李建軍，霍光，2，唐慧娟，陳安國(guó)，黃思齊，李德芳*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所，長(zhǎng)沙410205;2.湖北省煙草公司恩施州公司，湖北恩施444500)

紅麻(Hibiscus cannabinus L.)屬于錦葵科木槿屬一年生古老而富含新概念的環(huán)保作物，作為多用途可持續(xù)利用的再生資源越來(lái)越受到關(guān)注［1］。作為紡織、造紙和生物質(zhì)能源的理想原料，紅麻具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。我國(guó)相繼育成一批紅麻優(yōu)良品種［2－3］，產(chǎn)量和品質(zhì)有較大幅度的提高，在國(guó)內(nèi)外居領(lǐng)先水平，但在不抗倒性耐根腐線(xiàn)蟲(chóng)病等方面研究較少。前人對(duì)這批優(yōu)異種質(zhì)資源或品種做了較多鑒定、評(píng)價(jià)與利用工作，主要集中在形態(tài)學(xué)、遺傳基礎(chǔ)等主要表型特征進(jìn)行分析［4］，而紅麻屬于常異花授粉作物，在繁種過(guò)程中容易引起性狀改變，因此新的分子標(biāo)記技術(shù)能更快更準(zhǔn)確對(duì)紅麻在繁種過(guò)程中是否存在變異或混雜進(jìn)行分析。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用RAPD和ISSR技術(shù)對(duì)植物親緣關(guān)系進(jìn)行研究。利用ISSR技術(shù)對(duì)罌粟［5］、大葉茶［6，19］、黃麻［7］進(jìn)行多樣性分析。利用 RAPD 技術(shù)對(duì)苧麻［8］、紅麻［9］資源進(jìn)行分析，將近緣種和栽培種區(qū)分開(kāi)來(lái)。已利用 RAPD［9－10］、ISSR［11－12］、AFLP［13］分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)紅麻種質(zhì)資源遺傳多樣性作了一些初步研究，主要集中在部分當(dāng)家品種和選育品種，僅與主要國(guó)外品種的親緣關(guān)系，所反映的遺傳相似性比較狹窄。紅麻基因組還沒(méi)有測(cè)序，僅有極少數(shù)基因克隆，無(wú)法大量開(kāi)發(fā)SSR［17］、SNP和EST標(biāo)記，研究起來(lái)進(jìn)展緩慢，而ISSR和RAPD標(biāo)記能夠在未知序列的情況下快速方便找到差異，因此，針對(duì)我國(guó)紅麻種質(zhì)資源的遺傳多樣性及親緣關(guān)系的分子標(biāo)記研究仍不全面，我們將擴(kuò)大群體數(shù)量，增加近緣種和野生種數(shù)量探討遺傳多樣性和親緣關(guān)系，在品種選育中能更好的選擇中間材料，減少盲目性。

紅麻種質(zhì)資源的遺傳多樣性十分豐富，對(duì)種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究不但可以為新品種選育策略的制訂提供參考依據(jù)，而且可以為親本的選配、后代遺傳變異程度及雜種優(yōu)勢(shì)水平的預(yù)測(cè)提供預(yù)見(jiàn)性的指導(dǎo)，對(duì)于發(fā)掘紅麻優(yōu)異種質(zhì)基因，拓展栽培品種的遺傳基礎(chǔ)具有重要意義。本研究采用RAPD和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，從不同地區(qū)和省份廣泛征集并選取有代表性紅麻栽培種、半野生種和野生種60份供試材料進(jìn)行研究，以期揭示其栽培種、半野生種和野生種遺傳多樣性及親緣關(guān)系，為紅麻遺傳改良和分子標(biāo)記輔助育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

征集并選取紅麻供試材料60份，分別來(lái)自16個(gè)國(guó)家和地區(qū)，其中包括野生及半野生品種15份，栽培品種45份，材料名稱(chēng)、來(lái)源及品種類(lèi)型見(jiàn)表1。

1.2 方法

DNA提取采用白鳳虎的遺傳改良CTAB方法［14］，200條RAPD引物和100條ISSR引物(均購(gòu)自上海生工)，反應(yīng)體系為總體系 20 μL ，其中 10 ×buffer 2 μL ，2.5 mM dNTP 0.4 μL ，2.5 UTaqmerase 0.4 μL ，primer 0.4 μL ，模版 2 μL ，ddH2O 14.8 μL 。ISSR 采用李輝［15］的 PCR 擴(kuò)增方法，94℃ 3 min;94℃ 60 s，52℃ －56℃(不同引物其特異退火溫度不同)30 s，72℃ 90 s，39個(gè)循環(huán);72℃ 6 min;4℃保存。產(chǎn)物在1×TBE緩沖液中，用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，電壓為180 V，電泳2 hr。銀染顯色，BioRad凝膠成像儀拍照記錄。RAPD采用李建軍［8］的PCR擴(kuò)增方法，首先94℃ 預(yù)變性3 min;然后94℃ 60 s，37℃ 45 s，72℃ 60 s，39個(gè)循環(huán);72℃ 6 min;4℃保存。產(chǎn)物在1.8%瓊脂溶膠檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

PCR產(chǎn)物經(jīng)含EB的1.8%瓊脂糖凝膠電泳后，用Quantity One 6.0分析軟件結(jié)合人工方法讀帶，記錄電泳圖譜中清晰且能重復(fù)出現(xiàn)的條帶，在相同的遷移位置上，有帶用“1”表示，無(wú)帶用“0”表示。采用NTSYS－pc2.10e分析軟件計(jì)算樣品間的遺傳相似系數(shù)，同時(shí)用類(lèi)平均聚類(lèi)法(UPGMA)進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建分子聚類(lèi)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR和RAPD多態(tài)性分析

從200條RAPD引物中篩選出38條多態(tài)性較好、條帶清晰的引物用于統(tǒng)計(jì)分析，這38條引物編號(hào)分別為:S406、S407、S409、S417、S422、S425、S427、S433、S434、S437、S439、S440、S441、S442、S444、S446、S463、S470、S487、S491、S506、S509、S511、S512、S516、S1004、S1013、S1015、S1024、S1047、S1052、S1073、S1075、S1079、S1080、S1062、S507 和 S1053。38 條引物共擴(kuò)增出 286 條重復(fù)性好的清晰條帶，其中多態(tài)性條帶有227條，平均每條引物擴(kuò)增條帶為7.53條，多態(tài)性條帶比率為79.4%;100條ISSR引物中共篩選出符合條件的21條引物用于數(shù)據(jù)分析，21條引物編號(hào)分別為:U808、U809、U812、U817、U818、U824、U826、U827、U828、U846、U847、U848、U855、U856、U860、U864、U879、U881、U887、U889和U891。21條引物共擴(kuò)增出169條清晰條帶，多態(tài)性條帶有141條，平均每條引物擴(kuò)增出8.05條帶，多態(tài)帶的比率為83.4%。ISSR標(biāo)記的多態(tài)性條帶比率高于RAPD標(biāo)記，與RAPD標(biāo)記比較，ISSR標(biāo)記能檢測(cè)出更多的基因組多態(tài)性信息，但兩種標(biāo)記均較好的表現(xiàn)出了60份紅麻材料豐富的遺傳多樣性。有關(guān)兩種分子標(biāo)記技術(shù)得到的結(jié)果比較見(jiàn)表2。

表1 供試紅麻品種，來(lái)源及品種類(lèi)型Tab.1 Kenaf varieties and their origins

2.2 綜合利用ISSR和RAPD進(jìn)行60個(gè)品種的聚類(lèi)分析

利用NTSYS－pc2.10e分析軟件以同樣的方法進(jìn)行聚類(lèi)分析，建立聚類(lèi)樹(shù)狀圖(如圖1所示)。60份紅麻材料間的遺傳相似系數(shù)(GSC，genetic similarity coefficients)在0.457－0.971之間，當(dāng)在遺傳相似系數(shù)為0.871處作切割線(xiàn)L1時(shí)，可將60份材料分為兩大類(lèi)群:45份栽培品種分成一大類(lèi)群，15份野生、半野生品種聚為另一大類(lèi)群。在15份野生種和半野生種構(gòu)成的類(lèi)群中，H029和H027(GSC=0.954)、85－106和ZB324(GSC=0.876)的遺傳關(guān)系最近，所以聚成一類(lèi)，其余的野生、半野生種間都獨(dú)立成類(lèi);另外，源于尼泊爾的兩個(gè)野生種H193與H195(GSC=0.761)和源于肯尼亞的兩個(gè)野生種H173與H134(GSC=0.865)的親緣關(guān)系在這一大類(lèi)群中相對(duì)較近;原始野生種H070依舊處于聚類(lèi)的最基礎(chǔ)地位，與其他品種間的遺傳相似系數(shù)在0.457－0.750之間(與NA414和印度野生的GSC=0.457，與H195的GSC=0.750)。當(dāng)在遺傳相似系數(shù)為0.882處作切割線(xiàn)L2時(shí)，45份栽培品種構(gòu)成的大類(lèi)群可分為四個(gè)亞群:第一亞群中僅包括C2032;83－20、SF192、T15和阿聯(lián)紅麻組成第二亞群，這一群中美國(guó)的兩個(gè)栽培品種83－20和SF192的親緣關(guān)系最近(GSC=0.928);印63標(biāo)獨(dú)自作為第三亞群;其余39份材料為第四亞群。為了更好地了解遺傳差異和親緣關(guān)系，在遺傳相似系數(shù)為0.896處作切割線(xiàn)L3，又可將39份材料構(gòu)成的大亞群分為七個(gè)次亞群組:第一組由兩個(gè)尼泊爾的栽培種NL383和NL389構(gòu)成，說(shuō)明地理位置可以區(qū)分品種的親緣關(guān)系;中紅麻11號(hào)和中紅麻13號(hào)聚成第二組;第三組由722和臺(tái)農(nóng)1號(hào)組成;中雜紅305、中雜紅318和中紅麻10號(hào)屬于第四組，為中紅麻系列，均為選育品種，說(shuō)明3者親緣關(guān)系接近;第五組包括K114－2和7804大粒;SCS11－04單獨(dú)作為第六組;剩余的27份栽培品種構(gòu)成第七亞群組，在這七個(gè)亞群組中，前六組中除了第一組和第二組中的臺(tái)農(nóng)1號(hào)外，其余品種都為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所育成品種。當(dāng)在遺傳相似系數(shù)為0.925處作切割線(xiàn)L4時(shí)，可進(jìn)一步將27個(gè)品種組成的第七亞群組分為五個(gè)群:福紅952、粵紅1號(hào)和浙蕭麻1號(hào)組成第一群;非洲裂葉、福紅991、福紅2號(hào)、福紅992和SHA359這五個(gè)品種組成第二群;由福建農(nóng)林大學(xué)選育的福紅系列聚在第一、第二群。第三群由L3－8和L3－21兩個(gè)品種構(gòu)成;第四群包括V379、YC22和714三個(gè)品種，前四個(gè)群共13個(gè)品種的選育單位為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所、福建農(nóng)林大學(xué)、浙江蕭山棉麻所;最后14個(gè)品種聚為第五群，這一群品種的聚類(lèi)也頗為復(fù)雜，不同地域的品種聚在一起。包括從馬來(lái)西亞引進(jìn)的5個(gè)品種、山東的1個(gè)品種(新紅95)、中國(guó)麻類(lèi)所的6個(gè)品種、廣東農(nóng)科院育成的1個(gè)品種(粵74－3)以及遼寧農(nóng)科院育成的1個(gè)品種(遼紅1號(hào))，其中Kbsix－5、新紅95、L1原種和粵74－3都是各自單獨(dú)成類(lèi)的。45份紅麻栽培種材料的GSC變化范圍在0.821－0.971之間，表明栽培種間的親緣關(guān)系和遺傳進(jìn)化關(guān)系相對(duì)緊密，其中來(lái)自馬來(lái)西亞的品種KBsix系列共4個(gè)品種GSC極高，聚在一起，而KBsix－8和KBsix－12之間的GSC高達(dá)0.971，親緣關(guān)系和遺傳進(jìn)化關(guān)系最密切。不同地理位置的品種聚在一起，說(shuō)明國(guó)際育種交流日趨緊密，品種間相互利用，基因相互滲入，親緣關(guān)系較近。

圖1 60份紅麻材料RAPD和ISSR聚類(lèi)圖Fig.1 Dendrogram of 60 kenaf clustered based on RAPD and ISSR markers

2.3 利用ISSR和RAPD對(duì)湖南省22個(gè)栽培品種的聚類(lèi)分析

60份紅麻材料中包括中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所育成的21個(gè)品種，為了研究這些品種之間的親緣關(guān)系，考慮到地域和育種單位的因素，特將這21份材料和湖南的1個(gè)材料(V379)進(jìn)一步作分子聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 22份紅麻材料的遺傳相似性聚類(lèi)分析Fig.2 Dendrogram of genetic similarity of 22 kenaf by using UPGMA method

22份紅麻品種間的GSC在0.836－0.954之間，當(dāng)在遺傳相似系數(shù)為0.896處作切割線(xiàn)L1時(shí)，22份栽培材料分為五個(gè)類(lèi)群:T15、SCS11－04分別單獨(dú)聚為兩類(lèi);中紅麻13號(hào)和中紅麻11號(hào)聚為第三類(lèi);中雜紅318和722組成第四類(lèi);第五類(lèi)將剩余的品種包括在內(nèi)。中紅麻11號(hào)由72－44和72－3雜交選育而成，中紅麻13號(hào)由中紅麻10號(hào)與紅麻11號(hào)雜交，然后與中紅麻11號(hào)回交所選育［2］，具有極高的遺傳相似性，因此它們聚在一起。福紅系列大都是以非洲裂葉為親本選育而成，與非洲裂葉具有較高的遺傳相似性。當(dāng)在遺傳相似系數(shù)為0.919處作切割線(xiàn)L2時(shí)，第五類(lèi)品種可分為六個(gè)亞類(lèi):第一亞類(lèi)包括YC22、714和K114－2;L3－8和L3－21組成第二亞類(lèi)，它們都是從L3中株選而來(lái)，屬于同一品系;第三亞類(lèi)包括中紅麻10號(hào)和中雜紅305;V379單獨(dú)組成第四亞類(lèi);第五亞類(lèi)包括的品種數(shù)目最多，包括7個(gè)品種，分別是7804大粒、SHA359、L1原種、P2、SkSu5、G4和152，這一亞類(lèi)中G4和152親緣關(guān)系最近(GSC=0.954);最后一個(gè)亞類(lèi)只包括KB6一個(gè)品種。

3 討論

3.1 紅麻資源的遺傳多樣性分析

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所選育的21個(gè)栽培種和湖南的一個(gè)地方品種(V379)親緣關(guān)系較近，遺傳相似系數(shù)范圍在0.827－0.959之間。利用綜合矩陣得到的聚類(lèi)圖，可以清晰看到品種的選育過(guò)程和各品種間的親緣關(guān)系。育種家選育的品種遺傳相似系數(shù)極高，只有少數(shù)的變異。比如麻類(lèi)研究所選育的品種中，T15處于聚類(lèi)最基礎(chǔ)的地位，在這22個(gè)栽培品種中可以考慮作為親本使用，它不僅具有當(dāng)?shù)卦耘嗥贩N的優(yōu)良性狀，而且在遺傳選育中，它具有外來(lái)品種的優(yōu)質(zhì)基因，因此在選育品種的過(guò)程中，以當(dāng)?shù)貎?yōu)良品種作為親本之一，在某些性狀上互補(bǔ)的其他優(yōu)異資源為材料進(jìn)行雜交，彌補(bǔ)當(dāng)?shù)仄贩N的缺陷，這樣能夠很快適應(yīng)當(dāng)?shù)氐脑耘?，有利于性狀改良，獲得所需優(yōu)異種質(zhì)［2］。45個(gè)栽培品種的GSC為0.871，說(shuō)明栽培種間的遺傳相似系數(shù)極高，種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)狹窄，說(shuō)明基因型與親緣關(guān)系相近，可能中國(guó)的紅麻品種主要以引進(jìn)有關(guān)，主要集中在少數(shù)優(yōu)良性狀的基因上。福紅系列品種主要由非洲裂葉為親本選育而成，具有相似的遺傳背景，親緣關(guān)系相對(duì)較近［3，11］。本研究加大種質(zhì)資源的數(shù)量和來(lái)源地，更好地區(qū)分和鑒定紅麻資源遺傳的多樣性，能夠把來(lái)自馬來(lái)西亞、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)所和福建農(nóng)林大學(xué)3個(gè)育種單位或地區(qū)的品種有效區(qū)分開(kāi)來(lái)。因此不同育種研究者可相互借鑒，利用對(duì)方品種的優(yōu)點(diǎn)去彌補(bǔ)相互的缺點(diǎn)，這樣大大提高品種選育的選擇性，減少盲目性。地理分布與種群的遺傳多樣性有直接聯(lián)系，從15個(gè)野生種和半野生種來(lái)源于不同的國(guó)家或地區(qū)，來(lái)自于同一個(gè)國(guó)家的品種聚在一起，遺傳相似系數(shù)也高;不同國(guó)家的品種屬于不同的類(lèi)群，說(shuō)明地理因素決定品種的遺傳多樣性。紅麻起源于非洲，分布范圍廣，保持了較高的遺傳多樣性［12，20］。15份野生種和半野生種聚為一類(lèi)，與栽培種的遺傳距離較遠(yuǎn)，這些品種資源具有較強(qiáng)的抗病性［13］和其他優(yōu)良性狀基因，擴(kuò)大遺傳基礎(chǔ);通過(guò)60份資源的RAPD和ISSR分子標(biāo)記能夠更好地減少盲目選育，能夠有目的有計(jì)劃地進(jìn)行馴化。特別是全球氣候變暖，惡劣天氣和不正常氣候給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大的災(zāi)害，因此對(duì)紅麻核心種質(zhì)的遺傳多樣性［16］分析有助于我們?cè)诮窈箝_(kāi)展育種工作中提供借鑒意義。同時(shí)通過(guò)分子輔助育種能夠提高選擇品種的正確率，減少由于主觀原因所造成的偏差，加快育種進(jìn)程，構(gòu)建核心種質(zhì)庫(kù)有利于品種的遺傳改良。因此利用育種家的種質(zhì)構(gòu)建核心種質(zhì)庫(kù)，挖掘近緣種或者野生種中的一些優(yōu)異資源(抗逆性或者品質(zhì))共同組成核心種質(zhì)庫(kù)［20－21］，避免品種選育的單一化，呈現(xiàn)品種的多樣性。

3.2 ISSR和RAPD對(duì)研究紅麻遺傳多樣性的可靠性分析

ISSR和RAPD能夠不針對(duì)物種，能夠快速區(qū)分品種的遺傳多樣性。兩種引物的多態(tài)性達(dá)到45%以上，與他們的結(jié)果相近。60份遺傳材料的遺傳相似系數(shù)在0.457－0.971，與用ISSR標(biāo)記的結(jié)論相近［12，18］，說(shuō)明兩種分子方法結(jié)合也能夠有效區(qū)分不同品種間的多樣性，在黃麻［10］等物種中得到印證。雖然RAPD產(chǎn)生假陽(yáng)性，可通過(guò)提高退火溫度，使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)能夠很好的重復(fù)，保證了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性［8－10］，說(shuō)明RAPD仍不失為可利用的分子標(biāo)記。

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