基因為熱休克蛋白啟動子連接midkine-a和EGFP（加強綠色熒光蛋白，enhanced green fluorescent protein）的融合基因。在熱休克處理下，該株魚系會過表達midkine-a：EGFPmRNA。Tg（pmidkine-a：EGFP）是另外一株轉(zhuǎn)基因斑馬魚系，轉(zhuǎn)入基因為midkine-a。轉(zhuǎn)錄起始位點5’端上游2.2 kb的啟動子片段連接EGFP報告蛋白。該株魚系胚胎在有midkine-a表達的組織和器官會表達midkine-a：EGFP融合蛋白而發(fā)出綠色熒光。Tg（pcmlc2：dsRed2-nuc）是另外一株能在胚胎心臟心肌細胞核發(fā)出紅色熒光的斑馬魚轉(zhuǎn)基因魚系，其轉(zhuǎn)入的基因為心肌特異性基因肌球蛋白輕鏈2的啟動子連接紅色熒光蛋白（r ed fluorescent protein，RFP）（Stainier 2001）。該RFP蛋白具有核定位信號引導RFP在心肌細胞核內(nèi)表達［8］。建立這種魚系的目的是為了更好的心肌細胞熒光顯影并對某單個心臟內(nèi)的心肌細胞數(shù)目進行計數(shù)。

1.2 原位雜交

斑馬魚胚胎的全組織包埋原位雜交實驗根據(jù)文獻報道的方法進行［12］。首先收集48 hpf的胚胎，而后對這些胚胎進行固定、滲透化及預(yù)雜化。雜化在70℃下進行。探針為與midkine-a mRNA相對應(yīng)的地高辛標記的小片段反義RNA。接下來這些胚胎標本經(jīng)洗滌后加入有堿性磷酸酶標記的抗地高辛抗體。顯色反應(yīng)于室溫下的堿性Tris緩沖液內(nèi)進行，而后胚胎標本在Zeiss Image A2蔡司顯微鏡（德國蔡司公司）下顯像。

1.3 心肌細胞計數(shù)

Tg（pcm lc2：dsRed2-nuc）胚胎用來對心肌細胞進行計數(shù)。將雜合子斑馬魚Tg（phsp：midkine-a：EGFP）line與純合子Tg（pcmlc2：dsRed-nuc）斑馬魚交配，后代胚胎基因型有一半是雙重轉(zhuǎn)基因胚胎

Tg（phsp：midkine-a：EGFP）+/ˉ；Tg（pcmlc2：dsRed-nuc）+/ˉ。這些胚胎在熱休克處理下能普遍的過表達midkine-a：EGFP，并且它們的心臟心肌細胞核也能發(fā)出紅色熒光。此種交配產(chǎn)生的另一半胚胎具有pcmlc2：dsRed-nuc+/ˉ基因型，但不能過表達midkine-a，這些胚胎可用來做心肌細胞計數(shù)實驗的對照。在熱休克處理后，在熒光顯微鏡下根據(jù)心臟有無綠色熒光將這兩組胚胎分開。這些胚胎存養(yǎng)在0.003%苯硫脲海鹽水中以抑制表皮色素形成。而后在72 hpf時將這些胚胎置入玻片上的含10%胎牛血清的Lebovitzˊs L15培養(yǎng)液中，蓋上蓋玻片后立即在熒光下顯像。在每張心臟圖像上進行心肌細胞計數(shù)［7］。此實驗重復(fù)三次。每次試驗的對照組和實驗組都包括10只胚胎。用來熒光顯像及心肌細胞計數(shù)的胚胎則從這些胚胎中隨機選擇。

1.4 熱休克處理

多次熱休克處理的方法：將Tg（phsp：midkinea：EGFP）胚胎在15、20、24、27、30及48 hpf大時，置于37℃持續(xù)1 h，而后將胚胎置于24℃的環(huán)境中恢復(fù)。這種熱休克處理方法能在最大程度上促進midkine-a的表達，同時野生型胚胎也置于相同條件的環(huán)境中作為對照。胚胎心臟于50 hpf時顯像。

1.5 統(tǒng)計分析

實驗組與對照組平均值之間差異顯著性用Statistica 7.0（StatSoft，Inc.，Tulsa，OK）軟件中的雙向分差分析計算，而后用Fisher LSD實驗進行驗證。結(jié)果用平均值+標準差表示，“*”表明組之間差異具有顯著性，P≤0.05。

2 結(jié)果

2.1 早期斑馬魚胚胎發(fā)育過程中m idkine-a在心臟表達

我們的原位雜交實驗結(jié)果表明midkine-a mRNA在胚胎早期發(fā)育過程中如48 hpf時即表達于心房和心室（圖1）。與此表達一致的是，在72 hpf轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（pmidkine-a：EGFP）的胚胎內(nèi)，midkine-a 5’端轉(zhuǎn)錄起始位點上游2.2 kb的DNA片段即可誘導其后的融合基因midkine-a：EGFP在心臟特異性的表達（圖2）?？偠灾?，midkine-a能在早期胚胎心臟發(fā)育過程中表達于心臟，這說明midkine-a在心臟發(fā)育過程中可能扮演了特定的角色。

2.2 胚胎體內(nèi)m idkine-a過表達導致心臟發(fā)育異常變小

為了理清midkine-a的功能，我們利用了Tg（phsp：midkine-a：EGFP）轉(zhuǎn)基因斑馬魚以進一步研究過表達midkine-a對心臟發(fā)育的影響。該魚系的轉(zhuǎn)基因是由熱休克基因的啟動子與其后的融合基因midkine-a和EGFP報告基因組成。在較高的環(huán)境溫度下，熱休克基因的啟動子被激活，誘導其后的midkine-a和EGFP融合基因的表達。當這些胚胎用熱休克處理（方法詳見材料和方法，及圖3）后，這些胚胎體內(nèi)的midkine-a：EGFP普遍的大量的整體表達，包括在胚胎心臟的表達，所以在熒光下整體胚胎包括心臟呈綠色。由于心臟位于胚胎腹側(cè)的體表下，故帶綠色熒光的心臟能很容易地與其他組織分辨開來（圖4B，B’）。這些心臟與對照組非轉(zhuǎn)基因胚胎心臟比較，其心臟明顯變小并伴有輕度的心包積液（圖4C，D）。除了心臟變小的表型外，這些胚胎還并發(fā)心動過緩的異常體征。轉(zhuǎn)基因胚胎心臟平均跳動23次/分，而對照組胚胎的正常心跳平均為126次/分。（midkine-a整體表達于胚胎內(nèi)，包括心臟、視網(wǎng)膜、骨骼肌等。由于心臟位于胚胎頭部腹側(cè)的體表下，故帶綠色熒光的心臟能很容易地與其他組織分辨開來。

注：斑馬魚胚胎在48 hpf時的midkine-a全組織包埋原位雜交實驗。方向：A，anterior（前方）；P，posterior（后方）；V，ventral（腹面）；D，dorsal（背部）。箭頭指向，A，atrium（心房）；V，ventricle（心室）。圖1 原位雜交顯示midkine-a mRNA存在于胚胎的心臟中（×20）Note.The whole-mount in situ hybridization of48 hpf embryos showing the heart.Orientation：A，anterior；P，posterior；V，ventral；D，dorsal.The arrows point to A，atrium；V，ventricle.Fig.1 In situ hybridization shows thatmidkine-amRNA exists in a 48 hpf embryonic heart

注：Tg（pmidkine-a：EGFP）轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎在心臟內(nèi)表達EGFP，證實midkine-a在胚胎發(fā)育早期就表達于心臟。箭頭指向動脈球（bulbus arteriosus）和心室（ventricle）。方向：A.Anterior（前方）；P.Posterior（后方）；V.Ventral（腹面）；D.Dorsal（背部）。圖2 轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（pmidkine-a：EGFP）胚胎在心臟內(nèi)表達EGFP（×100）Note.Tg（pmidkine-a：EGFP）transgenic fish expresses EGFP in the heart，demonstrating thatmidkine-a expresses in the early developmental stage of the embryonic heart.The arrows point to the bulbus arteriosus and the ventricle.Orientation：A，anterior；P，posterior；V，ventral；D，dorsal.Fig.2 The embryo of transgenic fish Tg（pmidkinea：EGFP）specifically expresses EGFP in the heart

注：熱休克處理示意圖表明對Tg（phsp：midkine-a：EGFP）轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎進行熱休克處理以誘導midkine-a：EGFP蛋白大量表達。胚胎分別在15、20、24、27、30、48 hpf時予以37℃1 h的熱處理后，轉(zhuǎn)移至24℃恢復(fù)。圖3 熱休克處理示意圖Note.Diagram showing the regimen of heatshock treatments of Tg（phsp：midkine-a：EGFP）embryos at 15，20，24，27，30，48 hpf to induce the maximum production of midkine-a.For each heatshock treatment，embryos were exposed in a 37℃ incubator for 1 h and then recovered in the 24℃ incubator.Fig.3 Diagram of the heat shock treatment

2.3 嗎啉寡合核苷酸敲除m idkine-a對斑馬魚早期胚胎心臟發(fā)育無影響

與過表達midkine-a不同的是，用嗎啉寡合核苷酸（morpholino，MO）阻礙midkine-a的轉(zhuǎn)錄對斑馬魚早期胚胎心臟發(fā)育沒有影響。在0～48 hpf之間，斑馬魚胚胎心臟發(fā)育歷經(jīng)心腔形成、右向心袢形成、心瓣膜生成、血循環(huán)形成，最終形成一個成熟的心臟。而我們從0～120 hpf仔細觀察了midkine-a有機體（morphant，指注射了嗎啉寡合核苷酸的胚胎）的心臟表型，未見明顯異常（圖5）。在82 hpf時midkine-a有機體心臟發(fā)育正常，心腔形成，及右向心袢、心瓣膜、血循環(huán)形成無異常，與對照組無差別，未見小心臟或心包積液的產(chǎn)生。這說明midkine-a的存在對于斑馬魚胚胎心臟的正常發(fā)育不是必需的。本midkine-a嗎啉寡合核苷酸阻礙midkine-a翻譯作用的有效性及特異性用midkine-a及midkine-b cD-NA體外翻譯實驗（圖6）證實。該實驗結(jié)果證實midkine-a嗎啉寡合核苷酸能有效地阻礙midkine-a cDNA體外翻譯；而無阻止同源基因midkine-b cNDA體外翻譯的作用，證實了其有效性及特異性。

注：熱休克引導midkine-a：EGFP在48 hpf Tg（phsp：midkine-a：EGFP）胚胎中的表達。從野生型與半合子Tg（phsp：midkine-a：EGFP）斑馬魚交配的后代經(jīng)歷熱休克后，在熒光顯微鏡下根據(jù)心臟有無綠色熒光蛋白的引導表達，分成野生型（A，WT）與轉(zhuǎn)基因型［B，Tg（phsp：midkine-a：EGFP）］兩組。A，B為胚胎整體圖；A’，B’為心臟細節(jié)圖。白色箭頭指向表達綠色熒光蛋白的心臟。C、D，野生型與Tg（phsp：midkine-a：EGFP）胚胎在熱休克處理后的心臟DIC圖像。心房用紅色線描出，心室用白色線描出。圖4 熱休克引導midkine-a：EGFP在Tg（phsp：midkine-a：EGFP）胚胎中的過表達導致胚胎心臟變小（上圖×100，下圖×20）Note.Heatshock treatments induce midkine-a：EGFP protein expression in the whole embryos.Wild-type and heterozygous Tg（phsp：midkine-a：EGFP）fish were crossed to get the wild-type（A）and Tg（phsp：midkine-a：EGFP）（B）embryos，and then these embryoswere heatshcocked to induce the transgene expression.A，B，whole embryos expressingmidkine-a：EGFP；A’，B’，the corresponding hearts expressingmidkine-a：EGFP.White arrow points to the green heart.C，D，DIC images of the wild-type and Tg（phsp：midkine-a：EGFP）hearts.The atriums were outlined by red color and the ventricles were outlined by white color.Fig.4 Heat shock treatment induces the expression of the fusion protein midkine-a：EGFP in Tg（phsp：midkine-a：EGFP）embryos，leading to a small heart

2.4 斑馬魚胚胎過表達m idkine-a導致心肌細胞總數(shù)減少

如前（材料與方法）所述，我們將轉(zhuǎn)基因魚Tg（phsp：midkine-a：EGFP）與Tg（pcm lc2：dsRed-nuc）交配，得到并分離基因型為Tg（phsp：midkine-a：EGFP）/Tg（pcmlc2：dsRed-nuc）雜合子胚胎。先用熱休克處理誘導midkine-a的過表達，而后按照材料與方法所述在熒光顯微鏡下計算每個雜合子胚胎心臟的心肌細胞總數(shù)，與對照組相比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在熱休克處理之前1 h，過表達midkine-a組與對照組的心肌細胞總數(shù)相比較沒有區(qū)別；而在熱休克處理之后的72 hpf時，過表達組心肌細胞總數(shù)明顯減少至每個心臟平均126個心肌細胞。相反的是對照組的心肌細胞總數(shù)在這一時刻有約218個心肌細胞（圖7）。兩者之間的統(tǒng)計學上差異有顯著性。這說明，與表型一致的是，過表達midkine-a導致心臟內(nèi)心肌細胞總數(shù)減少，且這一現(xiàn)象與過表達midkine-a胚胎的小心臟表型密切相關(guān)。這說明很可能midkine-a過表達阻礙了胚胎心肌細胞增殖，使其心肌細胞總數(shù)減少，導致小心臟的表型。

注：注射過對照MO（左）及midkine-MO（右）的胚胎的心臟DIC圖像。圖中箭頭指向心臟位置。攝像拍于胚胎82 hpf時。圖5 MO敲除midkine-a不影響胚胎心臟正常發(fā)育（×20）Note.DIC images of the embryonic control heart（Left）and the heart ofmidkine-a Knock-down embryos（Right）with morpholino. Black arrows point to the hearts.Fig.5 Knock-down ofmidkine-a withmorpholino does not affect the embryonic heart development

注：體外翻譯實驗證實midkine-a嗎啉寡合核苷酸阻礙midkine-a cDNA翻譯作用的有效性及特異性。midkine cDNA體外翻譯實驗用35S-甲硫氨酸標記。為決定midkine-a嗎啉寡合核苷酸的有效性，midkine-a cDNA體外翻譯實驗在無嗎啉寡合核苷酸（1道）、有對照嗎啉寡合核苷酸（2道）及有midkine-a嗎啉寡合核苷酸（3道）存在的條件下進行。為決定midkine-a嗎啉寡合核苷酸的特異性，midkine-b cDNA體外翻譯實驗在有對照嗎啉寡合核苷酸（4道）或有midkine-a嗎啉寡合核苷酸（5道）存在的條件下進行。圖6 midkine-a嗎啉寡合核苷酸對斑馬魚midkine-a cDNA體外翻譯阻礙作用的有效性與特異性Note.In vitro translation using35S-methionine label shows the effectiveness and specificity ofmidkine-a MO.To determine the effectiveness ofmidkine-a MO，midkine-a cDNA in vitro translation experimentswere conducted in the absence（Lane 1），presence of control MO（Lane 2），and the presence ofmidkine-a MO（Lane3）.To determine the specificity ofmidkine-a MO，midkine-b cDNA in vitro translation experiments were conducted in the presence of control MO（Lane 4），and the presence ofmidkine-a MO（Lane 5）.Fig.6 The specificity and effectiveness ofmidkine-a MO on blocking the in vitro translation ofmidkine-a and midkine-b cDNA

3 討論

Midkine是一種可溶性細胞生長因子，能與小分子肝素結(jié)合，并在調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、分化及存活方面起著重要的多樣化的作用［1，13］。它是一個13 ×103的分泌分子，由兩個結(jié)構(gòu)域組成，C端結(jié)構(gòu)域能與肝素結(jié)合，N端結(jié)構(gòu)域能與受體結(jié)合，兩個域之間以雙硫鍵相連［1，13］。它廣泛地表達于神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、腫瘤組織及心臟等器官或組織內(nèi)［13，14］。midkine能促進神經(jīng)元生長，促進細胞分裂、存活、抗細胞凋亡、促進腫瘤細胞趨藥現(xiàn)象發(fā)生等［13，14］。盡管midkine也表達于胚胎及成年哺乳動物心臟，但它在心臟中的功能人們還知之甚少。

注：雜合子魚系Tg（phsp：midkine-a：EGFP）與純合子魚系Tg（cmlc2：dsRed-nuc）交配，后代胚胎經(jīng)熱休克后，在72 hpf時根據(jù)心臟綠色熒光的有無分兩組，野生型（A）和midkine-a過表達組（B）。在熒光顯微鏡下兩組72 hpf胚胎的發(fā)紅色熒光的心肌細胞被計數(shù)。C圖所顯示的數(shù)目來自野生型和midkine-a過表達組各三組，每組平均3只胚胎的統(tǒng)計。*表明差異有顯著性，P＜0.05。圖7 過表達midkine-a組的胚胎心臟內(nèi)心肌細胞總數(shù)比對照組低（×50）Note.The heterozygous（phsp：midkine-a：EGFP）fish was crossed with homozygous（cmlc2：dsRed-nuc）fish.Their progenies were heat-shocked and grouped into wild-type（A）and midkine overexpression（B）groups by the absence and presence of green fluorescence in the heart.To count their cardiomyocytes，the embryonic heartswere imaged with the red fluorescence undermicroscope at72 hpf.The experimentswere repeated three times and three embryoswere counted each time to get the average number of the cardiomyocytes in each group.*shows a significant statistical difference between the numbers of cardiomyocytes in the wild type and midkine-a overexpression groups.Fig.7 Overexpression ofmidkine-a leads to a reduced total number of cardiomyocytes in the embryonic heart

斑馬魚的midkine存在兩種亞型：midkine-a和midkine-b［3］。二者在斑馬魚胚胎發(fā)育及神經(jīng)系統(tǒng)形成的過程中起著重要的作用。在斑馬魚胚胎時期，midkine-a和midkine-b各自表達于獨立的互不重疊的區(qū)域［3］。有文獻報道表明，midkine-a首先表達于原腸胚晚期的胚胎。當神經(jīng)胚開始形成時，midkine-a開始出現(xiàn)在未分節(jié)的延髓傍中胚層［3］。而后，midkine-a以波浪式的方式從前至后表達于這一區(qū)域。在后期，midkine-a表達于軸旁中胚層及前神經(jīng)龍骨［3］。此時midekine-a的表達區(qū)域標定了無midkine-a表達的內(nèi)側(cè)底板。midkine-a的表達在時間和空間上與內(nèi)側(cè)底板的出現(xiàn)一致［3］。在斑馬魚胚胎體內(nèi)，過表達midkine-amRNA可致內(nèi)側(cè)底板增大和其細胞數(shù)目顯著增加，而嗎啉寡核苷酸敲除midkine-a可致內(nèi)側(cè)底板發(fā)育異常及其標記物表達的缺失［3］。內(nèi)側(cè)底板與脊索臨近，且均由中線前體細胞發(fā)育而來。該研究表明midkine-a可削弱脊索的發(fā)育，而內(nèi)側(cè)底板的增大是以脊索發(fā)育的減弱為代價，故而midkine-a在特化內(nèi)側(cè)底板及脊索細胞命運上起著重要的作用［3］。midkine在脊椎動物發(fā)育過程中的作用多樣化，并不單獨依賴于midkine作為生長因子的作用。雖然midkine-a是一種生長因子，BrdU摻入法及抗磷酸化組蛋白的免疫組化實驗均表明底板細胞數(shù)目的增加并不來源于細胞增殖。故而midkine-a在特化內(nèi)側(cè)底板及脊索細胞命運上的作用與其自身作為生長因子的作用無關(guān)［3］。我們的實驗表明Mdikine-a也表達在胚胎心臟內(nèi)。在胚胎內(nèi)過表達Mdikine-a能阻礙心臟生長。故而我們提出假說，即類似于midkine-a在特化內(nèi)側(cè)底板及脊索細胞命運的功能相似，過表達midkine-a阻礙胚胎心臟發(fā)育的機制也可能是其通過特化正常心肌細胞的命運，限制心肌細胞總數(shù)，使得心肌細胞總數(shù)減少。早期的胚胎心臟生長依賴于心肌細胞總數(shù)的增加，而過量的midkine-a可能通過阻礙心前細胞分化或阻礙心肌細胞增殖這兩種方式，降低心臟內(nèi)心肌細胞總數(shù)。而嗎啉寡合核苷酸敲除midkine-a對斑馬魚早期胚胎心臟發(fā)育無影響，說明midkine-a對心臟發(fā)育不是必需的，而過多的midkine-a則能起著限制性的作用?？傊?，midkine-a在斑馬魚胚胎心臟發(fā)育早期起著通過限制心肌細胞總數(shù)的方式以特化心肌細胞的命運的作用。本研究的意義在于它將是將來進一步研究midkine在心臟中的下游信號通路的基礎(chǔ)，并提供人們對心肌損傷后的心臟分子內(nèi)環(huán)境進一步的認識，為成人心肌缺血或梗死的可能的分子生物學治療奠定基礎(chǔ)［15］。

［1］ Kadomatsu K，Muramatsu T.Midkine and pleiotrophin in neural development and cancer［J］.Cancer Lett，2004，204（2）：127 ˉ143.

［2］ Winkler C，Yao S.Themidkine family of growth factors：diverse roles in nervous system formation and maintenance［J］.Br J Pharmacol，2014，171（4）：905ˉ912.

［3］ Winkler C，Schafer M，Duschl J，etal.Functional divergence of two zebrafish midkine growth factors following fish-specific gene duplication［J］.Genome Res，2003，13（6A）：1067ˉ1081.

［4］ Luo J，Uribe RA，Hayton S，et al.Midkine-A functions upstream of Id2a to regulate cell cycle kinetics in the developing vertebrate retina［J］.Neural Dev，2012，7（1）：33.

［5］ Horiba M，Kadomatsu K，Yasui K，et al.Midkine plays a protective role against cardiac ischemia/reperfusion injury through a reduction of apoptotic reaction［J］.Circulation，2006，114（16）：1713ˉ1720.

［6］ Liedtke D，Winkler C.Midkine-b regulates cell specification at the neural plate border in zebrafish［J］.Dev Dynamics，2008，237（1）：62ˉ74..

［7］ Lien CL，Schebesta M，Makino S，etal.Gene expression analysis of zebrafish heart regeneration［J］.PLoSBiol，2006，4（8）：e260.

［8］ Stainier DY.Zebrafish genetics and vertebrate heart formation［J］.Nat Rev Genet，2001，2（1）：39ˉ48.

［9］ Thisse C，Thisse B.High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos［J］.Nat Protoc，2008，3（1）：59ˉ69.

［10］ 何嘉玲，劉靜，王天奇，等.斑馬魚的質(zhì)量標準化［J］.中國實驗動物學報，2014，22（6）：99ˉ102.

［11］ 李闊宇，潘魯湲，孫永華.斑馬魚資源的開發(fā)保藏與國家斑馬魚資源中心［J］.中國實驗動物學報，2014，22（6）：93ˉ 98，105.

［12］ 柯賢福，胡慧穎，吳立仁，等.實驗用斑馬魚養(yǎng)殖地方標準的初步探討［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2014，24（8）：75ˉ 78.

［13］ Jones DR.Measuring midkine：the utility of midkine as a biomarker in cancer and other diseases［J］.Br JPharmacol，2014，171（12）：2925ˉ2939.

［14］ Sato W，Sato Y.Midkine in nephrogenesis，hypertension and kidney diseases［J］.Br JPharmacol，2014，171（4）：879ˉ 887.

［15］ Muramatsu T，Kadomatsu K.Midkine：an emerging target of drug development for treatment of multiple diseases［J］.Br J Pharmacol，2014，171（4）：811ˉ813.

M idkine-a inhibits zebrafish embryonic heart grow th by lim iting the cardiom yocyte pool

CHEN Jing1，LUO Jing2，Hitchcock Peter2
（1.Fujian Normal University，F(xiàn)uzhou 350117，China；2.Kellogg Eye Center of University of Michigan-Ann Arbor，Ann Arbor，US 48103）

ObjectiveTo investigate the functional role of a soluble secretion factormidkine-a in the process of zebrafish embryonic heart development.M ethodsWhole-mount in situ hybridization was performed to detect whether midkine-a is expressed in the embryonic heart.In the transgenic embryonic heart of Tg（pmidkine-a：EGFP），the expression of EGFP in the heartwasmonitored.Multiple heat shock treatmentswere applied to Tg（phsp：midkine-a：EGFP）embryos in order to overexpressmidkine-a，and the phenotype of the heart was observed.The heterozygous Tg（phsp：midkine-a：EGFP）fish were crossed with homozygous Tg（pcm lc2：dsRed）fish，which specifically expresses RFP in the nucleoli of embryonic cardiomyocytes to facilitatemyocyte number counting.To get Tg（phsp：midkine-a：EGFP/pcmlc2：dsRed）embryos，and the total number of cardiomyocytes in their heartwas counted and compared with the controls when the heat shock induced overexpression ofmidkine-a.Morphonino knocked out ofmidkine-a was performed to observe the heart phenotype.ResultsMidkine-a was expressed in the zebrafish embryonic heart during development.Overexpression ofmidkine-a led to a smaller heart and reduced total number of cardiomyoctes in a single heart，which might be associated with the smaller heart phenotype.Morphonilo knocked out ofmidkine-a had no effect upon the heart development.ConclusionsMidkine-a impedes zebrafish embryonic heart growth by limiting its cardiomyocyte pool.

Zebrafish embryo；Heart development；midkine-a；Cardiomyocyte pool

Q95-33

A

1005-4847（2015）05-0458-08

10.3969/j.issn.1005ˉ4847.2015.05.004

2015-04-27

國家自然科學基金（No.30971106）；福建省自然科學基金（No.2014J01304）；教育部留學回國人員基金（教外司留【2010】1561號）。

陳靜（1972ˉ），女，副教授，博士，研究方向：斑馬魚胚胎心臟發(fā)育。.E-mail：jc2417@fjnu.edu.cn