孟亞平，劉春業(yè)，石德利*

（1.山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250100；2.清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084）

研究報告

ripply1在斑馬魚早期胚胎背腹發(fā)育中的作用

孟亞平1，2，劉春業(yè)1，石德利1*

（1.山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250100；2.清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084）

目的探究ripply1基因在斑馬魚早期背腹軸發(fā)生過程中的作用。方法利用斑馬魚整封原位雜交技術(shù)揭示ripply1基因在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)模式，通過顯微注射技術(shù)在胚胎1細(xì)胞期注射ripply1的mRNA來高表達(dá)Ripply1蛋白并在后期觀察胚胎背腹標(biāo)記基因的變化及胚胎形態(tài)變化。利用Tol2轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建ripply1啟動子驅(qū)動的GFP轉(zhuǎn)基因魚。結(jié)果原位雜交結(jié)果顯示ripply1基因在斑馬魚原腸早期胚盾期特異表達(dá)在胚盾處，即預(yù)定的背部。高表達(dá)ripply1后，在胚盾期背部標(biāo)記基因表達(dá)范圍擴(kuò)大，腹部標(biāo)記基因表達(dá)減弱，受精后24小時胚胎表現(xiàn)出嚴(yán)重的背部化表型：頭部增大，腹部卵黃延伸減弱，尾部軀干及尾部區(qū)域減少，有的甚至形成了第二個體軸。得到的轉(zhuǎn)基因魚揭示ripply1母源表達(dá)，并且轉(zhuǎn)錄起始位點上游1200個堿基驅(qū)動的GFP能模擬內(nèi)源基因的表達(dá)圖式。結(jié)論ripply1可能參與斑馬魚胚胎早期背腹軸的發(fā)生。

斑馬魚；ripply1；早期胚胎發(fā)育；背腹發(fā)生

胚軸（embryonic axes）形成是多細(xì)胞生物軀體模式（body plan）建立的一個重要過程，主要包括前ˉ后軸（anterior-posterior axis）、背 ˉ腹軸（dorsalventral axis）和左ˉ右軸（left-right axis）。對兩棲動物胚胎的研究發(fā)現(xiàn)背ˉ腹軸早在受精后即可觀察到，如爪蛙胚胎皮層轉(zhuǎn)動形成的灰色新月區(qū)在后期發(fā)育成背部。德國發(fā)育生物學(xué)家Hans Spemann和他的學(xué)生Hilde Mangold將原腸早期蠑螈胚胎的背部組織移植到另一種蠑螈胚胎的腹部，得到了形成雙體軸的胚胎，次級體軸的脊索來自于供體胚胎，而神經(jīng)管和體節(jié)多數(shù)來自于受體，這說明該背部組織能誘導(dǎo)周圍受體胚胎的細(xì)胞形成神經(jīng)管，首次提出了胚胎誘導(dǎo)的概念并稱該背部組織為組織者（organizer）。

ripply家族蛋白在2005年被發(fā)現(xiàn)并揭示了其部分功能［1］，研究發(fā)現(xiàn)ripply1和ripply2特異表達(dá)于體節(jié)，其中Ripply1蛋白與轉(zhuǎn)錄輔抑制因子Groucho結(jié)合，能夠終止分節(jié)基因的表達(dá)，維持體節(jié)的前后極性。之后對ripply1的研究都集中在其在體節(jié)時期對體節(jié)發(fā)生的作用，而其在早期胚胎模式發(fā)生的作用卻研究甚少。但最近在爪蛙中的研究發(fā)現(xiàn)ripply家族蛋白能通過其WRPW區(qū)域結(jié)合多梳蛋白（Polycomb group proteins）起轉(zhuǎn)錄去抑制的作用，并且在背ˉ腹軸形成過程中起重要作用［2］。然而，ripply家族基因在胚胎發(fā)育早期的表達(dá)圖式和調(diào)節(jié)方式還不清楚。并且，ripply3是人的唐氏綜合征關(guān)鍵區(qū)域基因6（Down syndrome critical region gene 6，dscr6）的同源基因［3］。因此，研究ripply家族基因的功能和作用機(jī)制能為人類遺傳疾病的致病機(jī)理提供信息。我們通過原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)ripply1在斑馬魚早期胚胎中特異表達(dá)在背部，因此推測其可能參與背腹發(fā)生。故而通過過表達(dá)ripply1，并調(diào)取1.2 kb的啟動子片段，初步研究其在胚胎早期背腹發(fā)生的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

AB品系的斑馬魚養(yǎng)殖在28.5℃的循環(huán)水系統(tǒng)中，如早期工作所描述［4］。

1.2 方法

1.2.1 獲取ripply1 cDNA

取斑馬魚胚盾（shield）時期的胚胎50枚，用Trizol方法提取胚胎總RNA，使用Transgene公司TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒反轉(zhuǎn)錄，詳細(xì)步驟參見使用說明書。

1.2.2 斑馬魚ripply1整胚原位雜交

調(diào)取ripply1全長cDNA，引物序列如下ripply1-F：5’-CAGCGCCAAACAAAACG-3’，ripply1-R：5’-TCAAATTCGCACAGACGG-3’，使用Taq酶擴(kuò)增后將其連入pGEM-T載體中。根據(jù)測序方向合成地高辛標(biāo)記的反義RNA作為探針使用。其他探針如goosecoid（gsc）、chordin（chd）、floating head（flh）、even-skipped-like 1（eve1）、T-box6（tbx6）、wnt8a詳見作者以前的工作［5］。

合成的ripply1反義RNA用原位雜交液hyb+（50%甲酰胺，5×SSC，0.1%Tween-20，0.5 mg/mL酵母RNA，0.05 mg/mL肝素）稀釋至1 ng/μL。收集不同時期的斑馬魚胚胎，固定于4%多聚甲醛中過夜。過渡到含0.1%Tween-20的PBST中，并在PBST中將胚胎膜剝?nèi)?，用PBST洗過后在原位雜交液hybˉ（50%甲酰胺，5×SSC，0.1%Tween-20）中65℃孵育10 min，之后在hyb+中65℃孵育4 h。探針60℃孵育過夜。第2天吸出探針以重復(fù)使用。胚胎用洗液I（50%甲酰胺，2×SSC，0.1%Tween-20）洗30 min（60℃），重復(fù)1次；用洗液II（5%甲酰胺，0.2×SSC，0.1%Tween-20）洗15 min（60℃），重復(fù)1次；用洗液 III（0.5%甲酰胺，0.02×SSC，0.1%Tween-20）洗30 min（60℃），重復(fù)1次。然后用MABT在室溫下洗3次，用封閉液封閉4 h。偶聯(lián)堿性磷酸酶的地高辛抗體1∶2500稀釋于封閉液中，4℃孵育過夜。第3天吸出抗體以重復(fù)使用，用MABT在室溫下洗30 min，重復(fù)1次；用PBST在室溫下洗30 min，重復(fù)1次；在平衡緩沖液（0.1 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl pH 9.5，0.05 mol/L MgCl2，0.1%Tween-20）中平衡10 min，加顯色液（5 mL平衡緩沖液中加100μL 60 mg/mL左旋咪唑，100μL NBT/BCIP），室溫避光，待信號足夠強(qiáng)加多聚甲醛終止反應(yīng)，在70%酒精中脫去浮色，拍照觀察。

1.2.3 顯微注射ripply1 mRNA

顯微注射方法詳見早期工作［5］。ripply1 mRNA注射劑量為每個胚胎200 pg。

1.2.4 ripply1啟動子序列及轉(zhuǎn)基因魚的獲得

從基因組中調(diào)取ripply1基因組上游約1.2 kb的片段，引物如下：promoter-F：5’-ATTCTCGAGGGATCCAAAACAGCTTAT-3’，promoter-R：5’-ATTAGATCTGAATGAATGAAGGCGCGT-3’。并且在上下游引物中分別引入Xho I和Bgl II酶切位點，雙酶后切連入pT2A200R150G載體。

單獨注射該質(zhì)粒觀察胚胎是否有熒光。有熒光后將該質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座酶mRNA共注射，劑量均為50 pg，待該批注射的斑馬魚F0代性成熟后外交，篩選后代胚胎有特異熒光的F1代。

2 結(jié)果

2.1 整胚原位雜交揭示ripply1在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)模式

為了明確ripply1是否參與早期背ˉ腹軸的形成，我們首先利用整胚原位雜交檢測該基因的時空表達(dá)圖式。結(jié)果顯示ripply1母源表達(dá)，但表達(dá)水平低。在原腸作用早期即胚環(huán)期表達(dá)增強(qiáng)且集中在預(yù)定背部的胚盾位置，在胚盾期ripply1在背部的表達(dá)繼續(xù)增強(qiáng)，并且向側(cè)部延伸。在原腸期，隨著細(xì)胞運動的進(jìn)行，ripply1主要表達(dá)在前脊索板中胚層和后部將要形成的體節(jié)中，但在脊索中胚層中沒有表達(dá)（圖1）。這個表達(dá)圖式暗示ripply1基因可能在背ˉ腹軸和前ˉ后軸形成過程中起調(diào)節(jié)作用。

2.2 高表達(dá)ripply1導(dǎo)致胚胎背部化

我們下一步對ripply1在背ˉ腹軸形成中的作用進(jìn)行了功能檢測。在胚胎1細(xì)胞期通過注射ripply1 mRNA進(jìn)行高表達(dá)，收集胚盾時期的胚胎進(jìn)行原位雜交。分別檢測背部標(biāo)記基因gsc、chd、flh和腹部標(biāo)記基因eve1、tbx6、wnt8a的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)幾乎所有ripply1注射的胚胎背部標(biāo)記基因gsc、chd、flh表達(dá)不但在背部增強(qiáng)并且明顯向腹側(cè)擴(kuò)增。相反，腹部標(biāo)記基因eve1、tbx6、wnt8a表達(dá)明顯減弱（圖2）。這個結(jié)果說明高表達(dá)Ripply1改變了背腹細(xì)胞的命運，使背部區(qū)域擴(kuò)大。顯示ripply1能調(diào)節(jié)斑馬魚背部的發(fā)育。

注：（A-B）1細(xì)胞期胚胎側(cè)面觀和動物極觀，顯示ripply1的母源表達(dá)。（C-G）分別為相應(yīng)時期的側(cè)面觀。動物極向上。（H-J）分別為相應(yīng)時期的動物極觀，胚胎背部向下，（K-M）分別為相應(yīng)時期的背部觀，胚胎前部向上。圖1 整胚原位雜交顯示ripply1在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中表達(dá)圖式Note.（A-B）1-cell stage lateral view and animal pole view，showing ripply1 maternal expression.（C-G）Lateral view of indicated stageswith animal pole on the top.（H-J）Animal pole view of indicated stageswith dorsal side on the bottom.（K-M）Dorsal view of indicated stageswith anterior region on the top.Fig.1 ripply1 maternal and zygotic expression patterns in early zebrafish developmental stages.

在10 hpf（胚芽期）時觀察胚胎的表型，發(fā)現(xiàn)原本呈球形的胚胎前后伸長，呈現(xiàn)明顯的橢球形，這是典型的背部化表型（圖3A，B）。24 hpf后觀察胚胎，大多數(shù)胚胎（82/99）表現(xiàn)出背部化，其中36枚胚胎頭部增大，尾部缺失（圖3C，D），而46枚胚胎頭部明顯增大，體軸變短，尾部變短，無腹部尾鰭（圖3E），一小部分胚胎（6/99）甚至呈現(xiàn)雙體軸（結(jié)果未顯示）。這些表型進(jìn)一步說明ripply1通過抑制胚胎后部發(fā)育來促進(jìn)前部的發(fā)育。

注：（A，C，E，G，I，K）未注射ripply1 mRNA相應(yīng)基因在胚盾期表達(dá)情況，動物極觀，背部處在右邊。（B，D，F(xiàn)，H，J，L）注射ripply1 mRNA后相應(yīng)基因在胚盾期表達(dá)情況，動物極觀，背部處在右邊。數(shù)據(jù)顯示該結(jié)果所占的比例。圖2 高表達(dá)ripply1后背腹標(biāo)記基因在胚盾期的變化Note.（A，C，E，G，I，K）The expression of indicated genes at shield stage in uninjected embryos.Animal pole view and dorsal is to the right.（B，D，F(xiàn)，H，J，L）The expression of indicated genes at shield stage in ripply1 mRNA-injected embryos.Animal pole view and dorsal is to the right.Fig.2 ripply1 overexpression causes the expression pattern changes of dorsal-ventralmarker genes.

注：（A，C）胚牙期（10 hpf）和24 hpf野生型胚胎。（B）注射ripply1 mRNA胚胎在尾芽期呈橢圓型。（D）嚴(yán)重表型。（E）較輕表型。圖3 高表達(dá)ripply1后導(dǎo)致胚胎背部化和軀干及尾部缺失。Note.（A，C）Bud stage（10 hpf）and 24 hpfwild-type（WT）embryo.（B）Oval shape of ripply1 dorsalized embryo atbud stage.（D）Severe phenotype and（E）slightlymild phenotype.Fig.3 Dorsalized phenotype and trunk and posterior truncation of ripply1 injected embryos.

2.3 ripply1啟動子及轉(zhuǎn)基因斑馬魚

為了研究ripply1時空表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制，我們開展了對其啟動子的研究。獲得ripply1轉(zhuǎn)錄起始位點上游1.2kb的片段后，將其后加EGFP，然后克隆到pT2A200R150G轉(zhuǎn)基因載體上（圖4A，B）。質(zhì)粒注射后發(fā)現(xiàn)在胚盾期在胚盾處有特異的熒光表達(dá)（圖4C，D），體節(jié)期在體節(jié)處有特異的表達(dá)（結(jié)果未顯示），說明該1.2 kb的片段能夠調(diào)控ripply1在斑馬魚胚胎中時空特異的表達(dá)。與轉(zhuǎn)座酶共注獲得轉(zhuǎn)基因魚ripply1：EGFP的F0代，發(fā)現(xiàn)其子代在1細(xì)胞期即有熒光，直到胚盾期仍是泛表達(dá)（圖5AC’），可能是由于EGFP比較穩(wěn)定，而母源的ripply1比較容易降解。在體節(jié)期該熒光則特異定位在軀干（圖5D，D’）。在24 hpf，EGFP信號主要集中在體節(jié)中（圖5E），而在成魚中，EGFP信號主要集中在整個軀干部分（圖5F-G’）。

注：（A）ripply1轉(zhuǎn)錄起始位點上游1.2 kb序列。（B）ripply1：EGFP質(zhì)粒圖譜。（C，D）注射ripply1：EGFP質(zhì)粒后熒光信號位于胚盾期胚胎的背部。動物極觀（C）和側(cè)面觀（D）。圖4 注射ripply1：EGFP質(zhì)粒后在胚盾期熒光表達(dá)情況Note.（A）1.2 kb ripply1 promoter sequence upstream of the transcription start site.（B）ripply1：EGFP plasmid map.（C，D）Localization of fluorescence signal driven by the1.2 kb ripply1 promoter sequence on the dorsal side of the shield stage embryo.Animal pole view（C）and lateral view（D）.Fig.4 Localization of fluorescence on the dorsal side at shield stage following injection of ripply1：EGFP plasmid

注：（A，B）受精后10 min和1細(xì)胞期胚胎熒光信號。側(cè)面觀。（C，C’）胚盾期熒光信號。動物極觀和側(cè)面觀。（D，D’）體節(jié)期胚胎熒光信號。D’是D的軀干部放大圖。（E）24hpf熒光信號。（F，G）斑馬魚成魚及軀干放大部分。（F’，G’）成魚及軀干放大部分的熒光信號圖5 ripply1啟動子轉(zhuǎn)基因F1代魚的熒光表達(dá)圖式Note.（A，B）Fluorescence at10 min after fertilization and 1 cell stage embryos.（C，C’）A shield stage embryo，animal pole view and lateral view，respectively.（D，D’）A somite stage embryo.D’is a highermagnification of the trunk region in D.（E）A 24 hpf embryowith fluorescence restricted in the somites.（F，G）An adult fish.G is a highermagnification of F at the trunk region.（F’，G’）Fluorescence pattern in F and G，respectively.Fig.5 Fluorescence signal in ripply1 promoter-driven GFP F1 progeny transgenic fish

3 討論

近年來許多研究關(guān)注ripply1在體節(jié)發(fā)生中的作用，ripply家族基因包括ripply1、ripply2、ripply3，其與T-box蛋白存在相互作用，三者均可通過結(jié)合tbx24抑制其轉(zhuǎn)錄激活［6］。爪蟾中Ledgerline可明顯抑制Tbx6的表達(dá)［7］，Bowline同樣能夠抑制tbx6對下游基因的激活作用［8］。對ripply基因家族的進(jìn)化樹分析表明ripply1基因只出現(xiàn)在后口動物中，非洲爪蟾中無ripply1，存在兩個ripply2同源基因Ledgerline/ripply2.1和 Bowline/ripply2.2，可能會補(bǔ)償ripply1的作用［9］。另有爪蛙研究表明XDSCR6/ Ripply3通過拮抗多梳家族蛋白（polycomb group proteins）參與胚胎背腹軸的形成［2］，該研究為我們研究斑馬魚中Ripply1參與胚胎背腹軸形成提供了一種可能的機(jī)制。

原位雜交結(jié)果表明ripply1特異定位在胚盾期的背部，可能參與背腹發(fā)生，高表達(dá)ripply1能增強(qiáng)背部基因的轉(zhuǎn)錄水平并抑制腹部基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致胚胎背部化表型，因此，我們的實驗結(jié)果說明ripply1在胚胎背腹軸形成方面有重要作用。這些結(jié)論與在爪蛙中研究XDSCR6/Ripply3所得到的結(jié)果一致［2］。

原位雜交揭示的是mRNA的表達(dá)模式，而啟動子的研究則可以在一定程度上揭示基因在蛋白水平的表達(dá)模式，單獨注射ripply1：EGFP質(zhì)粒只能在胚盾期觀察到特異熒光，而轉(zhuǎn)基因魚結(jié)果則證明其母源表達(dá)，說明卵母細(xì)胞中有蛋白可以調(diào)控ripply1的表達(dá)，而受精之后合子基因的表達(dá)決定了ripply1在胚盾期的特異定位。

因此我們推測ripply1可能參與胚胎背腹軸，并且是發(fā)生在合子基因開始表達(dá)之后，但母源表達(dá)可能會對該作用有一定的影響。我們?nèi)匀恍枰猺ipply1敲除后的結(jié)果，以證明其在背腹發(fā)生過程中是必要的，而且ripply1以何種方式參與，是否涉及Wnt、BMP信號通路或者也是通過表觀遺傳水平調(diào)節(jié)背腹基因的表達(dá)仍待進(jìn)一步的研究。啟動子序列的獲得有助于我們獲得ripply1上游調(diào)控蛋白，從而繪制出完整的基因調(diào)控圖譜。

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科技工作者科學(xué)道德規(guī)范（一）

【編者按】學(xué)術(shù)不端行為是指違反學(xué)術(shù)規(guī)范、學(xué)術(shù)道德的行為，國際上一般用來指捏造數(shù)據(jù)（fabrication）、竄改數(shù)據(jù)（falsification）和剽竊（plagiarism）三種行為。但是一稿多投、侵占學(xué)術(shù)成果、偽造學(xué)術(shù)履歷等行為也可包括進(jìn)去。學(xué)術(shù)不端行為在世界各國、各個歷史時期都曾經(jīng)發(fā)生過，但是像中國當(dāng)前這樣如此泛濫，嚴(yán)重到被稱為學(xué)術(shù)腐敗的地步，卻是罕見的。這不僅表現(xiàn)在違反者眾多、發(fā)生頻繁，各個科研機(jī)構(gòu)都時有發(fā)現(xiàn)，而且表現(xiàn)在涉及了從院士、教授、副教授、講師到研究生、本科生的各個層面。由于目前中國缺乏學(xué)術(shù)規(guī)范、學(xué)術(shù)道德方面的教育，科技工作者在學(xué)習(xí)、研究過程中發(fā)生不端行為，經(jīng)常是由于對學(xué)術(shù)規(guī)范、學(xué)術(shù)道德缺乏了解，認(rèn)識不足造成的。因此，對科技工作者進(jìn)行學(xué)術(shù)規(guī)范、學(xué)術(shù)道德教育，防患于未然，是遏制學(xué)術(shù)腐敗、保證中國學(xué)術(shù)研究能夠健康發(fā)展的一個重要措施。

早在2007年，中國科協(xié)就發(fā)布了科技工作者科學(xué)道德規(guī)范，本刊重溫此規(guī)范，以期在我刊營造一種健康的學(xué)術(shù)研究氛圍，由于版面限制，我刊陸續(xù)將規(guī)范全文刊出。

第一章總則

第一條為弘揚科學(xué)精神，加強(qiáng)科學(xué)道德和學(xué)風(fēng)建設(shè)，提高科技工作者創(chuàng)新能力，促進(jìn)科學(xué)技術(shù)的繁榮發(fā)展，中國科學(xué)技術(shù)協(xié)會根據(jù)國家有關(guān)法律法規(guī)制定《科技工作者科學(xué)道德規(guī)范》。

第二條本規(guī)范適用于中國科學(xué)技術(shù)協(xié)會所屬全國學(xué)會、協(xié)會、研究會會員及其他科技工作者。

第三條科技工作者應(yīng)堅持科學(xué)真理、尊重科學(xué)規(guī)律、崇尚嚴(yán)謹(jǐn)求實的學(xué)風(fēng)，勇于探索創(chuàng)新，恪守職業(yè)道德，維護(hù)科學(xué)誠信。

第四條科技工作者應(yīng)以發(fā)展科學(xué)技術(shù)事業(yè)，繁榮學(xué)術(shù)思想，推動經(jīng)濟(jì)社會進(jìn)步，促進(jìn)優(yōu)秀科技人才成長，普及科學(xué)技術(shù)知識為使命。以國家富強(qiáng)，民族振興，服務(wù)人民，構(gòu)建和諧社會為己任。

（待續(xù)）

The role of ripply1 in zebrafish dorsal-ventral development

MENG Ya-ping1，2，LIU Chun-ye1，SHIDe-li1*
（1.School of Life Science，Shandong University，Jinan 250100，China 2.School of Life Science，Tsinghua University，Beijing 100084）

ObjectiveTo explore the role of ripply1 in zebrafish dorsal-ventral development.M ethodsUsing zebrafish whole-mount in situ hybridization to examine the ripply1 expression pattern in early embryo development.To analyse the expression pattern changes of dorsal-ventral marker genes at shield stage and the morphological changes at 24 hpf（hours post-fertilization）after overexpression of ripply1 by injecting syntheticmRNA at1-cell stage.Using Tol2 transposon technology to obtain a ripply1 promoter driven GFP transgenic fish and to identify promoter region that recapitulates endogenous ripply1 expression pattern.ResultsThe in situ hybridization results revealed that ripply1 specifically expresses in the future dorsal region at shield stage.Overexpression of ripply1 caused an enhanced expression of dorsalmarker genes and a reduction of ventralmarker genes.Embryos overexpressing ripply1 also showed severely dorsalized phenotype，with enlarged head，reduced ventral yolk extension，and shortened posterior trunk and tail regions，and the formation of a secondary trunk axis.Transgenic fish revealed thematernal expression of ripply1 and suggested thata1.2 kb promoter-driven GFP is able to recapitulate the endogenous gene expression pattern.Conclusionripply1 may participate in the early developmentof dorsal-ventral axis in zebrafish embryo.

Zebrafish；ripply1；Early embryo development；Dorsal-ventral axis

Q95-33

A

1005-4847（2015）05-0446-07

10.3969/j.issn.1005ˉ4847.2015.05.002

2015-07-29

國家自然基金項目資助（No：31271556，31471360，J1103515）。

孟亞平，女，博士研究生，研究方向：Wnt信號通路，胚胎誘導(dǎo)核體軸形成。

石德利，男，博士，研究方向：Wnt信號通路，胚胎誘導(dǎo)核體軸形成。Email：dshi@sdu.edu.cn