沈 煒屠 玨丁美紅曹靈勇

五味子對雷公藤體外生物活性影響的實驗研究

沈 煒1屠 玨2丁美紅2曹靈勇2

目的 觀察五味子與雷公藤配伍后對雷公藤體外生物活性的影響。方法 通過四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測雷公藤及雷公藤與五味子配伍后的水提液對小鼠脾淋巴細胞和L-02肝細胞增殖的影響。結(jié)果 雷公藤組0.6、3、15、75mg/mL濃度下對小鼠脾淋巴細胞增殖指數(shù)分別為（0.966±0.062）、（0.941±0.032）、（0.872±0.023）、（0.891±0.022），雷公藤加五味子組增殖指數(shù)分別為（0.900±0.053）、（0.940±0.081）、（0.963±0.015）、（0.973±0.039），兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。雷公藤加五味子組在四個實驗濃度下對L-02人肝細胞增殖率分別為（24.885±7.722）%、（42.278±17.624）%、（84.709±18.941）%、（33.754±6.045）%，雷公藤組分別為-（62.092±7.840）%、-（68.555±0.788）%、-（65.577±0.755）%、-（67.829±5.495）%，兩組各濃度L-02人肝細胞增殖率比較，P＜0.05。結(jié)論 五味子與雷公藤配伍后，在保持雷公藤體外免疫抑制活性的同時能有效降低雷公藤對肝細胞的毒性。

雷公藤；體外活性；五味子

雷公藤是臨床常用于治療免疫系統(tǒng)疾病的一味中藥，性苦味寒，有大毒，歸心、肝經(jīng)。具有祛風除濕、活血通絡(luò)、消腫止痛、殺蟲解毒之功效。雷公藤免疫抑制活性十分顯著，但其對肝、腎等組織的毒性[1-3]亦成為臨床廣泛運用的制肘。本文旨在“若有毒宜制，可用相畏相殺……”理論的指導下，借助體外細胞增殖抑制實驗，研究五味子與雷公藤配伍后的體外生物活性。

1 實驗材料

1.1 動 物 清潔級ICR小鼠10只，體質(zhì)量18～22g，由浙江中醫(yī)藥大學動物中心提供，合格證編號：2008001642633。

1.2 藥物及試劑 雷公藤飲片和五味子飲片購于浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片廠，經(jīng)鑒定為合格飲片；刀豆素A、四噻唑藍、二甲基亞砜均購自sigma公司；RPM I-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基購自美國GIBCOBRL公司；胎生牛血清購自杭州四季青生物材料研究所。

2 實驗方法

2.1 供試品溶液的制備 雷公藤水提液的制備：稱取20g雷公藤飲片，加200mL水煎煮2h，濾過，濾渣加水200mL再煎煮1h，合并濾液，常壓濃縮至每毫升含雷公藤生藥材1g。臨用時，用純化水稀釋至相應(yīng)濃度，最終每毫升培養(yǎng)基中含雷公藤生藥材0.6、3、15和75mg。

雷公藤五味子提取液的制備：稱取20g雷公藤飲片，加入800mL水，煎煮1h后加入60g五味子，共煎1h，濾過，濾渣再加800mL水煎煮1h，濾過，合并濾液，常壓濃縮至每毫升含雷公藤生藥材1g。臨用時，用純化水稀釋至相應(yīng)濃度，最終每毫升培養(yǎng)基中含雷公藤生藥材0.6、3、15和75mg。

2.2 淋巴細胞懸液的制備[4]取ICR小鼠，斷椎處死后浸泡于75%酒精中消毒10min，于超凈工作臺上取脾臟，Hank’s培養(yǎng)液（37℃）沖洗后放置培養(yǎng)皿中，將脾臟細胞捻碎后過100目尼龍篩網(wǎng)，4℃，1500rpm離心10min，棄去上清液；沉淀重懸于5mL 0.83%Tri-NH4CL溶液中靜置5min后加入含10%滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮，4℃，1500rpm離心10min，洗滌3次棄去上清液，沉淀用10%滅活FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液將細胞定容至1mL，混勻后取樣細胞計數(shù)和細胞活力檢測。

2.3 L-02人肝細胞懸液的制備[5]用含10%胎牛血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基將L-02人肝細胞于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的PRMI 1640培養(yǎng)液配成單個細胞懸液備用。

2.4 MTT法檢測水提物對小鼠脾淋巴細胞和L-02人肝細胞增殖的影響 在含培養(yǎng)基的96孔板中，每孔加入淋巴細胞混懸液100μL，conA50μL，分別加入不同濃度的雷公藤組、雷公藤加五味子組溶液50μL，空白對照組用RPMI 1640培養(yǎng)液，每組設(shè)6個復孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)72h，1500rpm離心15min，棄去上清液，每孔加入MTT（2mg/mL）50μL，37℃，5% CO2培養(yǎng)4h。1500rpm離心10min，棄去上清液，每孔加入DMSO 150μL，待全部溶解后，選擇570nm波長，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光值。應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

在含培養(yǎng)基的96孔板中，每孔加入L-02人肝細胞混懸液100μL和不同濃度的雷公藤組、雷公藤加五味子組溶液50μL，其余同小鼠脾淋巴細胞增殖檢測方法進行操作。

3 實驗結(jié)果

3.1 對小鼠脾淋巴細胞增殖作用影響 在雷公藤0.6、3、15、75mg/mL四個濃度下，兩組間的增殖抑制作用比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

3.2 對L-02人肝細胞增殖作用影響 在0.6、3、15和75mg/mL四個濃度下，雷公藤組肝細胞大量死亡，雷公藤加五味子組四個濃度下對肝細胞的增殖均具有促進作用；兩組L-02肝細胞增殖作用比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

4 討論

雷公藤親水性強的化學物質(zhì)是臨床上治療類風濕性關(guān)節(jié)炎等免疫系統(tǒng)疾病常用的組分之一，本文通過小鼠脾淋巴細胞增殖實驗，也發(fā)現(xiàn)雷公藤水提物對小鼠脾淋巴細胞增殖有很強的抑制作用，而雷公藤與五味子配伍后水提液體外免疫抑制活性與雷公藤單味藥水提液的體外免疫抑制活性相當。可以推斷五味子配伍雷公藤后對雷公藤具有免疫抑制活性的水溶性組分影響不大，但配伍后的物質(zhì)組成有待進一步研究。

表1 兩組小鼠脾淋巴細胞增殖指數(shù)比較（±s）

表1 兩組小鼠脾淋巴細胞增殖指數(shù)比較（±s）

組別雷公藤組雷公藤加五味子組孔數(shù)6 6 0.6mg/mL 0.966±0.062 0.900±0.053 3mg/mL 0.941±0.032 0.940±0.081 15mg/mL 0.872±0.023 0.963±0.015 75mg/mL 0.891±0.022 0.973±0.039

表2 兩組L-02肝臟細胞增殖作用比較（%，±s）

表2 兩組L-02肝臟細胞增殖作用比較（%，±s）

注：與雷公藤組比較，△P＜0.05

組別雷公藤組雷公藤加五味子組孔數(shù)6 6 0.6mg/mL -62.092±7.840 24.885±7.722△3mg/mL -68.555±0.788 42.278±17.624△15mg/mL -65.577±0.755 84.709±18.941△75mg/mL -67.829±5.495 33.754±6.045△

通過L-02人干細胞的增殖試驗，我們進一步驗證了雷公藤對肝臟細胞的毒性，在四個實驗濃度下，雷公藤水提物對L-02人肝細胞的增殖抑制率達到60%以上，且抑制率與雷公藤濃度之間的不存在“劑量-毒性”相關(guān)性。雷公藤與五味子配伍后，對L-02肝細胞的增殖有明顯的促進作用，說明五味子能降低雷公藤對肝細胞的體外毒性。通過文獻檢索，發(fā)現(xiàn)五味子降低雷公藤肝細胞損傷可能的作用機制有以下幾方面[6-9]：①可使肝細胞內(nèi)糖元、葡萄糖-6-磷酸酶和乳酸脫氫酶含量增加，肝細胞琥珀酸脫氫酶和ATP酶活性增強。②通過抑制炎性滲出、減少肝細胞損傷降低血清肝酶。③通過抑制肝細胞內(nèi)的細胞色素酶來抑制CYP活性發(fā)生改變。

本實驗結(jié)果顯示，雷公藤與五味子配伍后，仍然保持較強的體外免疫抑制活性，并且可以顯著降低對L-02人肝細胞的毒性，為后續(xù)研究雷公藤配伍減毒增效實驗提供了基礎(chǔ)。

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（收稿：2014-11-24 修回：2015-01-05）

In Vitro Biological Activities of Tripterygium w ilfordii Combined w ith Schisandra chinensis

SHEN Wei1,TU Jue2,DING Meihong2,CAO Lingyong2. 1Preperation Center,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Traditional Medical University,Hangzhou(310000),China;2Zhejiang Traditional Medical University,Hangzhou(310053),China

Objective To investigate the combination of Schisandra chinensis with Tripterygium wilfordii on in vitro biological activities of the latter.M ethods Four p-methyl-tetrazolium（MTT）assay was used to detect the proliferation of mouse spleen lymphocytes and human L-02 liver cells treated with extracts from Tripterygium wilfordii alone or combination of Tripterygium wilfordii and Schisandra chinensis.Results The proliferation of mouse spleen lymphocytes in Tripterygium wilfordii alone group was 0.891±0.022,0.941±0.032,0.966±0.062,and 0.966± 0.062 with dose of 0.6,3,15,75mg/mL and that in Tripterygium wilfordii combined with Schisandra chinensis group was 0.900±0.053,0.940±0.081,0.963±0.015,and 0.973±0.039,with no difference between the two groups（P＞0.05）.The proliferation rate of human L-02 liver cells in combination group with four different concentrations of Tripterygium wilfordii was（24.885±7.722）%,（42.278±17.624）%,（84.709±18.941）%,（33.754±6.045）%,which was higher than that of Tripterygium wilfordii alone group[（-62.092±7.840）%,（-68.555±0.788）%,（-65.577±0.755）,（67.829±5.495）%,P＜0.05].Conclusion Tripterygium wilfordii combined with Schisandra chinensis can hold the immunological activity of Tripterygium wilfordii in vitro while can effectively reduce the toxicity of Tripterygium wilfordii on liver cells.

mice;MTT;Schisandra chinensis;Tripterygium wilfordii;Compatibility

浙江省科技廳2012年度第二批省級重點科技創(chuàng)新團隊項目（No.2009R50042-11）

1浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院制劑中心（杭州310000）；

2浙江中醫(yī)藥大學（杭州310053）

曹靈勇，Tel：13588360581；E-mail：caolingyong@163.com