張凱楠，龍梅，冉新建，陽迎，仝磊，李清晨，熊健會，毛新民，陶亮，李琳琳*

（新疆醫(yī)科大學(xué)1.臨床醫(yī)學(xué)院；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能中心實(shí)驗(yàn)室；3.藥理學(xué)教研室；4.中醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830054)

研究報(bào)告

兩色金雞菊醇提物對2型糖尿病小鼠腸道菌群的影響

張凱楠1，龍梅2，冉新建2，陽迎1，仝磊1，李清晨1，熊健會3，毛新民4，陶亮3，李琳琳3*

（新疆醫(yī)科大學(xué)1.臨床醫(yī)學(xué)院；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能中心實(shí)驗(yàn)室；3.藥理學(xué)教研室；4.中醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830054)

目的探討兩色金雞菊醇提物，腸道菌群和2型糖尿?。═2DM)之間的可能聯(lián)系。方法收集模型組（A)，兩色金雞菊醇提物高劑量組1.8 g/kg（B)，兩色金雞菊醇提物中劑量組1.2 g/kg（C)，二甲雙胍對照組0.2 g/kg（D)，空白對照組（E)糞便樣本，采用16S rDNA實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測糞便樣本中球形梭菌與多形擬桿菌的水平；運(yùn)用Pearson分析方法，對目標(biāo)菌屬水平與各組小鼠的空腹血糖（FBG)做相關(guān)性分析。結(jié)果①與正常組比較，模型組中球形梭菌與多形擬桿菌水平均增高（P=0.017，P=0.002)。②兩色金雞菊醇提物高劑量組與模型組相比，球形梭菌與多形擬桿菌的水平下降，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（2周:P=0.027，P=0.006；4周:P=0.007，P=0.012)。③球形梭菌水平、多形擬桿菌水平均與FBG水平呈正相關(guān)。結(jié)論兩色金雞菊醇提物對2型糖尿病小鼠腸道菌群存在著一定的影響且與其血糖水平存在相關(guān)性。

球形梭菌；多形擬桿菌；2型糖尿??；熒光定量PCR

據(jù)2013年9月《美國醫(yī)學(xué)會雜志》報(bào)道的調(diào)查結(jié)果顯示，我國18歲及以上成年人糖尿病患者達(dá)1.14億人，患病率高達(dá)11.6%[1］，其中2型糖尿?。═2DM)占90%以上。T2DM是多種因素聯(lián)合作用而導(dǎo)致的胰島素抵抗[2］。近期有研究表明，腸道菌群很可能與肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系[3-5］。

人的腸道定植著復(fù)雜多樣而又相對穩(wěn)定的菌群，其對正常代謝起著較為重要的作用。球形梭菌是人類糞便中數(shù)量較多的菌群之一，參與構(gòu)成宿主微生態(tài)系統(tǒng)，發(fā)揮維持微生態(tài)平衡、調(diào)節(jié)免疫等多方面的生理作用[7］。多形擬桿菌能降解不被人體消化和吸收的植物多糖（如纖維素等)。人體腸道幾乎不含多糖消化酶，但多形擬桿菌卻能解多糖，為宿主提供額外的能量，從而升高血糖。與此同時給予2型糖尿病大鼠補(bǔ)充益生菌，其胰島β細(xì)胞得到保護(hù)，血糖、血漿總膽固醇顯著降低[6］。這些研究均提示了腸道菌群與肥胖、2型糖尿病發(fā)生密切相關(guān)。

兩色金雞菊又名昆侖雪菊，是新疆地方特色藥物之一，具有清熱解毒、活血化瘀之效，可治療燥熱煩渴、高血壓、心慌、胃腸不適等癥狀[8-9］。黃元等[10］研究發(fā)現(xiàn)，某些高寒菊科植物提取物能顯著抑制a-葡萄糖苷酶活性。α-葡萄糖苷酶是一種在機(jī)體的代謝過程中起著關(guān)鍵作用的酶，它能使復(fù)合碳水化合物分解成可被人體吸收的單糖[11-12］。α-葡萄糖苷酶抑制劑能通過抑制該酶的活性，延緩糖類的吸收，可有效降低餐后血糖濃度峰值，提高糖耐量，預(yù)防并改善糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展[13］。駱新[14］在昆侖雪菊對2型糖尿病大鼠的研究中顯示:能有效的降低2型糖尿病大鼠的血糖，血脂水平。根據(jù)以上的研究，發(fā)現(xiàn)兩色金雞菊對降低血糖有一定的功效。

故本實(shí)驗(yàn)擬通過各組小鼠糞便中球形梭菌與多形擬桿菌的水平，分析球形梭菌與多形擬桿菌與2型糖尿病的相關(guān)性，初步判斷兩色金雞菊醇提物對小鼠腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級ICR雄性小鼠70只，購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心【SCXK（新)2011-0003】，周齡5周，體重22 g左右，飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心【SYXK（新)2011-0001】。晝夜明暗交替時間12 h/12 h，溫度（21±2)℃，濕度45% ～55%，并按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 儀器與試劑

兩色金雞菊醇提物（專利申請中，申請?zhí)? 20120270752.0)；實(shí)時熒光定量儀（美國 Bio-Rad IQ5，)；凝膠成像儀（AIphaImager HP)；微量分光光度計(jì)（美國Thermo ND-2000)；天根糞便基因組提取試劑盒（中國天根生化科技有限公司)No:DP328-02)；SYBR Green PCR kit（德國Qiagen公司)；所用引物均參照文獻(xiàn)，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，多形擬桿菌[21］（F:TCGAAAGTGTGGGTATCAAACA，R:CTGTATATCGCAAACAGCGAGT，Tm=55.0℃)；球形梭菌[15］（F:AATGACGGTACCTGACTAA，R:CTTTGAGTTTCATTCTTGCGAA，Tm= 50.0℃)

1.3 方法

1.3.1 四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的建立

SPF級ICR小鼠，雄性，體重22 g左右，高糖高脂飲食（葡萄糖20%，豬油10%，膽固醇2.5%，膽酸鈉0.5%)喂養(yǎng)4周，禁食8～10 h后，腹腔注射四氧嘧啶溶液（美國 Sigma CAS:2244-11-3)180 mg/kg造模，72 h后，禁食8～12 h測小鼠空腹血糖。以空腹血糖≥11.1 mmol/L為造模成功。

1.3.2 小鼠的分組

選取成模小鼠40只，依照血糖體重水平隨機(jī)分成4組，依次為模型組（A)，兩色金雞菊醇提物高劑量組1.8 g/kg（B)，兩色金雞菊醇提物中劑量組1.2 g/kg（C)，二甲雙胍（中美上海施貴寶制藥有限公司國藥準(zhǔn)字H20023370)對照組0.2 g/kg（D)，通過次對照組對比兩色金雞菊醇提物與目前臨床一線用藥的效能。再選取10只正常小鼠作為空白對照組（E)。

1.3.3 糞便的收集糞樣腸道微生物總DNA提取

糞便樣品細(xì)菌總DNA的提取按照天根糞便基因組提取試劑盒（中國天根生化科技有限公司)的使用說明進(jìn)行操作。用微量分光光度計(jì)檢測DNA濃度與純度。

1.3.4 實(shí)時熒光定量PCR檢測目標(biāo)菌群水平。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

分別以球形梭菌與多形擬桿菌16S rDNA可變區(qū)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別將球形梭菌與多形擬桿菌的PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段切膠、回收后作為DNA標(biāo)準(zhǔn)品，具體操作步驟按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生化科技有限公司)說明進(jìn)行。

1.3.6 目標(biāo)菌群水平的檢測

將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后濃度梯度為101～108copies/ μL的DNA樣本為模板，同時以去核酸水作為陰性對照，進(jìn)行熒光定量PCR。每個樣本平行重復(fù)2次，反應(yīng)體系及程序如下:

（1)反應(yīng)體系（20μL):上游引物0.5μL；下游引物0.5μL；熒光染料SYBR Green I 10μL；模板2.0μL；免酶水補(bǔ)水至20μL。

（2)反應(yīng)程序:①預(yù)變性:95℃ 10 min，1個循環(huán)；②PCR反應(yīng)95℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析

文中所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)以（±s)表示。計(jì)量資料運(yùn)用單因素方差分析進(jìn)行各組間比較，以Pearson相關(guān)系數(shù)評價變量間相關(guān)性，得出r值。P＜0.05，P＜0.01差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DNA的純度檢測

采用微量分光光度計(jì)測定細(xì)菌總DNA濃度，A260/A280的比值均在1.6～1.8，說明樣品DNA的純度較好，無蛋白質(zhì)污染。

2.2 球形梭菌與多形擬桿菌在五組糞樣中16S rDNA實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果

與正常組比較，模型組中球形梭菌水平、多形擬桿菌水平均增高；兩色金雞菊醇提物高劑量組與模型組相比，球形梭菌與多形擬桿菌的水平下降，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表1，2。見圖1，2。

2.3 相關(guān)性分析

分別將球形梭菌、多形擬桿菌水平與FBG水平進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，球形梭菌、多形擬桿菌水平均與FBG水平呈正相關(guān)，見圖3。

表1 五組樣本中球形梭菌起始模板量對數(shù)值比較（±s，n=10)Tab.1 Numeric comparisons of Clostridium Coccoides starting template in the samples of five groups

表1 五組樣本中球形梭菌起始模板量對數(shù)值比較（±s，n=10)Tab.1 Numeric comparisons of Clostridium Coccoides starting template in the samples of five groups

注:#:與空白對照組比較；*:與模型組比較；&:與二甲雙胍對照組比較。Note.#.Compared with the blank group.*.Compared with themodel group.&.Compared with themetformin group.

組別（Groups) 0周（0 week) 2周（2 weeks) 4周（4 weeks)模型組（Model group) 5.79±0.20##5.81±0.19 5.89±0.35兩色金雞菊醇提物高劑量組（High dose group) 5.91±0.26##5.47±0.30*&5.42±0.34**兩色金雞菊醇提物中劑量組（Moderate dose group) 6.03±0.60##5.44±0.55*&5.61±0.37*二甲雙胍對照組（Metformin group) 5.99±0.11##6.11±0.50**5.53±0.34*空白對照組（Blank group) 5.35±0.30 5.32±0.19**5.39±0.34**

表2 五組樣本中多形擬桿菌起始模板量對數(shù)值比較（±s，n=10)Tab.2 Numeric comparisons of Bacteroides thetaiotaomicron starting template in the samples of five groups（±s，n=10)

表2 五組樣本中多形擬桿菌起始模板量對數(shù)值比較（±s，n=10)Tab.2 Numeric comparisons of Bacteroides thetaiotaomicron starting template in the samples of five groups（±s，n=10)

注:#:與空白對照組比較；*:與模型組比較；&:與二甲雙胍對照組比較。Note.#.Compared with the blank group.*.Compared with themodel group.&.Compared with themetformin group.

組別（Groups) 0周（0 week) 2周（2 weeks) 4周（4 weeks)模型組（Model group) 4.45±0.32#4.63±0.16 4.97±0.37兩色金雞菊醇提物高劑量組（Hight dose group) 4.38±0.51#4.16±0.32**4.44±0.16*兩色金雞菊醇提物中劑量組（Moderate dose group) 4.44±0.26#4.71±0.12 4.46±0.29*二甲雙胍對照組（Metformin group) 4.30±0.45#4.46±0.05*4.46±0.47*空白對照組（Blank group) 4.80±0.13 4.53±0.40*4.55±0.35*

圖1 球形梭菌熒光定量PCR檢測圖Fig.1 Quantitative real-time PCR detection of Clostridium coccoides

圖2 多形擬桿菌熒光定量PCR檢測圖Fig.2 Quantitative real-time PCR detection of Bacteroides thetaiotaomicron

圖3 四組樣本中球形梭菌（A)、多形擬桿菌（B)水平與空腹血糖水平的相關(guān)性Fig.3 The correlation of Clostridium coccoides（A)and Bacteroides thetaiotaomicron（B)with fasting glucose level in the four groups.

3 討論

實(shí)時熒光定量PCR（RTFQ-PCR)是20世紀(jì)90年代推出的技術(shù)，其利用染料和雙鏈DNA結(jié)合，在PCR反應(yīng)過程中熒光信號的改變來進(jìn)行定量。相對于傳統(tǒng)的菌群檢測方法，RTFQ-PCR具有更高的靈敏度及特異度，并且操作簡單快速，近年來已逐步成為檢測菌群的主要手段。

本研究針對腸道菌群中球形梭菌和擬桿菌，進(jìn)行RTFQ-PCR檢測，比較各組之間小鼠腸道菌群表達(dá)的差異，得出以下結(jié)果:①與正常組比較，模型組中球形梭菌與多形擬桿菌水平均增高。②兩色金雞菊醇提物高劑量組與模型組相比，球形梭菌與多形擬桿菌的水平下降，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。③球形梭菌水平、多形擬桿菌水平均與FBG水平呈正相關(guān)。

球形梭菌是腸道內(nèi)最為常見的類群之一。研究表明，這個類群的大部分細(xì)菌能幫助宿主從飲食中吸收能量，從而與肥胖、糖尿病代謝性疾病的發(fā)生相關(guān)[16］。厚壁菌門具有降解人體所不能降解的多糖進(jìn)而為人體提供能量的作用。Gordon等[17］也發(fā)現(xiàn)的肥胖人群中腸道球形梭菌增多并提示其與能量代謝有一定關(guān)系。同時多形擬桿菌也有降解多糖的能力，提高人體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用[18］。張麗萍等[19］的研究顯示，多形擬桿菌可使宿主更為高效的吸收糖。同時Nadja等的研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者和正?；颊呦啾?，其擬桿菌水平與血糖呈正相關(guān)，即血糖水平隨擬桿菌數(shù)量的增高而增高[20］。在這基礎(chǔ)之上，謝婧雯等[21］的研究也初步提示，多形擬桿菌與血糖水平存在正相關(guān)。以上的研究得到的成果與本實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論相似。

兩色金雞菊作為新疆地方特色藥物，其藥用價值正在被逐漸發(fā)現(xiàn)，近年來越來越多的研究提示，兩色金雞菊具有降糖作用[14，22-24］，其機(jī)制可能與其抑制α-葡萄糖苷酶有關(guān)，但目前尚未明確，故本研究擬通過其對腸道菌群的影響發(fā)現(xiàn)其可能的藥理機(jī)制。在本研究中，通過對兩色金雞菊醇提物高劑量組與其他各組之間多形擬桿菌、球形梭菌水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn):兩色金雞菊醇提物干預(yù)組多形擬桿菌、球形梭菌水平較模型組表達(dá)均下降，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但與正常對照組及二甲雙胍陽性對照組并無差異，這可能提示著，兩色金雞菊醇提物對腸道菌群具有一定的保護(hù)作用，是其趨于正常。同時，與當(dāng)今主流降糖藥物二甲雙胍作對比，并沒有發(fā)現(xiàn)其具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（給藥4周)，表明其降糖效果及對腸道菌群的影響與二甲雙胍類似，證明其功效在一定程度上可信。與此同時，發(fā)現(xiàn)菌群表達(dá)水平與血糖高低存在正相關(guān)性。可能提示，菌群數(shù)量的改變與血糖升高程度有一定的相關(guān)因素，但尚不能明確。

通過上述的研究，可以做出初步推斷即兩色金雞菊醇提物對于T2DM小鼠具有一定的降糖功效，其功能的實(shí)現(xiàn)可能與其對腸道菌群表達(dá)水平的影響存在著一定的聯(lián)系，可能的機(jī)制為保護(hù)了腸道益生菌并抑制有害菌的表達(dá)水平。具體機(jī)制的確定以待進(jìn)一步研究證明，課題組將繼續(xù)以腸道菌群為突破口，研究其具體的藥理機(jī)制。

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Effect of alcohol extract of Coreopsis tinctoria Nutt on intestinal flora in tjpe 2 diabetic m ice

ZHANG Kai-nan1，LONG Mei2，RAN Xin-jian2，YANG Ying1，TONG Lei1，LIQing-cheng1，XIONG Jian-hui3，MAO Xin-min4，TAO Liang3，LILin-lin3*
（1.The Clinical Medical School，2.Central Laboratory of Functional Activities，3.Department of Pharmacology，4.The School of Traditional Chinese Medicine，Xinjiang Medical University，Urumchi830054，China)

ObjectiveTo study the differences in intestinal flora of normal and type 2 diabetic mice，the effect of alcoholic extractof Coreopsis tinctoria Nuttonmouse intestinal flora，and explore the possible relationship between alcoholic extract of Coreopsis tinctoria Nutt，intestinal flora and type 2 diabetesmellitus（T2DM)inmice.MethodsStool samples were collected from the normal control group（A)，high dose（1.8 g/kg)（B)and moderate dose（1.2 g/kg)（C)alcoholic extract of Coreopsis tinctoria Nuttmodel groups，metformin（0.2 g/kg)treatment group（D)and blank control（E) group.16S rDNA real-time quantitative PCR assay was used to determine the levels of Clostridium coccoides and Bacteroides thetaiotaomicron in the stool samples.Pearson analysismethod was used to analyze the correlation between the levels of target bacterial species and the fasting blood glucose（FBG)in the mice.Results1.Compared with the normal control group，the levels of Clostridium coccoides and Bacteroides thetaiotaomicron in the T2DM model group were significantly lowered（P=0.017，P=0.002).2.Compared with themodel group，the levels of Clostridium coccoides and Bacteroides thetaiotaomicron of the high dose Coreopsis tinctoria Nutt alcohol extract group were significantly different（2 weeks:P = 0.027，P=0.006；4 weeks:P=0.007，P=0.012).3.The levels of Clostridium coccoides and Bacteroides thetaiotaomi-cron were positively correlated with the FBG level in themice.ConclusionsThe alcohol extract of Coreopsis tinctoria Nutt has certain effect on the intestinal flora in type 2 diabeticmice and there is certain correlation between the effect of alcohol extract of Coreopsis tinctoria Nutt and their blood glucose level.

Clostridium coccoides；Bacteroides thetaiotaomicron；Type 2 diabetesmellitus:Real-time PCR

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0628-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.016

2015-06-16

新疆創(chuàng)新藥物臨床前藥效學(xué)評價技術(shù)平臺建設(shè)（201233150)；SRTP（20140760002)。

張凱楠（1991-)，男，從事糖尿病藥理研究，Tel:15699220218，E-mail:296177817@qq.com。

李琳琳，教授，郵箱:yz-lll@vip.sina.com，研究方向:糖尿病藥理。