石國民 喻容 彭雪峰 石燕 聶英 齊志強(qiáng) 陳擁軍 向延根 劉忠泉

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·論著·

基因芯片技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測及菌種鑒定中的應(yīng)用

石國民 喻容 彭雪峰 石燕 聶英 齊志強(qiáng) 陳擁軍 向延根 劉忠泉

目的 應(yīng)用基因芯片技術(shù)快速檢測結(jié)核分枝桿菌的耐藥基因型以及分枝桿菌菌種基因型，探討基因芯片技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性和基因型的臨床價(jià)值。方法 應(yīng)用菌種分型基因芯片技術(shù)和間隔區(qū)寡核苷酸分型(spacer oligonucleotide typing, Spoligotyping)技術(shù)對長沙市中心醫(yī)院2011年1月至2012年12月的臨床標(biāo)本分離菌株137株進(jìn)行菌種鑒定。對鑒定為結(jié)核分枝桿菌的菌株應(yīng)用絕對濃度法進(jìn)行利福平和異煙肼藥物敏感性檢測。并進(jìn)一步對結(jié)核分枝桿菌臨床分離株(利福平耐藥、異煙肼耐藥、敏感株)應(yīng)用耐藥基因芯片技術(shù)對rpoB、katG、inhA基因的野生型位點(diǎn)及各突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測。即rpoB基因中1個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的堿基突變?yōu)槔Ｆ侥退?，katG、inhA基因任何基因中的1個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的堿基突變?yōu)楫悷熾履退?。Spoligotyping法和基因芯片法菌種鑒定比較應(yīng)用Kappa檢驗(yàn)，絕對濃度法和基因芯片法藥物敏感性比較采用χ2檢驗(yàn)和Kappa檢驗(yàn)，均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果 (1)與絕對濃度法比較，對利福平敏感和異煙肼敏感的菌株45株，耐藥基因芯片法檢測鑒定為敏感株、即野生型的rpoB基因42株，符合率為93.3%(42/45)(不符合的1株為511T-C突變，1株為531C-T突變, 1株為516A-T突變)；katG基因45株，符合率為100.0%(45/45)；inhA基因43株，符合率為95.6%(43/45)(不符合的2株為inhA-15C-T突變)。(2)與絕對濃度法比較，對利福平輕度耐藥的耐藥菌株18株，耐藥基因芯片檢測鑒定為rpoB基因突變型的16株，符合率為88.9%(16/18)，且與531、516、526、511位點(diǎn)突變相關(guān)。對利福平高度耐藥的耐藥菌株19株，耐藥基因芯片檢測全部鑒定為rpoB基因突變型，符合率為100.0%(19/19)，且與531、516、526、511位點(diǎn)突變相關(guān)。(3)與絕對濃度法比較，對異煙肼輕度耐藥的耐藥菌株13株，耐藥基因芯片檢測鑒定為katG基因突變型的12株，符合率為92.3%(12/13)，與315G-C和315G-A位點(diǎn)突變相關(guān)。inhA基因突變型0株。對異煙肼高度耐藥的耐藥菌株9株，耐藥基因芯片檢測鑒定為katG基因全部為突變型，符合率為100.0%(9/9)，與315G-C和315G-A位點(diǎn)突變相關(guān)。inhA基因突變型0株。(4)與Spoligotyping法比較，137株臨床分離株中104株分離株基因芯片法檢測鑒定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，33株基因芯片法檢測出7株鳥分枝桿菌、15株胞內(nèi)分枝桿菌、1株偶然分枝桿菌、10株龜或膿腫分枝桿菌，與Spoligotyping法比較，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群一致性為100.0%(104/104)，鳥分枝桿菌一致性為77.8%(7/9)，胞內(nèi)分枝桿菌一致性為93.8%(15/16)，偶然分枝桿菌一致性為0.0%(0/0)，龜或膿腫分枝桿菌一致性為100.0%(8/8)。經(jīng)Kappa檢驗(yàn)，Kappa=0.95,U=30.6,P<0.05。結(jié)論 耐藥基因芯片檢測法與絕對濃度法有高度的一致性，且利福平耐藥與rpoB基因的531、516、526、511位點(diǎn)突變相關(guān)。異煙肼耐藥與katG基因的315位點(diǎn)突變相關(guān)，沒有發(fā)現(xiàn)inhA相關(guān)的耐藥位點(diǎn)突變?；蛐酒椒煽焖?、準(zhǔn)確地檢測臨床分離株的菌種基因型和耐藥性。

結(jié)核分枝桿菌； 抗藥性, 細(xì)菌； 微生物敏感性試驗(yàn)； 寡核苷酸序列分析

近年來由于耐藥結(jié)核病、特別是耐多藥結(jié)核病的流行，使得為數(shù)不多的一線抗結(jié)核藥物很難有效，甚至二線和三線藥物也用到了治療結(jié)核病上。有文獻(xiàn)表明耐多藥結(jié)核病患者應(yīng)用抗結(jié)核藥物治療的失敗率在15%～77%[1]。目前結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測方法有表型檢測和基因型檢測兩大類，而表型檢測相對時(shí)間較長。Lee等[2]的研究表明結(jié)核分枝桿菌耐利福平的特性95%與rpoB基因的-85 bp范圍基因位點(diǎn)突變相關(guān)，耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌大多與katG、inhA、aphC、kasA基因中1個(gè)或多個(gè)基因位點(diǎn)的突變相關(guān)。基因型檢測方法目前有DNA測序、單鏈構(gòu)像多態(tài)性(SSCP)、雙脫氧指紋法、異源雙鏈核酸分子分析、錯(cuò)位配子分析、線型擴(kuò)增、分子標(biāo)記序列分析、耐藥芯片檢測等?；蛐酒夹g(shù)是近年發(fā)展起來的一種新的分析方法，它有快速、簡便、高通量等特點(diǎn)，一次能檢測十幾至幾十個(gè)基因位點(diǎn)，適用于多位點(diǎn)分析。因此筆者應(yīng)用基因芯片技術(shù)對本院近期結(jié)核分枝桿菌臨床分離菌株進(jìn)行了耐藥基因檢測。旨在發(fā)現(xiàn)本地區(qū)耐利福平rpoB基因，耐異煙肼katG、inhA基因的突變特征。

材料和方法

一、材料

1.菌株來源：收集長沙市中心醫(yī)院2011年1月至2012年12月所有培養(yǎng)陽性且抗酸染色陽性的臨床分離株。培養(yǎng)方法通過Bactec MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)檢測系統(tǒng)獲得臨床分離株。共獲得結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群臨床分離株104株，非結(jié)核分枝桿菌臨床分離株33株。來源患者均為本院住院患者，104株肺結(jié)核患者均符合《臨床診療指南 結(jié)核病分冊》[3]肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)；臨床上已排除其他病因；經(jīng)病理或細(xì)菌培養(yǎng)證實(shí)明確診斷為肺結(jié)核患者，在隨后觀察中對抗結(jié)核治療有效。33株非肺結(jié)核患者均符合《臨床診療指南 結(jié)核病分冊》肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)；臨床上已排除其他病因；經(jīng)病理或細(xì)菌培養(yǎng)證實(shí)診斷為肺結(jié)核患者，但在隨后觀察中對抗結(jié)核治療無效。其中男86例，女51例；年齡20～65歲，平均(46±12.5)歲；137株臨床分離株均為經(jīng)痰培養(yǎng)陽性，并抗酸染色陽性，137株臨床分離株經(jīng)Spoligotyping 菌型鑒定，并進(jìn)行基因芯片法菌種鑒定。鑒定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的臨床分離株104株再進(jìn)行絕對濃度法藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)、耐藥基因芯片檢測。

2.抗結(jié)核藥物、試劑以及儀器來源：分枝桿菌分離培養(yǎng)采用美國BD公司Bactec MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)檢測系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)；絕對濃度法藥敏試驗(yàn)采用自制改良羅氏培養(yǎng)基；利福平、異煙肼標(biāo)準(zhǔn)粉劑，均購自美國Sigma公司)；分枝桿菌菌種鑒定試劑盒Mini-blotter-MN45(Spoligotyping法)為荷蘭Isogen Life Science 公司產(chǎn)品；耐藥基因芯片檢測儀器(核酸快速提取儀、芯片雜交儀、芯片洗干儀、激光掃描儀)與檢測試劑盒[晶芯?分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(基因芯片法)、晶芯?結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測試劑盒(基因芯片法)]均為北京博奧生物有限公司產(chǎn)品，基因擴(kuò)增采用美國ABI 7300基因擴(kuò)增儀。

二、方法

(一)菌種鑒定

1.Spoligotyping分型檢測：對137株臨床分離株采用Spoligotyping法菌種鑒定試劑盒進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。以結(jié)核分枝桿菌基因組內(nèi)DR區(qū)和16S rDNA為靶序列, 設(shè)計(jì)特異性引物, 5′末端采用地高辛(digoxigenin， DIG)標(biāo)記。PCR 反應(yīng)條件: 96 ℃ 預(yù)變性3 min，96 ℃變性1 min, 55 ℃退火 1 min, 72 ℃延伸 30 s，20個(gè)循環(huán)， 72 ℃ 延伸5 min，擴(kuò)增整個(gè)DR區(qū)和16S rDNA。將PCR產(chǎn)物與結(jié)合有間隔區(qū)寡核苷酸探針及非結(jié)核分枝桿菌特異性探針的Biodyne 尼龍轉(zhuǎn)印C膜進(jìn)行雜交。地高辛化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測。通過間隔區(qū)寡核苷酸探針斑點(diǎn)的顯色和非結(jié)核分枝桿菌特異性探針斑點(diǎn)顯色來判斷分枝桿菌菌型。Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv和Mycobacterium bovis BCG P3標(biāo)準(zhǔn)株作為陽性控制，蒸餾水(double distilled water，DDW)為陰性控制。

2.基因芯片分型檢測：采用北京博奧生物有限公司菌種檢測試劑盒進(jìn)行檢測(DNA微陣列芯片法)進(jìn)行檢測，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。取培養(yǎng)狀況良好的臨床分離株配制菌液(濃度為：1×106CFU/ml)后，加入核酸提取液采用核酸快速提取儀提取結(jié)核分枝桿菌DNA，取試劑盒中PCR反應(yīng)體系18 μl加入2 μl樣本DNA，PCR擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌基因組DNA上的重復(fù)元件DR之間的序列，引物為DRa：5′-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3′； DRb：5′-CC-GAGAGGGGACGGAAAC-3′，按照擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR 反應(yīng)條件: 96 ℃ 預(yù)變性5 min，96 ℃變性1 min, 55 ℃退火 1 min, 72 ℃延伸 30 s，30個(gè)循環(huán)， 72 ℃ 延伸5 min，將擴(kuò)增產(chǎn)物變性(96 ℃ 變性5 min)后，取10 μl與雜交緩沖液配制雜交混合物后加入芯片點(diǎn)陣中進(jìn)行雜交(表1)；雜交后的芯片用芯片洗干儀洗滌、甩干后，運(yùn)用激光掃描儀，運(yùn)行分枝桿菌菌種鑒定基因芯片判別系統(tǒng)，進(jìn)行芯片掃描和根據(jù)配套軟件分析雜交結(jié)果。北京博奧生物有限公司菌種檢測試劑盒內(nèi)包含表面化學(xué)質(zhì)控探針(QC)、雜交陽性外對照探針(EC)、空白對照(BC)、陰性對照探針(NC)、內(nèi)對照探針(IC)作為芯片質(zhì)量控制。

我國城市化建設(shè)速度，呈現(xiàn)出日益上升的趨勢，在經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展，人們生活水平不斷提高的新時(shí)期，我國電力企業(yè)為了適應(yīng)時(shí)代發(fā)展的要求，其施工技術(shù)與施工機(jī)械，也在逐步的變革中，電力自動(dòng)化在電力工程中的運(yùn)用，使電力工程的工作效率得到了很大的提高。但是，受到種種因素的制約，電力自動(dòng)化系統(tǒng)，在運(yùn)行時(shí)，還存在一些問題。這些問題對我國電力系統(tǒng)的整體質(zhì)量產(chǎn)生了不同程度影響，因此，國家有關(guān)部門應(yīng)該高度重視起來，在電力工程實(shí)現(xiàn)電力自動(dòng)化的過程中，不斷的加大工程監(jiān)管力度和施工人員的技術(shù)水平，使得我國的電力工程自動(dòng)化進(jìn)程可以不斷的加快。我國居民也會(huì)因此得到實(shí)惠，工業(yè)以及各項(xiàng)社會(huì)事業(yè)的建業(yè)也會(huì)因此得到更好的發(fā)展。

表1 分枝桿菌菌種鑒定芯片的探針排布

注 QC：表面化學(xué)質(zhì)控探針；EC：雜交陽性外對照探針；BC：空白對照；NC：陰性對照探針；IC：內(nèi)對照探針。探針1、探針2：芯片中兩排不同突變位點(diǎn)檢測探針；1、2、3、4、5代表做5次平行試驗(yàn)

(二)104株結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群藥物敏感性試驗(yàn)

1. 絕對濃度法：藥物檢測濃度、具體的檢測方法和結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)均參照文獻(xiàn)[4]。藥敏檢測培養(yǎng)基藥物濃度：異煙肼(1 μg/ml，10 μg/ml)，利福平(50 μg/ml，250 μg/ml)。耐藥結(jié)果的判定：異煙肼抑菌濃度，1 μg/ml以下細(xì)菌生長為敏感株；1～10 μg/ml為輕度耐藥株；10 μg/ml以上為高度耐藥株。利福平抑菌濃度，50 μg/ml以下細(xì)菌生長為敏感株； 50～250 μg/ml為輕度耐藥株； 250 μg/ml以上為高度耐藥株。

2.基因芯片法：采用北京博奧生物有限公司的基因芯片法藥敏檢測試劑盒進(jìn)行此項(xiàng)檢測，芯片探針分布見表2和表3，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。對104株結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群提取DNA進(jìn)行檢測，檢測基因包括：rpoB基因(引物為R1 5′-AGGACGTGGAGGCGATCA-3′； R2 5′-AACGGGTTGACCCGCGCGTA-3′)；katG基因(引物：K1 5′-GCGGCGGTCGACATT-3′；K2 5′-CTCGAGGA-AACTGTTGTCCC-3′)；inhA基因(引物為I1 5′-CGCAGCCAGGGCCTCGCTG-3′；I2 5′-CTCCGGTAACCAGGACTGA-3′)。芯片掃描后根據(jù)配套軟件分析雜交結(jié)果，以突變信號值超過野生信號值2倍以上為陽性。北京生物有限博奧公司基因芯片法藥敏檢測試劑盒內(nèi)包含QC、EC、BC、NC、IC作為芯片質(zhì)量控制。

表2 利福平耐藥相關(guān)rpoB基因的探針排列

注 QC：表面化學(xué)質(zhì)控探針；EC：雜交陽性外對照探針；BC：空白對照；NC：陰性對照探針；IC：內(nèi)對照探針；WT：野生型。探針1、探針2：芯片中兩排不同突變位點(diǎn)檢測探針；1、2、3、4、5代表做5次平行試驗(yàn)

(三)質(zhì)量控制

絕對濃度法和Spoligotyping法均設(shè)有H37Rv作為陽性對照，作為質(zhì)量控制。每份標(biāo)本分二批做同一實(shí)驗(yàn)，檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性。批內(nèi)每個(gè)樣本設(shè)2個(gè)復(fù)孔?；蛐酒ㄓ蠶C、EC、BC、NC、IC作為質(zhì)量控制。并且每塊芯片中每個(gè)探針重復(fù)做 5次平行試驗(yàn)。

表3 異煙肼耐藥相關(guān)katG基因和 inhA基因的探針排列

注 QC：表面化學(xué)質(zhì)控探針；EC：雜交陽性外對照探針；BC：空白對照；NC：陰性對照探針；IC：內(nèi)對照探針；WT：野生型。探針1、探針2：芯片中兩排不同突變位點(diǎn)檢測探針；1、2、3、4、5代表做5次平行試驗(yàn)

(四)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Spoligotyping法和基因芯片法菌種鑒定比較應(yīng)用Kappa檢驗(yàn)，絕對濃度法和基因芯片法藥物敏感性比較采用χ2檢驗(yàn)和Kappa檢驗(yàn)。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.基因芯片法檢測104株結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群對利福平、異煙肼耐藥的結(jié)果?；蛐酒瑨呙鑸D譜見圖1、2。

2.基因芯片檢測法與Spoligotyping法基因型分析的比較：具體見表4。137株臨床分離株中，104株分離株基因芯片法檢測鑒定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，與Spoligotyping法檢測比較(以Spoligotyping法為金標(biāo)準(zhǔn))，符合率為100.0%(104/104)。 基因芯片法檢測鑒定7株鳥分枝桿菌，與Spoligotyping法檢測為9株比較，符合率為77.8%(7/9)。15株胞內(nèi)分枝桿菌，與Spoligotyping法檢測為16株比較，符合率為93.8%(15/16)?；蛐酒z測鑒定出1株偶然分枝桿菌，而Spoligotyping法未檢測出偶然分枝桿菌，符合率為0.0%(0/0)?；蛐酒z測鑒定出10株龜或膿腫分枝桿菌，而Spoligoty-ping 法僅檢測出其中8株，符合率為100.0%(8/8)。經(jīng)Kappa檢驗(yàn)，Kappa=0.95,U=30.6,P<0.05。表明兩方法結(jié)果具有極強(qiáng)的一致性。

3.藥敏試驗(yàn)基因芯片檢測法與絕對濃度法對利福平耐藥檢測結(jié)果：104株結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中絕對濃度法有45株為利福平和異煙肼敏感株；37株為利福平耐藥株；22株為異煙肼耐藥株。共82株結(jié)核分枝桿菌分離株，其中絕對濃度法和基因芯片法均為利福平耐藥分離株有35株，與之相關(guān)的rpoB基因突變位點(diǎn)分布(表5)表明：531位點(diǎn)突變42.9%(15/35)，其中531 TCG→TTG 為37.1%(13/35)；516位點(diǎn)突變54.3%(19/35)，其中516 GAC→GTC為31.4%(11/35)；511 CTG→CCG 14.3%(5/35)；526位點(diǎn)突變17.1%(6/35)，其中CAC→TAC為 8.6%(3/35)。

QC：基因芯片法有表面化學(xué)質(zhì)控探針；EC：雜交陽性外對照探針；BC：空白對照；NC：陰性對照探針；IC：內(nèi)對照探針。白色斑點(diǎn)為強(qiáng)信號(陽性)，綠色斑點(diǎn)為弱信號，無色斑點(diǎn)為無信號(陰性)。CAC-CTC表示堿基A突變?yōu)閴A基C，其他依此類推圖1，2 圖1為katG、inhA基因芯片掃描圖譜；圖2為rpoB基因芯片掃描圖譜

表4 基因芯片法與Spoligotyping法對137株臨床分離株的菌種鑒定比較(株)

藥敏試驗(yàn)基因芯片檢測法與絕對濃度法對利福平耐藥檢測結(jié)果的比較具體見表6。表明18株絕對濃度法輕度耐藥株中有16株基因芯片法rpoB基因突變，符合率即敏感度為88.9%(16/18)。19株高度耐藥菌株中全部基因芯片法rpoB基因突變,符合率即敏感度為100.0%(19/19)。45株絕對濃度法敏感株中有42株基因芯片法為野生型，特異度93.3%(42/45)，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，絕對濃度法檢測結(jié)果與基因芯片法檢測耐藥株檢測結(jié)果相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為41.3、51.6，P值均<0.01)。經(jīng)Kappa檢驗(yàn)，Kappa=0.81，U=10；Kappa=0.887，U=14.8，P<0.05。表明兩方法結(jié)果具有極強(qiáng)的一致性。

表5 35株利福平耐藥相關(guān)的rpoB基因突變位點(diǎn)分布

注 突變率=耐藥菌株某位點(diǎn)突變株數(shù)/耐藥菌株株數(shù)×100%

表6 基因芯片法與絕對濃度法對利福平耐藥檢測結(jié)果的比較

注 “+”：耐藥；“-”：敏感

4.藥敏試驗(yàn)基因芯片檢測法與絕對濃度法對異煙肼耐藥性檢測的結(jié)果：104株結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中絕對濃度法有45株為利福平和異煙肼敏感株；22株為異煙肼耐藥株；37株為利福平耐藥株。共67株結(jié)核分枝桿菌分離株，其中絕度濃度法和基因芯片法均為異煙肼耐藥分離株有21株， 與異煙肼耐藥相關(guān)的katG、inhA基因突變位點(diǎn)分布(表7)：katG基因315位點(diǎn)突變率100.0%(21/21)，其中katG315 AGC→ACC突變率為85.7%(18/21)；inhA基因15位點(diǎn)突變率0.0%(0/21)，15 C→T。

表7 21株異煙肼耐藥株(絕度濃度法和基因芯片法)相關(guān)的katG、inhA基因突變位點(diǎn)分布

注 突變率=耐藥菌株某位點(diǎn)突變株數(shù)/耐藥菌株株數(shù)×100%

藥敏試驗(yàn)基因芯片檢測法與絕對濃度法對結(jié)核分枝桿菌臨床分離株異煙肼耐藥性檢測的結(jié)果的比較具體見表8。13株絕對濃度法輕度耐藥株(1～10 μg/ml)中有12株基因芯片法katG基因突變，敏感度92.3%，0株基因芯片法inhA基因突變，敏感度0.0%。9株絕對濃度法檢測為高度耐藥株(10 μg/ml以上)中全部基因芯片法katG基因突變，敏感度100.0%；0株基因芯片法inhA基因突變，敏感度0.0%。45株絕對濃度法檢測為敏感株中，45株基因芯片法katG基因?yàn)橐吧?，特異度?00.0%；43株基因芯片法inhA基因?yàn)橐吧?，特異?5.6%?；蛐酒╧atG基因突變與絕對濃度法比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，基因芯片法檢測與絕對濃度法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為46.9、36.5，P值均<0.01)。經(jīng)Kappa檢驗(yàn)，Kappa=0.94，U=17.1；Kappa=1,U=∞，P值均<0.05；表明兩種方法結(jié)果一致性好。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，基因芯片法inhA突變與絕對濃度法檢測結(jié)果相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為0.01、0，P值均>0.05。經(jīng)Kappa檢驗(yàn)，Kappa=-0.08，U=-0.33;Kappa=0，U=0，P值均>0.05)。

表8 基因芯片法與絕對濃度法對異煙肼耐藥的檢測結(jié)果比較

注 “+”：耐藥；“-”：敏感

討 論

基因突變是導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥性的重要原因，有研究表明95%的結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥株有RNA聚合酶β亞單位編碼基因rpoB507-533位密碼子發(fā)生堿基突變[5]，至高度保守的氨基酸置換，空間構(gòu)象發(fā)生變化，最常見突變位點(diǎn)為531、526、516。結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥株主要有KatG基因和inhA基因堿基突變[6-7]，常見的為KatG基因315位密碼子AGC-ACC的突變，從而引起細(xì)胞過氧化氫-過氧化物酶活性降低，導(dǎo)致異煙肼活化效率降低，甚至不能活化。分枝桿菌酸細(xì)胞壁的合成所需成份之一為NADH依賴的enoyl-ACP還原酶，即inhA基因編碼的脂肪酸轉(zhuǎn)動(dòng)蛋白，活化的異煙肼能與NADH結(jié)合，抑制依賴的enoyl-ACP還原酶，從而阻止分枝桿菌酸細(xì)胞壁的合成，導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。如果inhA基因堿基突變，enoyl-ACP還原酶分泌受阻，活化的異煙肼不能與NADH結(jié)合，而導(dǎo)致耐藥。

基因芯片技術(shù)始創(chuàng)于20世紀(jì)90年代，是目前結(jié)核分枝桿菌菌種分型和耐藥分子診斷的先進(jìn)方法之一，很多學(xué)者應(yīng)用基因芯片方法報(bào)道了不同地區(qū)結(jié)核分枝桿菌菌種類型和耐藥基因突變位點(diǎn)，并與測序比較有很好的一致性，大多數(shù)是對耐利福平的rpoB基因和耐異煙肼的KatG基因和inhA基因突變位點(diǎn)的檢測。

筆者應(yīng)用基因芯片技術(shù)對收集的絕對濃度法耐利福平耐藥株37株，異煙肼耐藥株22株，全敏感株45株進(jìn)行了rpoB(19個(gè)位點(diǎn))、katG(4個(gè)位點(diǎn))、inhA(3個(gè)位點(diǎn))檢測，表明利福平輕度耐藥株敏感度為88.9%，高耐藥株敏感度為100.0%，特異度為93.3%，rpoB基因位點(diǎn)突變主要有42.9%的為531，17.1%為526，54.3%為516，14.3%為511位點(diǎn)突變。突變位頻率較高有531TCG→TTG 37.1%，516GAC→GTC 31.4%，511CTG→CCG 14.3%，與Huang等[5]對中國、日本、韓國等國家大多數(shù)結(jié)核分枝桿菌耐利福平菌株rpoB基因突變位點(diǎn)在Ser-531，Yao等[8]對重慶地區(qū)結(jié)核分枝桿菌臨床株rpoB、katG、inhA基因位點(diǎn)突變檢測表明突變頻率較高的基因位點(diǎn)為rpoB 531、rpoB 513，Mokrousov等[9]對北京地區(qū)結(jié)核分枝桿菌臨床株rpoB基因位點(diǎn)突變主要有58.9%的為531，12.4%為526，2.7%為516位點(diǎn)，Zhang等[10]對河南省耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株基因突變檢測表明53.8%為rpoB 531點(diǎn)突變，Deng等[11]對武漢地區(qū)60株確診為肺結(jié)核患者的臨床分離株應(yīng)用基因芯片技術(shù)分析rpoB基因型，結(jié)果表明531TCG→TTG突變率為47.3%，526CAC→TAC突變率為12.7%，516GAC→GTC突變率為5.5%比較有高度的一致性，表明各地區(qū)之間結(jié)核病利福平耐藥rpoB基因突變位點(diǎn)和頻率區(qū)別不大。

基因芯片法檢測表明異煙肼輕度耐藥敏感度為92.3%，高耐藥敏感度為100.0%，特異度為95.6%，katG基因位點(diǎn)突變有95.4%的為315位點(diǎn)突變，突變位點(diǎn)頻率較高有315AGC→ACC 81.8%。本研究的結(jié)果與報(bào)道的重慶、北京、河南、武漢結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥的敏感度、特異度相似[8-11]。

實(shí)驗(yàn)中2株inhA基因15突變均為敏感株，而耐藥株無inhA基因15突變，因此可以說INH耐藥至少在本地區(qū)可能與inhA基因15位突變無關(guān)，也可能為絕對濃度法定義的耐藥濃度高于比率法原因所致。與Yao等[8]報(bào)道的18%的inhA-15突變不一致，這可能是我國各地區(qū)結(jié)核病流行菌型差異所至。與Aragón 等[12]報(bào)道的31.6% inhA-15、10.5% inhA-8突變相差很大，可能是與西班牙巴塞羅那地區(qū)所在的國際環(huán)境結(jié)核分枝桿菌流行趨勢大相徑庭的緣故。也有中國研究人員在對本地區(qū)耐多藥結(jié)核病耐藥基因檢測研究中沒有把inhA基因選入檢測中[13]，這大概也是inhA在中國某些地區(qū)突變率低的緣故。表明異煙肼耐藥可能與inhA突變無關(guān)，也可能為絕對濃度法定義的耐藥濃度高于比率法的原因。

本研究對高耐藥結(jié)核分枝桿菌(利福平250 μg/ml以上；異煙肼10 μg/ml以上)芯片法檢測發(fā)現(xiàn)全部菌株都有耐藥基因突變。因此可以認(rèn)為高耐藥與結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變呈強(qiáng)相關(guān)。

王峰等[14]利用基因芯片法檢測了21株結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和50 株臨床分離株，結(jié)果表明：與PCR測序方法比較，兩種方法具有很好的一致性，且基因芯片鑒定分枝桿菌具有快速、特異、準(zhǔn)確率高的特點(diǎn)，筆者應(yīng)用北京博奧生物有限公司基因芯片與Spoligotyping方法對照檢測結(jié)果與王峰等的結(jié)果一致。可見基因芯片檢測方法與PCR測序和Spoligotyping方法均有較好的一致性，且基因芯片方法有檢測時(shí)間短(當(dāng)天可以出結(jié)果)、人為影響因素少、重復(fù)性好等特點(diǎn)，更適合臨床應(yīng)用。

張俊仙等[15]利用基因芯片法檢測了30株利福平、異煙肼敏感株和50株利福平、異煙肼耐藥株，結(jié)果表明，與基因測序比較，敏感株特異度為100%，利福平耐藥株rpoB基因突變率為86%，異煙肼耐藥株katG基因突變率為62%、inhA基因突變率僅為10%。本研究利用基因芯片法與傳統(tǒng)絕對濃度法檢測利福平和異煙肼耐藥性，比較結(jié)果與張俊仙等的結(jié)果一致，且本研究檢測inhA基因突變率為0%，與張俊仙等的僅10%突變率結(jié)果相近，表明異煙肼耐藥與inhA基因突變相關(guān)性不大。且基因芯片法結(jié)果的快速、準(zhǔn)確更是值得在臨床檢測中應(yīng)用。施美華等[16]應(yīng)用北京博奧生物有限公司基因芯片檢測了21株臨床標(biāo)本對INH的藥敏試驗(yàn)表明基因芯片法檢測菌株INH耐藥與傳統(tǒng)藥敏檢測方法比較，準(zhǔn)確率為73.8%,與DNA測序比較，芯片法檢測katG基因突變準(zhǔn)確率為88.9%。筆者基因芯片法檢測為絕對濃度法輕度耐藥株(1～10 μg/ml)中katG基因突變的敏感度92.3%(12/13)，絕對濃度法高耐藥株(10 μg/ml以上)中全部芯片法katG基因突變，敏感度100.0%(9/9)。高于施美華等的檢測結(jié)果。表明絕對濃度法結(jié)果比羅氏耐藥培養(yǎng)結(jié)果更準(zhǔn)確，因此新方法的驗(yàn)正應(yīng)以絕對濃度法為金標(biāo)準(zhǔn)。

總之，基因芯片法有較高的敏感度和特異度，且檢測時(shí)間短，檢測費(fèi)用一樣?；蛐酒ㄊ侵档猛茝V應(yīng)用的一種耐藥檢測方法。但基因芯片法需要昂貴的芯片、芯片雜交儀、芯片洗干儀、激光掃描儀等耗材和設(shè)備，不易在基層推廣，需要進(jìn)一步改進(jìn)。

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(本文編輯：王然 張曉進(jìn))

Identification ofMycobacteriumtuberculosisand its drug resistance with gene chip

SHI Guo-min, YU Rong, PENG Xue-feng, SHI Yan, NIE Ying, QI Zhi-qiang, CHEN Yong-jun, XIANG Yan-gen,LIU Zhong-quan.

Clinical Laboratory, Changsha Central Hospital, Changsha 410004, China

Corresponding author: LIU Zhong-quan, Email: Liuzq6608@tom.com

Objective Study on gene chip technique in detection of drug resistance of Mycobacterium tuberculosis and its clinical value. Methods (1) One hundred and thirty-seven strain identification of Mycobacterium clinical isolates from Changsha Central Hospital by gene chip and Spoligotyping technology from 2011-01 to 2012-12. (2)Drug-susceptibility test of rifampin and isoniazid to Mycobacterium tuberculosis clinical isolates by absolute concentration method. (3) Drug-susceptibility test of rifampin and isoniazid to Mycobacterium tuberculosis clinical isolates by DNA chips for rpoB, KatG, inhA. Rifampin resistant is one or a plurality of site mutation of rpoB gene, isoniazid resistance is one or a plurality of site mutation of katG gene and inhA gene. Compared Spoligotyping with gene chip method of species identification byKappatest, Compared the absolute concentration method with gene chip method of drug sensitivity byχ2test andKappatest. Results (1)For 45 rifampin sensitive (under 50 μg/ml) and isoniazid sensitive(under 1 μg/ml) isolates tested by absolute concentration method, 42 are wild type for rpoB gene with the sensitivity of 93.3%(1 for 511T-C mutations, 1 for 531C-T mutations, 1 for 516A-T mutations), 45 are wild type for KatG gene with the sensitivity of 100.0% and 43 are wild type for inhA gene with the sensitivity of 95.6%(2 for15C-T mutation) by DNA chip method, respectively. (2)For 18 rifampin-resistant (50-250 μg/ml) isolates tested by absolute concentration method, 16 has mutation in rpoB gene with the sensitivity of 88.9% by DNA chip method. Those mutations happened at 531,516,526,511 amino acid sites of rpoB. For 19 rifampin-resistant (above 250 μg/ml) isolates tested by absolute concentration method, 19 has mutation in rpoB gene with the sensitivity of 100% by DNA chip method. Those mutations happened at 531,516,526,511 amino acid sites of rpoB. (3)Compare the DNA chips with the absolute concentration method, for 13 isoniazid- resistance(1-10 μg/ml) isolates, 12 has mutation in KatG gene with the sensitivity of 92.3% by DNA chip method, which mainly happened at 315 site. No mutation related to the drug resistance was found in inhA gene. Compare the DNA chips with the absolute Concentration method, For 9 isoniazid- resistance(above 10 μg/ml) isolates, 9 has mutation in KatG gene with the sensitivity of 100% by DNA chip method, which mainly happened at 315 site. No mutation related to the drug resistance was found in inhA gene. (4)For 137 clinical isolates tested by Spoligotyping, 104 are Mycobacterium tuberculosis with the sensitivity of 100.0%(104/104), 7 are Mycobacterium avium complex with the sensitivity of 77.8%(7/9), 15 are Mycobacterium intracellulare with the sensitivity of 93.8%(15/16), 1 are Mycobacterium fortuitum with the sensitivity of 0.0%(0/0), 10 are Mycobacterium chelonei with the sensibility of 100.0%(8/8) by DNA chip method, respectively.Kappa=0.95,U=30.6,P<0.05. Conclusion The drug-sensitive test by DNA chips method matched the absolute concentration method very well. RFP-resistance was related to the mutations at the sites of 531,516,526,511 for rpoB gene, and INH-resistance was related to the mutations at the site of 315 for KatG gene. No mutation was found in inhA gene in INH-resistant isolates. DNA chip method might be a rapid and effective method for the detection of Mtb drug-resistant isolates and mycobacterium species.

Mycobacterium tuberculosis； Drug resistance, bacterial； Microbial sensitivity tests； Oligonucleotide array sequence analysis

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.01.013

“十二五”國家科技重大專項(xiàng)(2012ZX10005011-003-001)；首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(xiàng)(2011-1010-01)

410004 長沙市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科(石國民、喻容、彭雪峰、石燕、聶英、齊志強(qiáng)、陳擁軍、向延根)；北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所 耐藥結(jié)核病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (劉忠泉)

劉忠泉，Email：Liuzq6608@tom.com

2014-05-04)