韓 煜，楊 沫，謝曉梅，程菁菁，王 鍵（安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/安徽省“115”新安醫(yī)藥研究與開發(fā)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，合肥 230012）

中藥木瓜又名皺皮木瓜，為薔薇科木瓜屬植物貼梗海棠Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai的干燥近成熟果實(shí)[1]，主產(chǎn)于安徽宣城、重慶綦江、湖北資丘及云南等地，歷代本草以宣木瓜為道地藥材。木瓜含有有機(jī)酸、三萜類、多酚和多糖等[2-4]。植物多酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的復(fù)雜次生代謝產(chǎn)物。隨著多酚類成分在抗氧化、抗癌、防治心血管疾病等多方面活性的研究不斷深入[5-8]，植物多酚已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一[9]。但目前鮮見中藥木瓜多酚較為系統(tǒng)的研究報(bào)道。本文通過雙波長(zhǎng)切換高效液相色譜（HPLC）法和Folin-Ciocalteau比色法對(duì)國(guó)內(nèi)主要產(chǎn)地木瓜中綠原酸、原兒茶酸和總酚含量進(jìn)行比較，考察多酚與綠原酸、原兒茶酸含量的相關(guān)性，以為木瓜的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)，并為其深度研究與開發(fā)利用積累試驗(yàn)資料。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括二元泵系統(tǒng)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器和ChemStation色譜工作站（美國(guó)Agilent公司）；756MC型紫外可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；BP221D型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q實(shí)驗(yàn)室超純水器（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試劑

綠原酸對(duì)照品（批號(hào):110753-200413）、原兒茶酸對(duì)照品（批號(hào):110809-200604）和沒食子酸對(duì)照品（批號(hào):110831-200302）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；乙腈為色譜純，磷酸、甲醇等為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

木瓜藥材產(chǎn)地及收集地詳見表1。所有樣品經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)彭華勝教授鑒定為薔薇科植物貼梗海棠C.speciosa（Sweet）Nakai的果實(shí)，用前粉碎，過80目篩，混合均勻。

表1 木瓜藥材產(chǎn)地和收集地Tab 1 The different habitats and collected areas of C.sinensis

2 方法與結(jié)果

2.1 原兒茶酸和綠原酸的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱:Shim-pack CLC-ODS（M）柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相:乙腈-0.1%磷酸水溶液（15∶85，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)為259nm和325nm，波長(zhǎng)切換程序?yàn)?0～14min，259nm，14～25min，325nm；流速:0.5ml/min；柱溫:25 ℃；進(jìn)樣量:20μl。理論板數(shù)以原兒茶酸和綠原酸峰計(jì)，分別為14000、14500，測(cè)量峰與相鄰峰分離度均大于5。色譜詳見圖1。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取原兒茶酸對(duì)照品7.07mg、綠原酸對(duì)照品7.24mg，分別置于5ml量瓶中，加50%甲醇使溶解，定容，搖勻，制成原兒茶酸、綠原酸對(duì)照品貯備液；精密移取原兒茶酸對(duì)照品貯備液0.5ml、綠原酸對(duì)照品貯備液2ml，分別置于10ml量瓶中，加50%甲醇定容，制成每1ml含原兒茶酸0.0707mg和綠原酸0.2896mg的對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取木瓜供試品約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率:250 W，頻率:40 kHz）處理30min，放冷，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.宣城木瓜（編號(hào) 6）；C.云南木瓜（編號(hào)13）；D.四川木瓜（編號(hào)11）；E.湖北木瓜（編號(hào)8）；1.原兒茶酸；2.綠原酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference；B.C.sinensis from Xuancheng（No.6）；C.C.sinensis Yunnan（No.13）；D.chaenomelis fructus from Sichuan（No.11）；E.C.sinensis from Hube（iNo.8）；1.protocatechuic acid；2.chlorogenic acid

2.1.4 檢測(cè)波長(zhǎng)和切換時(shí)間 采用二極管陣列檢測(cè)器，在200～400nm波長(zhǎng)范圍掃描并記錄與原兒茶酸、綠原酸保留時(shí)間相同的供試品色譜峰的紫外光譜，并與原兒茶酸、綠原酸光譜圖比較。結(jié)果顯示，供試品中與對(duì)照品保留時(shí)間相同的色譜峰，其紫外光譜與對(duì)照品一致，詳見圖2。依據(jù)所得光譜，分別選擇原兒茶酸最大吸收波長(zhǎng)259nm和綠原酸最大吸收波長(zhǎng)325nm為各自的檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)合供試品在259nm和325nm的色譜圖，最終確定波長(zhǎng)切換時(shí)間在進(jìn)樣14min時(shí)。

2.1.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取原兒茶酸對(duì)照品溶液0.5、3.0、10.0、30.0、35.0μl，綠原酸對(duì)照品溶液 1.0、2.0、5.0、10.0、15.0μl，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，依序注入HPLC儀，以色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得原兒茶酸的回歸方程為y＝5603x+203.5（r＝0.9995），綠原酸的回歸方程為y＝4075x+757.9（r＝0.9995）；表明原兒茶酸、綠原酸的進(jìn)樣量分別在0.0354～2.47、0.289～4.34μg范圍內(nèi)與各自峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次測(cè)定。結(jié)果，原兒茶酸、綠原酸峰面積的RSD分別為1.52%、1.04%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品（編號(hào)6）溶液適量，分別于配制0、1、2、4、12h時(shí)按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，原兒茶酸、綠原酸峰面積的RSD分別為2.90%、0.21%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批木瓜供試品（編號(hào)6）6份，精密稱定，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，原兒茶酸、綠原酸含量的RSD分別為2.29%、1.80%，表明本方法重復(fù)性較好。

圖2 紫外光譜圖A.原兒茶酸；B.綠原酸；C.與原兒茶酸保留時(shí)間相同的成分；D.與綠原酸保留時(shí)間相同的成分Fig 2 UV spectrumA.protocatechuic acid；B.chlorogenic acid；C.compound with the same retention time as protocatechuic acid；D.compound with the same retention time as chlorogenic acid

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批已知含量的木瓜供試品（編號(hào)6）0.5 g，精密稱定，分別準(zhǔn)確加入一定量的原兒茶酸和綠原酸對(duì)照品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果詳見表2。

表2 原兒茶酸和綠原酸的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of recovery test of protocatechuic acid and chlorogenic acid（n＝6）

2.1.10 原兒茶酸和綠原酸的含量測(cè)定 取不同產(chǎn)地的木瓜供試品各適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算原兒茶酸和綠原酸含量。

2.2 總酚的含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取置五氧化二磷干燥器中的沒食子酸、綠原酸和原兒茶酸對(duì)照品適量，分別置于5ml量瓶中，加甲醇使溶解，定容，搖勻，制成每1ml含沒食子酸0.199mg、綠原酸0.224mg和原兒茶酸0.193mg的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取木瓜供試品0.1 g，精密稱定，精密加入50%甲醇25ml，稱質(zhì)量，超聲（功率:250 W，頻率:40 kHz）處理30min，冷卻，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，收集續(xù)濾液，即得。

2.2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)和指標(biāo)成分的選擇 精密移取綠原酸、原兒茶酸和沒食子酸對(duì)照品溶液及供試品溶液各適量，分別置于25ml量瓶中，加Folin-Ciocalteau試液1.0ml，超純水10ml，用7.5%Na2CO3溶液稀釋至刻度，搖勻，室溫放置2 h，以空白試液為參照，在300～800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，記錄紫外吸收光譜，詳見圖3。結(jié)果表明，各對(duì)照品和供試品溶液顯色后，吸收光譜相似，最大吸收均在763nm波長(zhǎng)處；其中，沒食子酸是2010年版《中國(guó)藥典》（一部）總酚測(cè)量的指標(biāo)成分[1]，課題組在對(duì)木瓜酚類成分預(yù)試驗(yàn)中，檢出了原兒茶酸和綠原酸，較少檢出沒食子酸；考慮原兒茶酸較綠原酸易得，故選擇原兒茶酸為木瓜總酚測(cè)量的指標(biāo)成分。

圖3 吸收光譜圖1.沒食子酸；2.原兒茶酸；3.木瓜供試品（編號(hào) 3）；4.綠原酸Fig 3 Absorption spectra1.gallic acid；2.protocatechuic acid；3.test sample of C.sinensis（No.3）；4.chlorogenic acid

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密移取“2.2.1”項(xiàng)下原兒茶酸對(duì)照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，置于 25ml量瓶中，加Folin-Ciocalteau試液1.0ml，超純水 10ml，用 7.5%Na2CO3溶液稀釋至刻度，搖勻，室溫放置2 h，以空白試液為參照，在763nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以對(duì)照品進(jìn)樣量（x，mg）為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得原兒茶酸的回歸方程為 y＝4.49x+0.0727（r＝0.9991），表明原兒茶酸進(jìn)樣量在0.0193～0.193mg范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密移取對(duì)照品溶液1.0ml，按上述方法測(cè)量吸光度，平行6次。結(jié)果，吸光度的RSD為0.45%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密移取供試品（編號(hào)3）溶液1.0ml，按上述方法操作，顯色后分別于放置0、2、3、3.5、4 h時(shí)測(cè)定。結(jié)果，吸光度的RSD為0.89%，表明供試品溶液在4 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一木瓜供試品（編號(hào)3）0.1 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按上述方法操作，平行測(cè)定6次，計(jì)算總酚含量。結(jié)果，RSD為1.50%，表明本方法重復(fù)性較好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批已知含量的木瓜供試品（編號(hào)3）約50mg，精密稱定，準(zhǔn)確加入適量原兒茶酸對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按上述方法操作，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果詳見表3。

2.2.9 總酚含量測(cè)定 取木瓜供試品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液；精密移取續(xù)濾液1.0ml，置于25ml量瓶中，加Folin-Ciocalteau試液1.0ml，超純水 10ml，用 7.5%Na2CO3溶液稀釋至刻度，搖勻，室溫放置2 h，以空白試液為參照，在763nm處測(cè)定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算供試品中總酚含量。

表3 總酚的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 3 Result of recovery test of total phenolics（n＝6）

2.3 不同產(chǎn)地木瓜中總酚、綠原酸和原兒茶酸的含量測(cè)定結(jié)果

取不同產(chǎn)地木瓜供試品各適量，按“2.1.10”項(xiàng)下方法測(cè)定原兒茶酸和綠原酸含量，再按“2.2.9”項(xiàng)下方法測(cè)定總酚含量，結(jié)果詳見表4。

表4 不同產(chǎn)地木瓜中總酚、綠原酸和原兒茶酸的含量測(cè)定結(jié)果（n＝2，%）Tab 4 Mass fractions of total phenolics，chlorogenic acid and protocatechuic acid in C.sinensis from different areas（n＝2，%）

3 討論

綠原酸和原兒茶酸屬于酚酸類化合物，分子結(jié)構(gòu)中都同時(shí)存在多酚和羧酸官能團(tuán)，是目前發(fā)現(xiàn)的木瓜多酚的主要成分。李霞等[10]采用梯度洗脫分離和254nm檢測(cè)分析木瓜中綠原酸和原兒茶酸的含量。本法在等度洗脫的條件下，通過波長(zhǎng)切換在綠原酸和原兒茶酸各自最大吸收波長(zhǎng)處檢測(cè)，提高了分析效率和檢測(cè)靈敏度。預(yù)試驗(yàn)中對(duì)流動(dòng)相組成（甲醇、乙腈、磷酸溶液及其體積比）、流速和柱溫等進(jìn)行考察，最終確定為本研究中所用的分離條件。

總酚的含量測(cè)定常用Folin-Ciocalteau比色法[11]和三氯化鐵-鐵氰化鉀比色法[12]。前期試驗(yàn)對(duì)兩種方法進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)在木瓜的總酚的含量測(cè)定中，后者顯色后吸光度穩(wěn)定時(shí)間較短，方法學(xué)考察項(xiàng)目的RSD較前者稍難以控制，故采用了Folin-Ciocalteau比色法。依據(jù)2010年版《中國(guó)藥典》（一部）附錄收載方法[1]并進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)不同提取溶劑（10%、30%、50%、70%甲醇）進(jìn)行了提取試驗(yàn)，對(duì)不同超聲提取時(shí)間（10、30、60min）進(jìn)行了試驗(yàn)，以及對(duì)Folin-Ciocalteau試液加入量、顯色后暗處放置時(shí)間和Na2CO3溶液體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行試驗(yàn)，最終確定了本研究中木瓜總酚的最佳測(cè)量條件。

木瓜具有舒筋活絡(luò)、和胃化濕的功效，但目前對(duì)其功效的物質(zhì)基礎(chǔ)還不甚明了。本課題組基于對(duì)中藥物質(zhì)基礎(chǔ)“具有三個(gè)層次多維結(jié)構(gòu)”[13]的認(rèn)識(shí)，對(duì)宣木瓜組分進(jìn)行較為系統(tǒng)的分析檢測(cè)，已開展宣木瓜總?cè)坪蛦误w成分齊墩果酸熊果酸[14]、宣木瓜總有機(jī)酸和單體有機(jī)酸、宣木瓜總多糖和單體多糖的含量分析研究。從本研究結(jié)果看，不同產(chǎn)地木瓜均含有總酚、綠原酸和原兒茶酸；總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.87%～3.77%，平均值2.16%；綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.053%～0.387%，平均值0.192%；原兒茶酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.024%～0.541%，平均值0.087%；不同產(chǎn)地總酚含量高低順序?yàn)?云南木瓜＞宣木瓜＞川木瓜＞湖北木瓜；綠原酸和原兒茶酸總量的產(chǎn)地高低順序與總酚相同。Pearson相關(guān)系數(shù)為0.719（P＜0.01），表明總酚含量與綠原酸和原兒茶酸總量之間存在一定正相關(guān)性。在對(duì)綠原酸與原兒茶酸含量比例分析中發(fā)現(xiàn)，所測(cè)樣品中宣木瓜均處于較高的比值水平，且綠原酸和原兒茶酸總量占總酚含量比例也處于較高值，數(shù)值相對(duì)穩(wěn)定，這一現(xiàn)象是否附有產(chǎn)地特征尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本文所建方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可綜合用于木瓜的質(zhì)量分析。

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