劉銀萍 王全立 張俊仙 梁艷 陽幼榮 白雪娟 吳雪瓊

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·論著·

結(jié)核分枝桿菌Rv1419蛋白抗原表位的預(yù)測

劉銀萍 王全立 張俊仙 梁艷 陽幼榮 白雪娟 吳雪瓊

目的 預(yù)測結(jié)核分枝桿菌Rv1419蛋白的抗原表位。方法 利用DNAStar軟件包中Protean軟件對Rv1419氨基酸序列進(jìn)行分析，采用包括二級結(jié)構(gòu)、親水性、抗原性、可及性、柔韌性、電荷分布等多參數(shù)預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)及T細(xì)胞和B細(xì)胞抗原表位。結(jié)果 Rv1419蛋白具有豐富的二級結(jié)構(gòu)和多處抗原指數(shù)較高的區(qū)段，含有少數(shù)潛在的B細(xì)胞抗原肽表位(可能在67～70、72～82、142～154、131～137位氨基酸殘基或其附近)，這些表位抗原性較好，都含有β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)在表面的可能性和柔韌性都較大。該蛋白含有較多潛在的T細(xì)胞抗原肽表位(可能在5～15、18～22、29～32、43～55、58～62、64～68、86～97、99～109、110～114、117～123、126～128、136～140位氨基酸殘基或其附近)。結(jié)論 結(jié)核分枝桿菌Rv1419蛋白是一個T細(xì)胞抗原表位占優(yōu)勢的蛋白抗原，也存在B細(xì)胞抗原表位，本研究結(jié)果為該蛋白抗原表位的進(jìn)一步研究、應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

表位； 細(xì)菌蛋白質(zhì)類； 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu), 二級； 結(jié)核分枝桿菌

目前，Mtb標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv和臨床株CDC1551全基因組測序均已完成，但對Mtb感染后如何與宿主相互作用尚不十分清楚。Mtb抗原能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)物(如抗體和致敏淋巴細(xì)胞)在體外結(jié)合，發(fā)生免疫效應(yīng)。宿主免疫細(xì)胞通過其表面受體識別的并不是整個蛋白質(zhì)抗原分子，而是抗原肽分子中由特殊的化學(xué)基團(tuán)組成的結(jié)構(gòu)，即表位(epitope)，又稱為抗原決定簇(antigenic determinant)。一個蛋白質(zhì)抗原不僅含有B細(xì)胞、T細(xì)胞[輔助性T細(xì)胞(T helper cell,Th細(xì)胞)、CD8+、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)]等和自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK細(xì)胞)與免疫識別密切相關(guān)的表位結(jié)構(gòu)，也含有一些對于保護(hù)性免疫不利的表位結(jié)構(gòu)。因此，抗原優(yōu)勢表位的篩選和鑒定對表位疫苗的研制具有重要的意義，Mtb蛋白抗原表位的免疫學(xué)特性成為當(dāng)前研究的熱點之一。

圖1 結(jié)核分枝桿菌Rv1419蛋白二級結(jié)構(gòu)和抗原表位預(yù)測

Mtb Rv1419基因全長474 bp，編碼157個氨基酸，蛋白等電點4.1155，預(yù)測相對分子質(zhì)量為16 853(16.853 kDa)，成熟蛋白相對分子質(zhì)量為13 600(13.6 kDa)[1]。其N端含有33個氨基酸的信號肽(MGELRLVGGVLRVLVVVGAVFDVAVLNAG-AASA)，存在于H37Rv株的培養(yǎng)濾液中，可能是分泌蛋白[2-4]。生物信息學(xué)分析顯示，Rv1419蛋白可能是凝集素或凝集素樣分子[1,5]，這種凝集素可以調(diào)節(jié)多種生物過程，比如細(xì)胞與細(xì)胞間的黏附、細(xì)胞的有絲分裂和固有免疫過程等，尤其是在宿主-病原體相互作用中發(fā)揮重要作用。因此，本研究首次應(yīng)用DNAStar生物信息學(xué)軟件對Mtb Rv1419蛋白進(jìn)行抗原表位預(yù)測，為今后進(jìn)一步的深入研究和應(yīng)用，尤其是疫苗和免疫診斷試劑的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

材料和方法

1. 抗原表位分析軟件：DNAStar軟件包是DNASTAR有限公司開發(fā)的生物軟件，可在計算機(jī)上進(jìn)行DNA和蛋白質(zhì)分析。用DNAStar軟件包中Protean軟件對蛋白的二級結(jié)構(gòu)和抗原表位進(jìn)行分析和預(yù)測[6]。

2. Mtb Rv1419蛋白氨基酸全序列(157個氨基酸殘基)：見圖1。

3. Rv1419蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測：采用Gamier-Robson方法、Chou-Fasman方法和Coiled Coil方法預(yù)測Rv1419蛋白二級結(jié)構(gòu)。Gamier-Robson方法是通過計算特定氨基酸殘基在特定結(jié)構(gòu)內(nèi)部的可能性來預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；Chou-Fasman方法是通過序列氨基酸殘基的晶體結(jié)構(gòu)來預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；Coiled Coil方法是預(yù)測跨膜區(qū)的阿爾法螺旋。

4. Rv1419蛋白抗原表位的預(yù)測：用Kyte-Doolittle方法、Hopp-Woods方法和Eisenberg方法對Rv1419蛋白的疏水性和親水性進(jìn)行了分析；用Emini方法預(yù)測蛋白的表面可能性；用Karplus-Schulz方法預(yù)測蛋白質(zhì)骨架區(qū)的柔韌性；以Jameson-Wolf方法預(yù)測蛋白潛在的抗原表位，以AMPHI方法預(yù)測蛋白免疫優(yōu)勢輔助性T淋巴細(xì)胞抗原位點，以Rothbard-Taylor方法預(yù)測含有特定基序(motif)的潛在 T 淋巴細(xì)胞抗原表位，以Sette MHC Motifs方法預(yù)測短肽上與老鼠 MHC Ⅱ d 型蛋白質(zhì)相互作用的抗原位點，最后綜合評價Rv1419蛋白抗原表位。

結(jié) 果

1.Rv1419蛋白二級結(jié)構(gòu)和抗原表位預(yù)測：見圖1。

2. Rv1419蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測：蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)與其B細(xì)胞表位的分布關(guān)系密切。綜合采用Gamier-Robson、Chou-Fasman和Coiled Coil共3種方法預(yù)測Rv1419蛋白二級結(jié)構(gòu)的結(jié)果顯示，α螺旋結(jié)構(gòu)形成在10～15、18～26、37～40、95～99氨基酸殘基，數(shù)量較少，不存在跨膜區(qū)的α螺旋結(jié)構(gòu)；β折疊數(shù)量較多，分布較均勻(位于1～27、33～50、56～62、68～72、79～84、88～93、96～101、103～107、111～115、118～130、137～141、153～156氨基酸殘基)，其中在4～26、56～61、125～130、138～141氨基酸殘基的分值較高。該蛋白在各β折疊單元之間存在較多長短不一的轉(zhuǎn)角；在28～29、73～77、85～86、94～95、132～135氨基酸殘基存在無規(guī)則卷曲。

3．Rv1419蛋白的親水性分析：用Kyte-Doolittle方法對Rv1419蛋白的疏水性和親水性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示：Rv1419蛋白存在7個疏水性區(qū)域(位于2～30、43～52、56～63、83～89、91～94、121～123、125～131氨基酸殘基)和6個親水性區(qū)域(36～42、53～55、64～82、105～114、116～120、132～157)。親水性區(qū)域提示其暴露于表面的概率較大，作為抗原表位的可能性也最大。

4. Rv1419蛋白的表面可能性和柔韌性分析：Rv1419蛋白呈現(xiàn)在表面可能性較大的區(qū)域主要是在38～40、67～70、72～79、147～154氨基酸殘基，其他部位展示的可能性較小或表現(xiàn)為負(fù)值。

Rv1419蛋白含有較多的柔韌性區(qū)域(位于33～45、50～55、63～70、75～81、86～88、114～123、131～141、145～154氨基酸殘基)，且分布比較均勻。提示該蛋白肽段的柔韌性較大，發(fā)生扭曲、折疊的概率較高，能形成豐富的二級結(jié)構(gòu)。

5. Rv1419蛋白B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位的預(yù)測分析：聯(lián)合上述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及抗原性預(yù)測方法，綜合分析推測Rv1419蛋白潛在的B細(xì)胞抗原表位位于67～70、72～82、142～154、131～137氨基酸殘基，若再結(jié)合親水性、表面可及性和柔韌性，前3個多肽親水性指數(shù)比較高，暴露于表面的概率較大，肽段的柔韌性較大，發(fā)生扭曲、折疊的概率較高，能形成豐富的二級結(jié)構(gòu)。因此，作為B細(xì)胞抗原表位的可能性較大，尤其是蛋白質(zhì)的C端具有較好的親水性、表面可及性和柔韌性，將是很好的B細(xì)胞抗原表面區(qū)域。

潛在的T細(xì)胞抗原表位位于5～15、18～22、29～32、43～55、58～62、64～68、86～97、99～109、110～114、117～123、126～128、136～140氨基酸殘基，其中9～15、43～55、58～62、64～68、86～97、99～109、119～123、126～128位氨基酸殘基可能是免疫優(yōu)勢的輔助性 T 淋巴細(xì)胞抗原位點，11～16和28～33位氨基酸殘基可能是與小鼠 MHC Ⅱd 型蛋白質(zhì)相互作用的抗原位點。

討 論

結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，天然蛋白抗原的獲取較困難，通過基因工程技術(shù)獲得重組蛋白抗原進(jìn)行研究應(yīng)用已成為一個簡便、有效的途徑。此外，近年來結(jié)核病疫苗如重組蛋白疫苗、重組卡介苗、DNA疫苗的研發(fā)[7]，有些己經(jīng)進(jìn)入臨床試驗，而生物信息技術(shù)的迅猛發(fā)展和互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫的開發(fā)利用已為確定蛋白優(yōu)勢抗原表位提供了有效的方法，使得研究者不需要克隆整個蛋白，可根據(jù)不同的需求有選擇地克隆抗原表位，去除了蛋白抗原中的不利因素，使免疫反應(yīng)集中針對強(qiáng)免疫原性的抗原表位；預(yù)測到更可能成為抗原表位的肽段，也就不需要合成許多重疊的多肽段進(jìn)行篩選、評價，只需根據(jù)生物信息學(xué)軟件的預(yù)測結(jié)果選擇合成不同的多肽，顯著降低了候選肽段的數(shù)目，減少了合成肽段的費(fèi)用和體外試驗鑒定的工作量；而且縮短了時間，也避免遺漏掉一些較長的抗原表位。利用生物信息學(xué)軟件的強(qiáng)大功能進(jìn)行表位預(yù)測，將為表位疫苗的發(fā)展、免疫診斷制劑的開發(fā)開辟新的路徑[8]。

DNAStar軟件包中Protean軟件已被用于蛋白抗原表位的預(yù)測[9-10]，如丁淑琴等[10]應(yīng)用該軟件分析結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示其二級結(jié)構(gòu)中含有較多的α螺旋結(jié)構(gòu)(占78%)，β折疊、轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲較少，分別只有1%、5%和16%。而本研究應(yīng)用DNAStar軟件包中Protean軟件對Rv1419氨基酸序列進(jìn)行分析，預(yù)測該蛋白的二級結(jié)構(gòu)與結(jié)核分枝桿菌ESAT-6的二級結(jié)構(gòu)明顯不同，Rv1419蛋白β折疊、轉(zhuǎn)角的數(shù)量較多，而α螺旋結(jié)構(gòu)較少。α螺旋和β折疊化學(xué)鍵鍵能比較高，形態(tài)固定，結(jié)構(gòu)規(guī)則不易變形，常處于蛋白質(zhì)內(nèi)部，較難結(jié)合抗體，一般不作為抗原表位。β轉(zhuǎn)角為凸出結(jié)構(gòu)，與無規(guī)則卷曲多出現(xiàn)在蛋白質(zhì)的表面，結(jié)構(gòu)松散，有利于與抗體結(jié)合，較可能成為B細(xì)胞抗原表位。

本研究圖1清楚地顯示了Rv1419蛋白可能的B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原優(yōu)勢表位，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有較多潛在的T細(xì)胞抗原肽表位和少數(shù)潛在的B細(xì)胞抗原肽表位，是一個T細(xì)胞抗原表位占優(yōu)勢的蛋白抗原，與筆者前期的研究結(jié)果及Nogueira等[1]的研究報道一致。Rv1419蛋白具有很好的免疫原性和抗原性，在活動性肺結(jié)核患者中，可刺激外周血單個核細(xì)胞(PBMC)產(chǎn)生大量的IFN-γ；在活動性肺結(jié)核患者的血清中可檢出高滴度的抗Rv1419 IgG抗體；其DNA疫苗免疫小鼠后可在小鼠體內(nèi)高效表達(dá)，并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答[11]。鑒于抗結(jié)核免疫主要是細(xì)胞免疫，該抗原可能在抗結(jié)核分枝桿菌感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要和獨特的作用。本研究結(jié)果為該抗原進(jìn)一步深入研究，使之成為疫苗組分之一或細(xì)胞免疫刺激原奠定了理論基礎(chǔ)。

但下列幾個問題值得注意：(1)應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測出來的只是理論優(yōu)勢表位，還需要進(jìn)一步通過功能試驗方法進(jìn)行驗證，如B細(xì)胞表位可通過Western blot和ELISA分析其抗原抗體反應(yīng)親和力；T細(xì)胞表位可通過T 細(xì)胞增殖性試驗、細(xì)胞殺傷實驗、流式細(xì)胞技術(shù)、酶聯(lián)免疫斑點試驗(enzyme linked immunospot assay, ELISPOT)技術(shù)等鑒定。目前，筆者正在進(jìn)行Rv1419蛋白潛在的T細(xì)胞抗原肽表位的驗證工作。(2)應(yīng)用DNAStar軟件包中Protean軟件進(jìn)行表位預(yù)測，并不一定完全正確，有些優(yōu)勢表位可能未能預(yù)測到，也可能存在預(yù)測錯誤，可多選擇幾個公認(rèn)的軟件進(jìn)行預(yù)測，然后再合成多肽表位做進(jìn)一步的體外驗證試驗。(3)只有少部分B細(xì)胞表位是線性表位，絕大部分(約90%)是構(gòu)象型表位[11]，而DNAStar軟件是在氨基酸一級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上應(yīng)用多個參數(shù)預(yù)測B細(xì)胞抗原表位，如二級結(jié)構(gòu)、親水性、抗原性、可及性、柔韌性、電荷分布等，忽略了各氨基酸之間的分子作用力，因此， 對構(gòu)象依賴的B細(xì)胞表位的預(yù)測有一定局限性。(4)T細(xì)胞表位都是線性表位[12]，但DNAStar軟件用于預(yù)測T細(xì)胞表位的參數(shù)較少，也不能進(jìn)一步預(yù)測Th1型T細(xì)胞表位和CTL表位，這不利于抗結(jié)核疫苗的設(shè)計。Zhu等[13]應(yīng)用SYFPEITHI超基序法、BIMAS量化基序法和NetCTL法預(yù)測并合成了幾個結(jié)核分枝桿菌Rv1410c 蛋白的CTL 表位，驗證發(fā)現(xiàn)天然肽表位Rv1410c-p510 (TLAPQVEPL)和改造的肽表位Rv1410c-p510-1Y9V (YLAPQVEPV)與HLA-A*0201分子均具有較好的親和力和穩(wěn)定性，并能夠誘導(dǎo)IFN-γ釋放，但Rv1410c-p510只能在體外誘導(dǎo)CTL反應(yīng)，而Rv1410c-p510-1Y9V無論在體外還是在體內(nèi)均能夠誘導(dǎo)CTL反應(yīng)。因此，筆者將聯(lián)合應(yīng)用其他抗原表位預(yù)測軟件進(jìn)一步預(yù)測T細(xì)胞表位，以提高預(yù)測的準(zhǔn)確度和特異度。

總之，結(jié)核分枝桿菌Rv1419是一個T細(xì)胞抗原表位占優(yōu)勢的蛋白抗原，也存在B細(xì)胞抗原表位。應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測蛋白抗原表位可為蛋白免疫學(xué)特性的研究及其應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

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(本文編輯：薛愛華)

Prediction of epitopes ofMycobacteriumtuberculosisRv1419 protein

LIU Yin-ping*, WANG Quan-li，ZHANG Jun-xian, LIANG Yan, YANG You-rong, BAI Xue-juan, WU Xue-qiong.

*Department of Blood Transfusion, The Affiliated Hospital of the Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071, China

Corresponding author： WANG Quan-li，Email：13691110351@163.com WU Xue-qiong，Email：wu-xueqiong@263.net

Objective To predict the epitopes of Mycobacterium tuberculosis Rv1419 protein. Methods The amino acid sequence of Rv1419 protein was input and predicted B cell and T cell epitopes using multi-parameters including the secondary structure, hydrophilicity, antigenicity, accessibility, flexibility, charge distribution by Pro-tean software of DNAStar software package. Results The Rv1419 protein has rich secondary structure and multiple sections with higher antigenicity. There were a few potential B cell epitopes at 67-70, 72-82, 142-154, 131-137 amino acid residues or nearby, these epitopes had better antigenicity, contained beta angle and irregular coil structure, present in the surface probability and had larger flexibility. There also were more potential T cell epitopes of the protein containing at 5-15, 18-22, 29-32, 43-55, 58-62, 64-68, 86-97, 99-109, 110-114, 117-123, 126-128, 136-140 amino acid residues or nearby. Conclusion Mycobacterium tuberculosis Rv1419 protein is a T-cell-epitope dominant antigen, B cell epitopes also exists, which will lay the foundation for its further study and application.

Epitopes； Bacterial proteins； Protein structure, secondary； Mycobacterium tuberculosis

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.01.011

100071 北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院輸血科(劉銀萍、王全立)；解放軍第三〇九醫(yī)院全軍結(jié)核病研究所 全軍結(jié)核病防治重點實驗室[劉銀萍(研究生)、張俊仙、梁艷、陽幼榮、白雪娟、吳雪瓊]

王全立，Email:13691110351@163.com；吳雪瓊，Email: wu-xueqiong@263.net

2014-08-07)