石婷婷曹 崗岳顯可

·藥學(xué)園地·

響應(yīng)曲面優(yōu)化蛤蟆油中核苷類成分尿嘧啶提取條件

石婷婷1曹 崗2岳顯可2

蛤蟆油；響應(yīng)曲面法；尿嘧啶；提取工藝

哈蟆油（oviductus ranae）為蛙科動物中國林蛙（rana temporaria chensinensis，David）雌蛙輸卵管經(jīng)采制干燥而得，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，并被列為上品?！侗静菥V目》中稱之“山哈”，別名哈士蟆油、哈蟆、雪蛤，富有滋補(bǔ)“軟黃金”的美譽(yù)[1－2]。蛤蟆油成分復(fù)雜，含有多種氨基酸、不飽和脂肪酸、激素類和磷酯類成分。

據(jù)報道，尿嘧啶等生物堿類成分具有干擾病毒DNA、RNA的復(fù)制從而抑制病毒增殖，起到保護(hù)細(xì)胞免受病毒損害的作用[3－4]，對二磷腺苷（ADP）誘導(dǎo)的家兔血小板聚集也有顯著的抑制作用[5－6]。影響蛤蟆油核苷類成分提取率的因素很多，如提取溶劑、提取溫度、提取時間、料液比等，常規(guī)提取工藝不能全面展示各因素間的相互影響，實(shí)際操作過程中造成蛤蟆油大量損失。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法對蛤蟆油中核苷類成分尿嘧啶的提取溶劑、提取時間、液料比三因素的三個水平進(jìn)行中心組合試驗(yàn)研究，分析得出尿嘧啶最佳提取工藝參數(shù)，為蛤蟆油中尿嘧啶及其他核苷類成分的提取提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀 器 Ultimate3000型高效液相色譜儀（美國戴安公司）；梅特勒XS－105電子分析天平（0.01 mg，METTLER TOLEDO，Switzerland）；KS－80中草藥粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）；R－201恒溫水浴鍋（上海申生科技有限公司）。

1.2 試 藥 蛤蟆油購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司。尿嘧啶（批號100469－201302）購自中國藥品生物制品鑒定所。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取尿嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品（批號100469－201302，含量：99.6%）7.10 mg，用甲醇定容至50mL。移取上述試液10.0mL。重新定容至20.0mL，即標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 色譜條件 島津Inertsil ODS－SP Extend C18（250mm×4.6mm，5.0μm）柱，二極管陣列檢測器（DAD），以甲醇（A）－水溶液（B）為流動相梯度洗脫，0～10min，1%～5%A；10～15min，5%～15%A；15～20min，15%～20%A；20～30min，20%A；30～35min，20%～35%A；35～40min，35%～1%A；流速1mL/min，柱溫30℃，檢測波長230nm；進(jìn)樣量為10μL。

2 結(jié)果

2.1 蛤蟆油中尿嘧啶提供工藝單因素試驗(yàn)

2.1.1 甲醇濃度對尿嘧啶提取量的影響 以加熱時間60min，加熱溫度60℃，料液比1∶40為條件，分別以甲醇體積分?jǐn)?shù)為0、20%、40%、60%、80%、100%進(jìn)行提取，考察甲醇體積分?jǐn)?shù)對蛤蟆油中尿嘧啶提取量的影響。結(jié)果顯示純水作為溶劑，尿嘧啶提取量最高，故選擇純水作為蛤蟆油提取溶劑。見圖1。

圖1 甲醇體積分?jǐn)?shù)對蛤蟆油中尿嘧啶提取量的影響

2.1.2 加熱溫度對蛤蟆油中尿嘧啶提取量的影響以水為提取溶劑，加熱時間60min，料液比1∶40為條件，分別以40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃進(jìn)行提取，尿嘧啶提取量為 18.10、17.76、17.39、17.95、17.09、16.83μg/g。所以溫度對尿嘧啶提取沒有明顯差異，下面試驗(yàn)40℃為提取溫度。

2.1.3 加熱時間對蛤蟆油尿嘧啶提取量的影響 以水為提取溶劑，加熱溫度40℃，料液比1∶40為條件，分別加熱15、30、60、90、120、150min進(jìn)行提取，考察加熱取時間對蛤蟆油中尿嘧啶提取量的影響。結(jié)果表明，加熱60min，蛤蟆油尿嘧啶提取量最高，見圖2。

圖2 加熱時間對蛤蟆油尿嘧啶提取量的影響

2.1.4 料液比對蛤蟆油中尿嘧啶提取量的影響 以水為提取溶劑，加熱溫度40℃，分別以料液比1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80加熱提取60min，考察液料比對蛤蟆油中尿嘧啶提取量的影響。結(jié)果顯示，料比為1:70時尿嘧啶提取量最高，見圖3。

圖3 加熱時間對蛤蟆油尿嘧啶提取量的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計 根據(jù)中心組合設(shè)計原理，結(jié)合響應(yīng)面分析方法，以甲醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和熱浸時間三個因素為自變量，以尿嘧啶得率為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平共17個試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。其中，14個為析因試驗(yàn)，3個為中心試驗(yàn)。甲醇體積分?jǐn)?shù)、熱浸時間、料液比編碼：X1=（x1－20）/ 20，X2=（1/x2－60）/30，X3=（x3－60）/10。

2.3 響應(yīng)曲面法試驗(yàn)方案及結(jié)果分析 在單因素條件的基礎(chǔ)上。采用響應(yīng)曲面法優(yōu)選蛤蟆油尿嘧啶的提取工藝。通過擬合二次方程.計算最優(yōu)工藝組合以及尿嘧啶最大理論提取量。利用Design－Expert 8.0.5b軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面分析。以尿嘧啶的提取量為指標(biāo)，考察40℃條件下甲醇體積分?jǐn)?shù)、加熱時間以及料液比對尿嘧啶提取量的影響。響應(yīng)曲面因素與水平見表1。實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計與響應(yīng)值結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)曲面因素與水平表

由表3可知，由模型擬合得到的回歸方程P＜0.0001?？膳卸憫?yīng)值與全體自變量變化關(guān)系為顯著相關(guān)。模型對應(yīng)同歸方程Y=15.85－26.74X1－0.16X2＋1.51X3＋0.38X1X2－1.05X1X3－0.070X2X3＋22.21X12＋0.15X22＋0.69X32。

表2 響應(yīng)曲面設(shè)計方案以及相應(yīng)值

表3 響應(yīng)曲面方差分析表

各項對響應(yīng)值影響作用次序?yàn)樘崛∪軇玖弦罕龋咎崛r間。交互項X1X3與其它響應(yīng)值相比，對響應(yīng)值影響最大。提取溶劑和料液比相互作用示意圖見圖4。使用Design－Expert8.0.5b軟件得到最優(yōu)提取工藝為：在甲醇體積分?jǐn)?shù)為0（即為純水提?。訜釙r間30min，料液比1:69.99（g/mL）條件下，蛤蟆油尿嘧啶獲得量預(yù)測值為68.7925μg/g。驗(yàn)證實(shí)測值為68.73μg/g，接近預(yù)測值，誤差為0.39%。說明該工藝穩(wěn)定、可行。

圖4 甲醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對尿嘧啶得率影響的響應(yīng)曲面圖

3 討論

哈蟆油在我國的藥用歷史悠久，具有補(bǔ)腎益精、健脾益胃、滋陰補(bǔ)腎、潤肺生津等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，其對體弱氣虛、精力耗損、記憶力不佳、神經(jīng)衰弱等療效較好[4]。

本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法考察提取溶劑、加熱時間和料液比對蛤蟆油尿嘧啶提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，得到最佳提取條件為：以水為提取溶劑，液料比1∶69.99（g/mL），加熱時間30min，蛤蟆油尿嘧啶得率最高。

［1］姜大成，肖井雷.中國林蛙與蛤蟆油［M］.長春：吉林科學(xué)技術(shù)出版社，2006：10-12.

［2］梁磊，張緒慧，周毅，等.哈蟆油膠囊對衰老模型小鼠生殖器官的保護(hù)作用［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2008，28（6）：982-985.

［3］姚暉，王曉娟，黃莉萍，等.哈蟆油對D-半乳糖所致雄性衰老大鼠肝組織CyclinD1、CDK6和P15蛋白表達(dá)的影響［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，30（5）：1044-1046.

［4］顧紅纓，林卓，徐云，等.蛤蟆油調(diào)節(jié)小鼠細(xì)胞免疫功能的實(shí)驗(yàn)研究［J］.吉林中醫(yī)藥，2010，30（12）：1103-1104.

［5］王涵，趙雨，張梅，等.哈蟆油非水溶性成分抗疲勞保健功能研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（20）：12233-12234，12271

［6］童湘?zhèn)ィ籽渝?，鄧虹珠，?UV法測定哈蟆油中蛋白質(zhì)的含量［J］.湖南中醫(yī)雜志，2011，27（4）：128-129.

（收稿：2014-07-29 修回：2014-09-22）

1杭州市第三人民醫(yī)院中藥房（杭州 310009）；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制技術(shù)研究中心（杭州 310053）

石婷婷，Tel：15868486269；E－mail：shitingting@163.com