趙二義，賈延吉力，王帶媚，文國強，關文娟，景黎君，鄧益東△

(1.海南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，海口 570311;2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450052)

骨髓間充質(zhì)干細胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)可向多種細胞分化，在細胞轉(zhuǎn)向分化的過程中可能存在多條信號通路，如Notch、Sox、Wnt等通路通過信號聯(lián)系網(wǎng)絡，啟動信號重組、整合后，引領分化方向。核因子-κB(nuclear factor-kappa B)是細胞增殖與凋亡的重要調(diào)控因子，通過結(jié)合特異性序列調(diào)控多種基因的表達。p65蛋白是其重要的亞單位，由p65基因在細胞核內(nèi)表達后轉(zhuǎn)移至胞漿內(nèi)，與另一個核因子-κB亞單位p50結(jié)合成p50/p65異源二聚體，胞漿內(nèi)的 NF-κB抑制蛋白(IκB)與p50/p65結(jié)合，而抑制NF-κB活性。研究表明，NF-κB信號參與調(diào)控神經(jīng)干細胞(neural stem Cell，NSCs)增殖、分化及凋亡等命運［1］，在 MSCs向神經(jīng)元分化過程中，NF-κB 核移位受抑制［2］，而 MSCs與NSCs具有許多相似性，因此，理論上NF-κB信號也可能參與MSCs增殖、分化及凋亡調(diào)控。然而，目前采用RNAi技術下調(diào)NF-κB信號通路中的p65亞單位來研究其對MSCs增殖、分化的影響尚無相關報道。本研究初步探討RNAi靶向抑制p65基因，對MSCs的增殖、分化及凋亡的影響，并研究MSCs向神經(jīng)元分化的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

由海南省中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院實驗動物中心提供2～3月齡健康的Wistar大鼠，雌雄不限，體重150～250g，飼養(yǎng)條件符合清潔級標準，實驗對動物的處理方法符合中華人民共和國科學技術部頒發(fā)的《關于善待實驗動物的指導性意見》標準。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(美國Gibco公司);兔抗大鼠p65、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)元微管結(jié)合蛋白(MAP-2)和膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白(GFAP)等多克隆抗體(美國Santa Cruz公司);FITC熒光標記的山羊抗兔IgG(H+L)(上海碧云天公司);自 Qiagen公司采購大鼠的 Rn-p65-siRNA、Cy3標記的陰性對照Negative Control siRNA、轉(zhuǎn)染試劑HiPerFect;RNeasy Mini試劑盒及QIAGEN OneStep RT-PCR試劑盒;四甲基偶氮唑鹽(MTT)(美國Sigma公司);法舒地爾(天津紅日藥業(yè)股份有限公司);胰蛋白酶等實驗試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。由上海生物工程公司根據(jù)設計合成大鼠的p65及β-actin引物，序列見表1。

Tab.1 Sequences for primer

1.3 MSCs培養(yǎng)及分組

取Wistar大鼠，頸椎脫臼處死后，75%乙醇浸泡5 min，在無菌條件環(huán)境中分離大鼠兩側(cè)股骨，剪開股骨兩端，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔，用1 ml無菌注射器反復吹打，制成細胞懸液，以2×106cells/ml的細胞密度直接種于25 cm2的塑料培養(yǎng)瓶中，放置在37°C、50ml/L的CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待貼壁細胞完全融合后，以含0.04%EDTA/0.25%胰蛋白酶消化傳代，按1×105cells/ml的密度接種。每隔72 h換液，連續(xù)傳代培養(yǎng)至少6代以上，隨后將MSCs細胞懸液凍存在液氮中備用。取培養(yǎng)第6代以上的MSCs復蘇后，用完全培養(yǎng)基(DMEM+15%胎牛血清+谷氨酰胺0.5 mol/L)充分沉淀混勻MSCs后，按每孔接種2×106個細胞至12孔培養(yǎng)板，放置在37°C、50ml/L的CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3 d，選擇細胞融合度達50%～70%時進行轉(zhuǎn)染，效果最佳。將培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞分為未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染組及陰性對照組3組，6孔/組。

1.4 siRNA轉(zhuǎn)染MSCs

參照本室的實驗方法［3］，MSCs的融合度達50% ～70%，參照Qiagen公司的細胞轉(zhuǎn)染實驗操作步驟，轉(zhuǎn)染細胞。具體操作方法如下:吸取培養(yǎng)基1100μl(DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+雙抗)加入培養(yǎng)板中，置于37°C、50ml/L的CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。同時，分別吸取 DMEM培養(yǎng)基100μl溶解300ng Rn-p65-siRNA 和 negative control siRNA，再吸取HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑6μl，充分混勻;置于室溫孵育10min;再將轉(zhuǎn)染復合物均勻加入含MSCs孔中，每孔中的siRNA的濃度要達到20nmol/L，放置在37°C、50ml/L的CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24～72 h。未轉(zhuǎn)染組不轉(zhuǎn)染siRNA，其培養(yǎng)條件與轉(zhuǎn)染組及陰性對照組相同。Cy3標記的陰性對照Negative Control siRNA轉(zhuǎn)染24h、48 h、72 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察MSCs的熒光表達，評價細胞轉(zhuǎn)染效率。

1.5 siRNA轉(zhuǎn)染MSCs后檢測

1.5.1 四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法 采用MTT比色檢測法，將各組的MSCs根據(jù)轉(zhuǎn)染前、后各個相同時間點，均勻移入96孔板，每孔加入50μl MTT(5.0mg/ml)，置于37°C、50ml/L 的 CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 4h，每孔再加入 200μl二甲基亞砜(DSMO)，繼續(xù)孵育至結(jié)晶崩解，取空白孔調(diào)零，利用酶標儀測定每個孔的吸光度值(波長490nm)，細胞存活率=細胞組A均值/空白組 A均值 ×100%。

1.5.2 RT-PCR法 利用RNeasy Mini試劑盒提取各實驗組的MSCs的RNA，運用RT-PCR檢測實驗組MSCs內(nèi)p65 mRNA表達變化情況。按照QIAGEN?OneStep RT-PCR試劑盒的操作步驟行RTPCR，50μl反應體系，10μl 5 × Buffer，2μl dNTP Mix，2μl QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix，10μl 5 × Q-Solution，10U RNase inhibitor，1.0μg RNA，0.6μmol/L引物。擴增參數(shù):50℃逆轉(zhuǎn)錄30min，95℃生成15 min，94℃變性1 min，58℃ 退火1 min，72℃ 延伸1 min，總共進行30～35個循環(huán)，再72℃延伸10min。吸取10μl RT-PCR 產(chǎn)物 +2.0μl樣緩沖液，滴入2%瓊脂糖凝膠上行電泳，通過自動凝膠成像系統(tǒng)，將電泳結(jié)果拍攝保存，分析各目的基因與β-actin基因條帶光度值。

1.5.3 Western blot印跡 取各組的MSCs，用100μl細胞裂解液裂解、變性、離心，留取上清蛋白質(zhì)標本，利用分光光度法對蛋白質(zhì)進行定量分析。取蛋白裂解液加凝膠緩沖液進行SDS-PAGE膠電泳，電泳之后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。取出膜后在室溫條件下用封閉液(山羊血清)封閉3 h，然后加入一抗p65蛋白兔抗多克隆抗體(工作濃度分別為1∶200～300)，4℃孵育過夜，二抗(工作濃度為1∶10000)，37℃孵育60～120min，DAB 顯色檢測棕黃色條帶。結(jié)果轉(zhuǎn)膜后麗春紅染色進行校正，照相記錄結(jié)果，Quantity One軟件分析圖片灰度值。

1.6 體外誘導MSCs分化為神經(jīng)元

1.6.1 誘導方法 按照前期實驗的細胞誘導法［4］，將各實驗組培養(yǎng)72 h后的MSCs行誘導實驗。用D-Hank’s液清洗 MSCs 3遍，加誘導液(由DMEM液體培養(yǎng)基+10%胎牛血清+200μmol/l法舒地爾混勻調(diào)制)，置于37°C、50ml/L的CO2的條件下誘導6 h。將MSCs置于倒置顯微鏡下觀察誘導前后細胞形態(tài)學演變。采取細胞免疫組化法檢測誘導前后神經(jīng)元特異蛋白NSE、MAP-2、GFAP的變化。

1.6.2 細胞形態(tài)學觀察 倒置顯微鏡下動態(tài)觀察MSCs誘導分化前后形態(tài)學變化

1.6.3 細胞免疫組化染色法 用PBS清洗各組細胞，隨后取4%多聚甲醛的固定液在4℃環(huán)境中固定20min，0.2%Triton X-100處理 10min，封閉液(10%胎牛血清)封閉1 h。分別使用一抗兔抗p65多克隆抗體(2μg/ml)、兔抗 NSE多克隆抗體(1μg/ml)、兔抗 MAP-2多克隆抗體(1μg/ml)及兔抗GFAP 多克隆抗體(1μg/ml)，4℃ 孵育 24h。取PBS清洗3次后，在室溫條件下用FITC標記的山羊抗兔IgG(1∶500)行染色標記、觀察。利用倒置熒光顯微鏡拍攝(×200)細胞圖像。各組均采集≥30個區(qū)域的細胞。盡量保證明視野下所采集的每張圖像都含相同的細胞數(shù)。采取雙人雙盲法隨機統(tǒng)計陽性細胞百分比例。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 siRNA轉(zhuǎn)染MSCs

2.1.1 熒光觀察 Cy3標記的negative control siRNA對照組MSCs熒光表達，隨著轉(zhuǎn)染時間延長，熒光表達逐漸增強。轉(zhuǎn)染MSCs 24h開始出現(xiàn)部分紅色熒光，轉(zhuǎn)染率為28.2% ±4.3%;48 h后熒光表達明顯增多，轉(zhuǎn)染率為63.5% ±3.4%;72 h后熒光表達最強，轉(zhuǎn)染率可達83.3% ±3.8%(圖1A、B及C)。

2.1.2 各組MSCs存活率變化 MTT結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染前各組細胞存活率無統(tǒng)計學意義，轉(zhuǎn)染后24h，Rn-p65-siRNA轉(zhuǎn)染組MSCs的存活率顯著下降，與未轉(zhuǎn)染組及陰性對照組MSCs比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染48 h和72 h后存活率雖然較24h有所上升(P＜0.05)，但仍明顯低于未轉(zhuǎn)染組及陰性對照組MSCs，與未轉(zhuǎn)染組及陰性對照組的MSCs的MTT比較仍有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，表2)。

2.1.3 各組MSCs的p65 mRNA的表達變化 RTPCR結(jié)果顯示，各組的MSCs轉(zhuǎn)染前均可見p65 mRNA表達;轉(zhuǎn)染24h后，Rn-p65-siRNA轉(zhuǎn)染組的MSCs表達p65 mRNA開始顯著減少，持續(xù)至72 h;與此同時，未轉(zhuǎn)染組及陰性對照組p65 mRNA表達無明顯變化(表3)。

2.1.4 各組MSCs的p65蛋白表達的變化 Western blot印跡檢測顯示，轉(zhuǎn)染前各組均可見p65蛋白表達，轉(zhuǎn)染24h p65蛋白下降，以轉(zhuǎn)染72 h最顯著;未轉(zhuǎn)染組和陰性對照組中無此現(xiàn)象(表4)。

2.2 體外誘導MSCs分化為神經(jīng)元

2.2.1 細胞形態(tài)觀察 未轉(zhuǎn)染組及陰性對照組MSCs向神經(jīng)元分化速度較慢，誘導2～3 h細胞胞體開始收縮，呈錐形，折光性差，誘導4～5 h后部分細胞胞體收縮成圓形或多角形，部分胞體可觀察到光暈，突起細長，部分細胞的突起交織成網(wǎng)絡。Rnp65-siRNA轉(zhuǎn)染組MSCs向神經(jīng)元分化速度快，誘導1 h后胞體開始收縮，細胞間隙拉大，可見粗大突起，少部分交織成網(wǎng)，誘導2～3 h后，絕大多數(shù)細胞胞體收縮成圓形或錐形，立體感強，可見細長的細胞突起，部分交織成網(wǎng)絡結(jié)構，可見少許細胞脫落、死亡。誘導6 h后，可見神經(jīng)元樣細胞明顯增多，形成典型神經(jīng)網(wǎng)絡(圖2A)。

2.2.2 各組神經(jīng)元蛋白表達的變化 細胞免疫組化染色法誘導6 h后各組神經(jīng)元蛋白表達結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組及陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染組蛋白表達顯著的增高(P＜0.05);未轉(zhuǎn)染組、陰性對照組及轉(zhuǎn)染組的GFAP表達率均小于1%，無顯著性差異。與未轉(zhuǎn)染組及陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染組P65的表達 顯著下降(P＜0.01，表5，圖2B、C、D、E)。

Tab.2 Values of MTT in each set of MSCs(%，，n=10)

Tab.2 Values of MTT in each set of MSCs(%，，n=10)

*P＜0.05 vs non-transfected group;#P＜0.05 vs negative control group

?

Tab.3 Values of p65 mRNA in each set of MSCs(，n=10)

Tab.3 Values of p65 mRNA in each set of MSCs(，n=10)

*P＜0.05 vs non-transfected group;#P＜0.05 vs negative control group

?

Tab.4 The values of p65 protein in each set of MSCs(，n=10)

Tab.4 The values of p65 protein in each set of MSCs(，n=10)

*P＜0.05 vs non-transfected group;#P＜0.05 vs negative control group

?

Tab.5 Results of immunocytochemistry staining in each group 6 h after induction(%，，n=10)

Tab.5 Results of immunocytochemistry staining in each group 6 h after induction(%，，n=10)

NSE:Neuron-specific enolase;MAP-2:Neuronal microtubule-associated protein-2;GFAP:Glial cells fibrillar acidic protein*P＜0.05 vs non-transfected group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs negative control group

Group NSE MAP-2 GFAP P65 Non-transfected 62.0±1.3 60.2±2.5 ＜1 61.2±2.3 Negative control 61.3±0.5 60.6±1.8 ＜1 60.5±1.8 Transfected 83.5±1.2*#81.2±2.2*# ＜1 32.8±4.2＊＊##

Fig.1 Fluorescence expressed on MSCS tranfected by Cy3 labeled negative control siRNA(bar=100μm)

Fig.2 Induce MSCs of transfected group into neurons expression of NSE and MAP-2(6 h after induction，bar=100μm)

3 討論

MSCs是一種具多種分化潛能的細胞，可向成骨細胞、脂肪細胞、胰島細胞及神經(jīng)元等細胞分化。研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞在神經(jīng)損傷、修復過程具有保護作用，可能機制包括可向神經(jīng)元分化，分泌相關神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進血管再生及抑制免疫反應［5］。Notch、Rho 和 mTOR 信號通路參與調(diào)節(jié)MSCs向神經(jīng)元分化進程，適度調(diào)節(jié)信號通路活性，可提高 MSCs向神經(jīng)元分化效率［4，6］，在 MSCs向神經(jīng)元分化中可能牽涉多條信號重組、整合及引導分化方向，反映MSCs分化機制的復雜性。有研究發(fā)現(xiàn)MSCs向神經(jīng)細胞分化過程中，伴隨NF-κB核轉(zhuǎn)位受抑制［2］，據(jù)此，推測 NF-κB 信號可能在 MSCs增殖、凋亡、分化等生命活動中起著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Rn-p65-siRNA，MSCs的p65 mRNA表達逐漸減少，當轉(zhuǎn)染72 h，p65基因沉默率最高，p65蛋白表達最弱，與轉(zhuǎn)染Cy3標志negative control siRNA轉(zhuǎn)染72 h熒光表達最強基本一致，這提示轉(zhuǎn)染72 h后，NF-κB信號最弱，是MSCs誘導分化最理想時機。因此，本研究選擇在轉(zhuǎn)染72 h后，選取各組細胞進行誘導分化，研究NF-κB信號在調(diào)控細胞分化的作用。轉(zhuǎn)染Rn-p65-siRNA后，p65蛋白表達減弱，提示 NF-κB信號抑制，且 MTT檢測發(fā)現(xiàn) MSCs的凋亡率逐漸增加，72 h后凋亡率最高，與其它實驗組比較有顯著統(tǒng)計學意義，結(jié)果與NF-κB受抑制后神經(jīng)干細胞凋亡增加現(xiàn)象類似［7］。MSCs凋亡率增高的可能機制:(1)NF-kB信號受抑制后抗凋亡基因表達下調(diào)，細胞抗凋亡作用減弱。(2)NF-κB信號受抑制導致細胞周期蛋白D1表達減少，引起細胞增殖能力下降。因此，推測 NF-κB信號在MSCs增殖、凋亡等命運其中重要作用。

神經(jīng)干細胞分化涉及到信號級聯(lián)反應，不同的轉(zhuǎn)錄因子的活化，決定細胞分化的方向，已有研究發(fā)現(xiàn)白介素-6(IL-6)及睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子介導激活NF-κB通路，可促進神經(jīng)干細胞向星形膠質(zhì)細胞分化［8］。相反，在成神經(jīng)瘤細胞誘導分化的研究中發(fā)現(xiàn)，胞核內(nèi)的NF-κB信號傳導受抑制可抑制神經(jīng)分化［9］。在腦室下層神經(jīng)干細胞研究中發(fā)現(xiàn)，骨形成蛋白可促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化，骨形成蛋白信號介導的神經(jīng)干細胞分化具有劑量依賴性，而NF-κB可以正向調(diào)節(jié)骨形成蛋白［10］，提示神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化過程非常復雜，可能牽涉到多種細胞因子共同作用，但對NF-κB信號在MSCs向神經(jīng)元分化的機制了解較少。本研究采取小RNA干擾技術，轉(zhuǎn)染Rn-p65-siRNA，阻斷NF-κB信號通路，并采用法舒地爾誘導細胞分化，觀察細胞分化效率。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組MSCs誘導后細胞可高表達NSE、MAP-2，但表達 GFAP很少。結(jié)果表明阻斷NF-κB信號后，MSCs向神經(jīng)元分化效率顯著增高，而未轉(zhuǎn)染組及陰性對照組MSCs未觀察到此現(xiàn)象，因此，推測MSCs分化過程中也可能涉及多種轉(zhuǎn)錄因子作用，多個信號級聯(lián)反應，啟動MSCs分化方向，而其中抑制NF-κB信號可能更有利MSCs向神經(jīng)元方向分化，可能存在以下原因:(1)法舒地爾可能通過抑制Rho/ROCK通路，啟動間充質(zhì)干細胞分化進程，調(diào)節(jié)細胞骨架形成［11］;阻斷NF-κB 信號，抑制細胞向膠質(zhì)細胞分化［8］。因此，聯(lián)合抑制 Rho/ROCK和NF-κB信號，可從不同信號級聯(lián)反應途徑促進MSCs向神經(jīng)元方向分化。(2)NF-κB信號與Rho/ROCK信號可能存在協(xié)同作用(cross-talk):1)本實驗中發(fā)現(xiàn)抑制NF-κB信號并沒有引起MSCs向神經(jīng)元樣細胞分化，但加入法舒地爾誘導后，MSCs可以向神經(jīng)元樣細胞高效分化;2)在小鼠單核巨噬細胞實驗中，顯示NF-κB與RhoA GTP酶存在協(xié)同作用［12］;3)卵巢腫瘤細胞實驗中發(fā)現(xiàn)Rho激酶抑制劑可抑制NF-κB信號［13］。據(jù)此推測這兩條不同的信號途徑之間可能存在協(xié)同作用，通過抑制Rho/ROCK信號傳導，可能從旁側(cè)途徑調(diào)節(jié)NF-κB信號，從而更有利于MSCs向神經(jīng)元分化。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)NF-κB信號參與大鼠MSCs的增殖、凋亡及分化等生命活動，抑制p65基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)p65蛋白表達，阻斷NF-κB信號傳導，有利于提高MSCs向神經(jīng)元樣細胞分化效率。

［1］Widera D，Mikenberg I，Kaltschmidt B，et al.Potential role of NF-kB in adult neural stem cells:the underrated steersman［J］.Int J Dev Neurosci，2006，24(2-3):91-102.

［2］楊 琴，賈延吉力，楊 軍，等.核因子-kB在黃芩甙誘導大鼠骨髓基質(zhì)細胞分化為神經(jīng)細胞中的作用［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，25(3):248-251.

［3］王留東，趙二義，賈延吉力，等.Caveolin-1在大鼠骨髓間質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)細胞中的作用［J］.中國病理生理雜志，2010，26(7):1385-1389

［4］趙二義，王留東，賈延吉力，等.Notch信號在鹽酸法舒地爾誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元分化過程中的作用［J］.中國應用生理學雜志，2010，26(4):248-251.

［5］王昌銘，滕軍放，王景周，等.頸內(nèi)動脈輸注骨髓間充質(zhì)干細胞對血管性癡呆大鼠血清NSE和S-100蛋白含量的影響及意義［J］.中華神經(jīng)醫(yī)學雜志，2014，13(2):125-130.

［6］張廣宇，王翠琴，賈延吉力，等.自噬在大鼠骨髓間質(zhì)干細胞神經(jīng)分化過程中的作用［J］.中國應用生理學雜志，2013，29(5):389-394.

［7］Mincheva-Tasheva S，Soler RM.NF-κB signaling pathways:role in nervous system physiology and pathology［J］.Neuroscientist，2013，19(2):175-194.

［8］Mondal D，Pradhan L，LaRussa VF.Signal transduction pathways involved in the lineage differentiation of NSCs:can the knowledge gained from blood be used in the brain［J］.Cancer Invest，2004，22(6):925-943.

［9］Fan Z，Bau B，Yang H，et al.IL-1β induction of IL-6 and LIF in normal articular human chondrocytes involves the ERK，p38 and NF-κB signaling pathways［J］.Cytokine，2004，28(1):17-24.

［10］Feng Z，Porter AG.NF-κB/Rel proteins are required for neuronal differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells［J］.J Biol Chem，1999，274(43):30341-30344.

［11］Lim HS，Joe YA.A ROCK inhibitor blocks the inhibitory effect of chondroitin sulfate proteoglycan on morphological changes of mesenchymal stromal/stem cells into neuron-like cells［J］.Biomol Ther(Seoul)，2013，21(6):447-453.

［12］Kim HJ，Kim JG，Moon MY，et al.IκB kinase γ/nuclear factor-κB-essential modulator(IKKγ/NEMO)facilitates RhoA GTPase activation，which，in turn，activates Rho-associated KINASE(ROCK)to phosphorylate IKKβ in response to transforming growth factor(TGF)-β1 ［J］.J Biol Chem，2014，289(3):1429-1440.

［13］Jeong KJ，Park SY，Cho KH，et al.The Rho/ROCK pathway for lysophosphatidic acid-induced proteolytic enzyme expression and ovarian cancer cell invasion ［J］.Oncogene，2012，31(39):4279-4289.