施曼莉，朱 榮

運動過程中，葡萄糖是骨骼肌最重要的能源物質(zhì)之一，肌糖原則是葡萄糖的儲存庫，運動時肌糖原分解產(chǎn)生大量ATP以供肌肉活動利用，運動后的恢復(fù)過程主要是肌糖原的再合成，因此，肌糖原的儲備與再合成的速率是影響運動能力與訓(xùn)練效果的重要因素［18］。近年來，在傳統(tǒng)有氧運動方式（持續(xù)有氧運動）基礎(chǔ)上，發(fā)展了一種新穎的運動模式，即高強(qiáng)度間歇運動（high intensity interval training，以下簡稱“HIIT”）。實驗證實，HIIT是一種有效率的訓(xùn)練方式，只需較少的運動時間即可達(dá)到與低強(qiáng)度長時間運動消耗同等的能量，已在競技體育和大眾健身中得到廣泛應(yīng)用［2］。研究發(fā)現(xiàn)，長期中低強(qiáng)度持續(xù)有氧運動可增加肌糖原含量［15］，但 HIIT與肌糖原的關(guān)系及機(jī)制鮮有關(guān)注。本研究旨在觀察8周HIIT對SD大鼠骨骼肌糖原含量的影響并探討其可能機(jī)制，為競技訓(xùn)練和大眾健身運動處方的科學(xué)制定提供依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠20只，6月齡，體質(zhì)量250～300g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供［動物生產(chǎn)許可證批號：SCXK—（軍）2007—004，動物批號：0006645，動物使用許可證批號：SYXK（京）2008—0009］，自由進(jìn)食水。本實驗在北京體育大學(xué)科研中心和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所作物功能基因與遺傳改良研究室完成。

1.2 動物分組與訓(xùn)練方案

將動物隨機(jī)分為對照組（control group，CG）和 HIIT組（high intensity interval training group，TG），CG大鼠在鼠籠內(nèi)自由活動，TG大鼠進(jìn)行為期8周的高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練，訓(xùn)練方案如下：先以速度為8.3m／min進(jìn)行4min準(zhǔn)備活動，之后以10°、25m／min、4min和0°、8.3m／min、4min交替進(jìn)行（根據(jù)Bedford等［6］的研究結(jié)果，運動強(qiáng)度分別為90%˙VO2max和60% ˙VO2max），重 復(fù) 7 組，60min／d，5d／周。實驗動物在正式訓(xùn)練前先進(jìn)行2d跑臺適應(yīng)，坡度0°，速度8.3m／min。

1.3 一般情況觀察

觀察大鼠的體毛色澤、精神狀態(tài)、大便形態(tài)及活動情況等外在表現(xiàn)。每日上午訓(xùn)練前，用電子秤（感量為1g）稱量各組大鼠體重（g）。每日定時定量給予各組大鼠相同量飼料，次日稱量剩余飼料，計算攝食量（g）。

1.4 力竭時間測定

各組大鼠在末次訓(xùn)練后第二天進(jìn)行一次遞增負(fù)荷運動實驗，方案：進(jìn)行10min跑臺熱身運動（速度5m／min）后，起始負(fù)荷設(shè)定為10m／min，每3min遞增5m／min，直到力竭。力竭判定標(biāo)準(zhǔn)：動物跟不上預(yù)定速度，大鼠臀部壓在籠具后壁，后肢隨轉(zhuǎn)動皮帶后拖達(dá)30s，毛刷刺激驅(qū)趕無效；行為特征為呼吸深急、幅度大，精神疲倦，俯臥位垂頭，刺激后無反應(yīng)。記錄力竭時間。

1.5 動物取材

2組動物在末次運動后48h稱重，心臟取血并斷頭處死，全血離心（4℃、3 000r／min）后取血清。迅速分離股四頭肌用錫紙包裹投入液氮中并轉(zhuǎn)移至－80℃低溫冰箱凍存待測。

1.6 血糖和血胰島素測定

氧化酶法測定血糖濃度，試劑盒購自南京建成生物有限公司，檢測儀器為MD－100半自動生化分析儀（單位：mg／dL）。放免法測定血清胰島素含量，試劑盒購自武漢博士德生物公司，檢測儀器為FMQ－9013C型γ放免儀（單位：ng／mL）。嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行。

1.7 肌糖原含量測定

采用蒽酮法測定，方法：取50mg骨骼肌加3倍體積濃堿溶液，沸水浴20min，冷卻后用雙蒸水稀釋20倍配成溶液。取100μL溶液加水至1mL，加入2mL蒽酮顯色劑，震蕩混勻，沸水浴5min，冷卻后以空白管調(diào)零，測定各樣品和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在620nm處的吸光度，計算糖原含量（單位：nmol／mg）。測試儀器：722型光柵分光光度計。

1.8 葡萄糖攝取率測定

取100mg骨骼肌，分別加入到不含胰島素（－ins）或含胰島素（＋ins）的 Krebs－Ringer碳酸鹽緩沖液中（1.0 μmol／L）。在室溫（37℃）、95%O2、5%CO2條件下震蕩孵育1h，加入1.5nmol／L 2－脫氧葡萄糖（2－DG）和0.5μ Ci3H－2－脫氧葡萄糖（3H－2－DG），繼續(xù)孵育30min。洗滌肌肉組織后轉(zhuǎn)移至液閃瓶中，加入過氯酸和雙氧水，80℃消化3～4h，室溫冷卻。加乙二醇乙醚和閃爍液，暗室放置12h。用全自動液閃儀（Beckman LS 3801，美國）測定其放射性（單位：pmol／mg／min）。

1.9 糖原磷酸化酶（glycogen phosphorylase，GP）活性測定

取50mg骨骼肌，置于0.5mL預(yù)冷的蛋白酶提取緩沖液中充分勻漿，離心（4℃、14 000g）30min取上清。取50μL上清液加等體積含2.5mCi／mol［14C］－G－1－P（葡萄糖－1－磷酸）的酶測定緩沖液，活化型GP（有活性的GP）測定介質(zhì)不含AMP（－AMP），GP總酶測定介質(zhì)含6mmol／L AMP（＋AMP）。用液體閃爍計數(shù)儀（Beckman LS 3801，美國）測定14C摻入糖原的放射活性（單位：nmol／mg／min）。GP活性用活化型酶活性與總酶活性的比值表示（－AMP／＋AMP），即活性GP比值。

1.10 糖原合酶（glycogen synthase，GS）活性測定

取50mg骨骼肌勻漿后加入0.5mL GS提取液中，離心（4℃、14 000g）30min，取上清。取50μL上清液加入等體積含0.1mCi／mmol［14C］－UDPG（尿苷二磷酸葡萄糖）的酶測定緩沖液，活化型GS（有活性的GS）測定的介質(zhì)不含 G－6－P（葡萄糖－6－磷酸）（－G6P），GS總酶測定的介質(zhì)含10mmol／L G－6－P（＋G6P）。用液體閃爍計數(shù)儀（Beckman LS 3801，美國）測定14C摻入糖原的放射性活性（單位：pmol／mg／min）。GS活性用活化型酶活性與總酶活性的比值表示（－G6P／＋G6P），即活性GS比值。

1.11 骨骼肌細(xì)胞膜分離

取100mg骨骼肌冰上剪碎，加入裂解液［Tris－HCL（pH 7.5）20mol／L，蔗 糖 330mol／L，EDTA 0.5mol／L，PMSF 1mol／L，Lepeptin 25mg／L］，冰浴中勻漿，4℃1 000 r／min離心10min。取上清以40 000r／min離心1h，棄上清，在沉淀中再加入前述裂解液，用超聲裂解的方法循環(huán)萃取7次，再以40 000r／min離心1h，得到的上清液即為骨骼肌細(xì)胞膜組織。迅速轉(zhuǎn)移至－80℃低溫冰箱凍存待測。

1.12 Western Blotting測定蛋白表達(dá)量

取100mg骨骼肌勻漿裂解后，離心（4℃、15 000g）20 min，用考馬斯亮藍(lán)法測定總蛋白濃度。取10μg蛋白樣品在垂直電泳儀（BIO－RAD，美國）上經(jīng)15%SDS－PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。兔抗鼠葡萄糖轉(zhuǎn)運體4（glucose transporter type 4，GLUT4，包 括 總 GLUT4和 肌 膜GLUT4）、GP及磷酸化 GP（p－GP）、GS及 磷酸化 GS（p－GS）、4℃靜置孵育過夜，洗滌3次。再以1∶1 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體室溫孵育1h，充分洗滌后，使用ECL試劑盒發(fā)光顯影，X線膠片壓片曝光，掃描定量各條帶的相對灰度值，β－actin為內(nèi)參蛋白。

1.13 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。組間比較獨立樣本t檢驗，對糖原含量和力竭時間進(jìn)行簡單相關(guān)分析并計算Pearson相關(guān)系數(shù)（r）。統(tǒng)計學(xué)差異定為P＜0.05。統(tǒng)計軟件為SPSS 15.0。

2 結(jié)果

2.1 實驗期間CG和TG組大鼠的一般情況

整個實驗期間2組大鼠精神狀態(tài)均未出現(xiàn)明顯異常，所有大鼠未發(fā)現(xiàn)掉毛、體毛凌亂、無光澤、大便形態(tài)改變等不良反應(yīng)。攝食量在2組間無顯著性差異（P＞0.05，圖1）；TG大鼠體重在第6～8周低于CG（P＜0.05，圖2）。

圖1 本研究CG和TG組攝食量的變化示意圖Figure 1. Changes of Food Consumption

圖2 本研究CG和TG組體重的變化示意圖Figure 2. Changes of Body Weight

2.2 CG和TG組力竭時間比較

8周運動后，TG大鼠力竭時間較CG大鼠提高了41.3%（P＜0.05，表1）。

表1 本研究CG和TG組力竭時間比較一覽表Table 1 Comparison of Exhaust Duration between Two Groups

2.3 CG和TG組血糖、胰島素和肌糖原含量的變化

血糖和血胰島素在2組間均無顯著性差異（P＞0.05）。TG肌糖原含量高于CG（P＜0.05，表2）。

表2 本研究CG和TG組血糖和血胰島素濃度的變化一覽表Table 2 Changes of Blood Glucose and Serum Insulin

2.4 肌糖原含量與力竭時間的相關(guān)分析

相關(guān)分析顯示，肌糖原含量與力竭時間顯著正相關(guān)（CG：r＝0.68，P＜0.05；TG：r＝0.75，P＜0.05）。

2.5 CG和TG組葡萄糖攝取率和GLUT4蛋白表達(dá)的變化

8周后，基礎(chǔ)葡萄糖攝取率（－ins）在TG和CG間無顯著性差異（P＞0.05），但胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取率（＋ins）TG高于CG（P＜0.05，表3）。TG總 GLUT4和肌膜 GLUT4均顯著高于CG（P＜0.05，圖4）。

表3 本研究CG和TG組葡萄糖攝取率的變化一覽表Table 3 Changes of Glucose Uptake Rate

圖4 本研究CG和TG組總GLUT4和肌膜GLUT4蛋白的變化示意圖

2.6 GP活性和蛋白表達(dá)的變化

2組活化型GP活性（－AMP）、GP總酶活性（＋AMP）、活性GP比值（－AMP／＋AMP），GP和p－GP蛋白表達(dá)量以及p－GP蛋白／GP蛋白比值均無顯著性差異（P＞0.05，表4，圖5）。

表4 本研究CG和TG組GP活性的變化一覽表Table 4 Changes of GP Activity

2.7 GS活性和蛋白表達(dá)的變化

活化型GS活性（－G6P）在兩組間無顯著性差異（P＞0.05），GS總酶活性（＋G6P）TG高于 CG（P＜0.05），而活性GS比值（－G6P／＋G6P）TG低于CG（P＜0.05，表5）。GS蛋白和p－GS蛋白表達(dá)量TG高于CG（P＜0.05），而p－GS蛋白／GS蛋白比值在兩組間無顯著性差異（P＞0.05，圖6）。

圖5 本研究CG和TG組GP和p－GP蛋白的變化示意圖Figure 5. Changes of GP and p－GP Protein Expression

表5 本研究CG和TG組GS活性的變化一覽表Table 5 Changes of GS Activity

圖6 本研究CG和TG組GS和p－GS蛋白的變化示意圖Figure 6. Changes of GS and p－GS Protein Expression

3 討論

近年來，在傳統(tǒng)持續(xù)有氧運動基礎(chǔ)上，發(fā)展了一種新穎的提高有氧能力的運動模式——HIIT，研究表明，HIIT只需較少的運動時間即可達(dá)到與低強(qiáng)度、長時間運動消耗同等的能量，且由于運動時間較短、存在間歇，更容易被接受［2］。HIIT已在競技體育和大眾健身中廣泛應(yīng)用，其安全性也得到了大樣本實驗和Meta－分析的證實［23］，但HIIT對肌糖原含量的影響及機(jī)制鮮有關(guān)注。

3.1 HIIT通過上調(diào)骨骼肌糖原含量提高運動耐力

有實驗證據(jù)表明，肌糖原耗竭是導(dǎo)致疲勞的主要原因，提高肌糖原水平則可延緩運動中疲勞的發(fā)生并改善機(jī)體的運動能力［17］。運動對肌糖原含量的影響與運動負(fù)荷有關(guān)，大強(qiáng)度離心運動后24～72h肌糖原恢復(fù)受損［10］，馬拉松比賽后肌糖原含量至第7天尚未完全恢復(fù)［4］，提示大強(qiáng)度、長時間運動可能會延長肌糖原恢復(fù)時間，即Snyder等［20］提出的過度訓(xùn)練的糖原耗竭學(xué)說。一般認(rèn)為，耐力訓(xùn)練可提高肌糖原含量，而2周持續(xù)有氧運動后1h和6h糖原含量未見顯著性差異，可能與取材時間過早以及未及時補充碳水化合物有關(guān)［3］，若運動后持續(xù)補充碳水化合物，肌糖原含量則在運動后4～6h明顯升高［16］。

本研究建立HIIT模型，發(fā)現(xiàn)8周實驗期間TG大鼠在活動情況、精神狀態(tài)、毛色以及大便形態(tài)等方面無明顯異常，說明本實驗采用的運動負(fù)荷和訓(xùn)練方案適宜，并未造成過度訓(xùn)練。取材時間是在末次運動后48h，因此避免了急性運動的應(yīng)激效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TG大鼠骨骼肌糖原含量明顯高于CG大鼠，表明運動后正常飲食而不額外補充碳水化合物的情況下，經(jīng)過長期HIIT亦能產(chǎn)生使運動后肌糖原超量恢復(fù)程度顯著增加的適應(yīng)性變化，同時，TG大鼠力竭時間增加，且與糖原含量顯著正相關(guān)，提示HIIT可通過上調(diào)骨骼肌糖原含量進(jìn)而提高運動能力。肌糖原影響運動能力的可能機(jī)制包括：1）糖原在肌纖維內(nèi)分隔存在，當(dāng)運動肌糖原耗盡時無法從非運動肌得到補充；充足的肌糖原則可為肌肉收縮提供更多的燃料。2）在完成相同負(fù)荷運動時，肌糖原含量低者肌肉要較多的吸收血糖供能，可引起低血糖并影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的能量供應(yīng)，造成疲勞過早發(fā)生；而充足的肌糖原則節(jié)省血糖利用，推遲運動性疲勞的出現(xiàn)。3）肌糖原是脂肪氧化供能的代謝引物，肌糖原儲量不足時脂肪酸β－氧化受阻并產(chǎn)生酮體，體液酸化使運動能力下降；長期HIIT上調(diào)肌糖原后可提高肌細(xì)胞利用脂肪酸和血糖的能力，運動中表現(xiàn)出糖原節(jié)省化，維持機(jī)體長時間抗疲勞的能力。

3.2 HIIT提高骨骼肌糖原含量的可能機(jī)制

HIIT上調(diào)骨骼肌糖原含量的具體機(jī)制尚不明確。由于糖原含量受葡萄糖轉(zhuǎn)運、糖原合成以及糖原分解等影響，因此研究者對上述因素進(jìn)行了深入分析。GP是糖原分解的關(guān)鍵酶［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，2組GP活性和蛋白表達(dá)量均無顯著性差異，而訓(xùn)練后TG大鼠肌糖原含量增加，提示長期HIIT誘導(dǎo)的骨骼肌糖原含量增加是糖原合成增多而非糖原分解減少造成的。

肌糖原的合成與肌細(xì)胞攝取葡萄糖的速率成正比［11］。肌細(xì)胞攝取葡萄糖需GLUT作為載體，其中，GLUT4是骨骼肌葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運的主要載體，葡萄糖轉(zhuǎn)運被認(rèn)為是肌細(xì)胞葡萄糖代謝的限速步驟［21］。安靜時，GLUT4主要存在于 胞 漿 內(nèi)，當(dāng) 受 到 胰 島 素［9］或 肌 肉 收 縮［19］刺 激 時，GLUT4向胞膜轉(zhuǎn)位。在本研究中，TG大鼠總GLUT4和肌膜GLUT4蛋白量均顯著性增加，提示長期HIIT可通過調(diào)節(jié)GLUT4向肌膜轉(zhuǎn)位并增加其蛋白表達(dá)而促進(jìn)葡萄糖攝取，其機(jī)制可能與運動激活細(xì)胞內(nèi)的能量開關(guān)分子——AMP活化 蛋 白 激 酶 （adenosine monophosphate－activated protein kinase，AMPK）［1］，后 者 進(jìn) 而 促 進(jìn) GLUT4 轉(zhuǎn) 位 有 關(guān)。為探討胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取的變化，本研究用3H－2－DG進(jìn)行放射測定發(fā)現(xiàn)，2組血糖、血清胰島素和基礎(chǔ)葡萄糖攝取率（－ins）無顯著性差異，而TG動物胰島素刺激的葡萄糖攝取率（＋ins）則顯著升高，說明長期HIIT提高了胰島素敏感性?？傊珿LUT4向肌膜轉(zhuǎn)位有利于提高肌細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運能力，促進(jìn)訓(xùn)練后肌糖原的超量恢復(fù)，為HIIT提高運動機(jī)能提供了重要依據(jù)。

GS是糖原合成的關(guān)鍵酶［7］。糖原合成時，G－6－P經(jīng)過酶促反應(yīng)生成糖原前體——尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphoglucose，UDPG），隨后GS催化UDPG分子中的葡萄糖基轉(zhuǎn)移到糖原分子的多糖鏈上，這一反應(yīng)被認(rèn)為是糖原合成的限速步驟［7］。GS可被多種蛋白激酶（如Akt）磷酸化而失活，又可在磷酸酶（如糖原合酶激酶3）作用下脫磷酸而變成活化型［5］，還能受G－6－P的別構(gòu)調(diào)節(jié)使無活性的GS被激活［22］。因此，GS活性受共價修飾調(diào)節(jié)和變構(gòu)調(diào)節(jié)的雙重調(diào)控，GS活性通常以活化型GS活性占GS總酶活性的百分比表示。在本研究中，TG大鼠肌糖原含量顯著性升高，同時伴隨GS總酶活性增加以及蛋白表達(dá)量上調(diào)，提示GS總酶活性增加與蛋白表達(dá)量升高有關(guān)。研究證實，GS與糖原顆粒形成密切相關(guān)，因此推測，GS蛋白水平增加可能與糖原含量升高后酶蛋白的穩(wěn)定性加強(qiáng)有關(guān)［14］。此外，由于TG大鼠活化型GS活性（－G6P）無顯著改變，而GS總酶活性（＋G6P）、GS蛋白以及p－GS水平升高，因此，活性GS比值（－G6P／＋G6P）下降。

運動中以及運動間歇期，骨骼肌攝取葡萄糖增加，從而使 G－6－P含量增多，后者作為變構(gòu)效應(yīng)劑激活 GS［13］。此外，運動時糖原逐漸消耗殆盡，GS活性則顯著增加。本研究取材時間點是在末次運動后48h，此時糖原儲備量已經(jīng)恢復(fù)，GS活性下降，因此，p－GS蛋白水平升高，而p－GP蛋白／GP蛋白比值未發(fā)生改變。將突變型肌肉GS基因敲入小鼠體內(nèi)的模型中（GS不能被G－6－P變構(gòu)激活，但可通過去磷酸化共價修飾而活化），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰島素誘導(dǎo)的肌糖原合成速率減少了80%，糖原含量顯著下降，說明胰島素調(diào)控肌糖原合成主要是通過對GS的變構(gòu)激活實現(xiàn)的［8］。用5－氨 基 咪 唑－4－氨 甲 酰 核 苷 酸 （AICAR）激 活A(yù)MPK后同樣發(fā)現(xiàn)，G－6－P對GS的變構(gòu)激活是肌糖原合成的主要調(diào)節(jié)機(jī)制［12］。雖然目前尚未建立轉(zhuǎn)基因動物的運動干預(yù)模型，但結(jié)合本研究中GS活性和蛋白表達(dá)以及糖原含量的變化可以推測，G－6－P對GS的變構(gòu)調(diào)節(jié)（而非共價修飾調(diào)節(jié)）是HIIT誘導(dǎo)肌糖原合成的重要分子機(jī)制。

4 結(jié)論

長期HIIT可上調(diào)骨骼肌糖原含量并提高運動能力；HIIT誘導(dǎo)的糖原含量增加是糖原合成增多而非糖原分解減少造成的，其機(jī)制可能與GLUT4表達(dá)上調(diào)與轉(zhuǎn)位使葡萄糖轉(zhuǎn)運增加，GS表達(dá)上調(diào)以及葡萄糖－6－磷酸對GS的變構(gòu)激活有關(guān)。

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