尹偉力，林 超，劉 寧，賈 鵬，岳志芹，孫 濤，劉 葒

（1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山東 青島 266002；2.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518000；3.煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 煙臺(tái) 264000）

傳染性造血器官壞死?。╥nfectious haematopoietic necrosis，IHN）又名大鱗大馬哈魚病毒?。–hinook salmon virus disease）、紅大馬哈魚病毒?。⊿ockeye salmon virus disease）等[1]，是一種毒力很強(qiáng)能引起感染魚類急性、全身感染的嚴(yán)重傳染病。病原為傳染性造血器官壞死病毒（infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV），屬?gòu)棤畈《究屏Ｍ鈴棤畈《緦俪蓡T，可侵害多種淡水、海水養(yǎng)殖魚類，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)危害極大[2]。

IHN最早發(fā)現(xiàn)于二十世紀(jì)四十年代的北美洲鮭魚養(yǎng)殖場(chǎng)[3]，隨后迅速蔓延至歐洲[4]，1968年傳入日本[5]，1988年傳至我國(guó)，并在局部地區(qū)暴發(fā)[6]。該病被列入世界動(dòng)物衛(wèi)生組織水生動(dòng)物疫病名錄，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病。

細(xì)胞分離是檢測(cè)IHNV的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但該方法操作復(fù)雜、檢測(cè)周期長(zhǎng)[7-8]。液相芯片技術(shù)是一種新型快速檢測(cè)技術(shù)，該方法集流式細(xì)胞術(shù)、納米熒光微球、熒光信號(hào)數(shù)字處理和傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光技術(shù)為一體[9-13]，其優(yōu)勢(shì)在于所需檢測(cè)樣本量少，檢測(cè)周期短，既可檢測(cè)核酸也可檢測(cè)抗體[14]。本試驗(yàn)采用RT-PCR檢測(cè)方法與液相芯片檢測(cè)技術(shù)結(jié)合，建立了IHNV的液相芯片快速檢測(cè)方法，為IHNV檢測(cè)提供了新手段。

1 材料與方法

1.1 毒株核酸

傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）、流行性造血器官壞死病毒（EHNV）、病毒性出血性敗血癥病毒（VHSV）和傳染性胰臟壞死病毒（IPNV）核酸由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心提供；鯉春血癥病毒（SVCV）株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑與設(shè)備

表面羧基化的熒光編碼微球、鞘液、甲基咪唑（TE）、碳二亞胺購(gòu)自美國(guó)BD公司；TMAC（tetramethyl-ammonium chloride）、Tris、SDS（10%solution）、鏈霉菌抗生物素蛋白－藻紅蛋白（SAPE）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；SPAE Streptavidin-R-phycoerythrin購(gòu)自美國(guó)Prozyme公司；RNA提取試劑盒（Takara MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.3.0）、RT-PCR試 劑 盒（RT-PCR Kit II）、DL2000 Marker購(gòu)自大連寶生物公司。

主要設(shè)備：BD FACSArray液相芯片儀（美國(guó)BD公司）；Eppendorf Mastercycler Gradient梯度PCR擴(kuò)增儀（德國(guó)Eppendorf公司）；AlphamagerTM2200凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)AP公司）；Eppendorf高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）等。

1.3 引物探針的設(shè)計(jì)

通過Internet登陸美國(guó)國(guó)家生物信息技術(shù)中心（NCBI），查詢檢索已公布的IHNV N基因序列（AY442518.1），利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物和探針，上、下游引物5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記；探針5’端進(jìn)行氨基化修飾（表1）。

表1 引物及探針序列

1.4 RT-PCR反應(yīng)體系的建立

采用RNA提取試劑盒（大連寶生物公司）提取IHNV RNA。RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系：在0.2mL PCR反應(yīng)管中，依次加入10×RT-PCR buffer 2.5mL、dNTP（各 2.5mmol/L）2.5mL、10pmol/mL F10.5mL、10pmol/mL R10.5mL、Inhibiter 0.5mL、AMV XL 0.5mL、AMV Taq（5U/mL） 0.5mL、25mmol/L MgCl25.0mL、總 RNA 3.0mL，加入雙蒸水使反應(yīng)體積達(dá)到25mL。以上反應(yīng)體系中，除了引物、總RNA和雙蒸水，其它組分均為RT-PCR試劑盒的組分。RT-PCR反應(yīng)程序：50℃ 30min；94℃ 2min；然后 94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 30s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min，4℃保溫。

擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠圖像分析系統(tǒng)上觀察、分析擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.5 液相芯片檢測(cè)體系的建立

1.5.1 寡核苷酸探針與微球共價(jià)偶聯(lián)

①將微球漩渦混合20s充分分散；取3×106個(gè)微球（75mL），于1.5mL離心管中10000×g離心1min，去上清；

②加入50mL 0.1mol/L甲基咪唑溶液（ph4.5），漩渦混合，超聲波處理（0.5-1min）；

③加入氨基化探針1.0nmol，漩渦混合；

④加入2.5mL碳二亞胺溶液（10mg的碳二亞胺粉末加入1.0mL的滅菌純水，現(xiàn)用現(xiàn)配）充分混勻，室溫避光孵育30min；

重復(fù)④一次。加入1.0mL 0.02% Tween-20，混勻，10000×g離心1min，棄上清；加入1.0mL 0.1% SDS，混勻，10000×g離心1min，棄上清；

用0.1mol/L甲基咪唑溶液（pH 4.5）100mL 重懸微球，2～8℃避光保存，待用。

1.5.2 雜交

雜交體系包括：1.5mL探針偶聯(lián)微球、33mL 1.5×TMAC 雜 交 液、14.5mL TE、2.5mL RT-PCR產(chǎn)物，空白孔以5mL TE取代PCR產(chǎn)物?；旌暇鶆蚝笥?8℃變性10min，在52℃溫度下孵育15min，18000×g離心 2min 去上清；加入 50 mL用1×TMAC 雜交液稀釋的SA-PE（1：500），選定溫度下孵育10min，18000×g離心2min 去上清；加入50mL 1×TMAC 雜交液，漩渦混合使微球重懸，上機(jī)分析。

雜交溫度的優(yōu)化，雜交反應(yīng)時(shí)間在15min條件下，根據(jù)探針的Tm值，選48℃、50℃、52℃、54℃、56℃等5個(gè)溫度梯度為研究對(duì)象，考察不同雜交溫度下液相芯片的檢測(cè)效果。

1.6 液相芯片檢測(cè)體系重復(fù)性分析

將IHNV的RT-PCR產(chǎn)物用于液相芯片檢測(cè)試驗(yàn)，做3個(gè)重復(fù)，計(jì)算變異系數(shù)。

1.7 液相芯片檢測(cè)體系特異性分析

將IPNV、SVCV、IHNV、EHNV、VHSV的RT-PCR產(chǎn)物或PCR產(chǎn)物，用液相芯片檢測(cè)體系進(jìn)行檢測(cè)，判斷整個(gè)液相芯片檢測(cè)體系對(duì)非目標(biāo)物有無(wú)檢測(cè)信號(hào)。

1.8 液相芯片檢測(cè)體系靈敏度分析

將IHNV病毒核酸進(jìn)行系列稀釋，得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀釋度的模板RNA，用建立的液相芯片體系進(jìn)行反應(yīng)，檢測(cè)方法的靈敏度。

1.9 樣本檢測(cè)

用建立的方法對(duì)30份實(shí)驗(yàn)室保存的樣品進(jìn)行檢測(cè)，與世界動(dòng)物衛(wèi)生組織《水生動(dòng)物疫病診斷手冊(cè)》推薦的RT-PCR法[15]比較，評(píng)價(jià)其準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR體系的建立

將IHNV RNA作為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電流分析，結(jié)果顯示擴(kuò)增出大小為126bp左右的目的條帶，與預(yù)期擴(kuò)增的片段大小一致（圖1）。

圖1 IHNV RT-PCR電泳結(jié)果

2.2 液相芯片檢測(cè)體系的建立

2.2.1 雜交溫度的優(yōu)化

參與計(jì)數(shù)的熒光編碼和微球均在100個(gè)以上（圖2a），表明用于計(jì)算的熒光編碼微球數(shù)量有效，所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度中位值（MFI）可信，3個(gè)熒光編碼微球的空白對(duì)照MFI值均小于500，試驗(yàn)可進(jìn)行結(jié)果判斷。試驗(yàn)結(jié)果表明48℃～56℃之間，熒光變動(dòng)幅度都不大，顯示52℃雜交良好，高于54℃時(shí)，檢測(cè)熒光下降劇烈，因此最佳雜交溫度選為52℃。

2.2.2 液相芯片檢測(cè)體系的確立

液相芯片定性比值結(jié)果（LQRR）等于樣品校正后的MFI值（MFIS）與空白對(duì)照MFI平均值（MFIB）的比值，即LQRR＝MFIS/MFIB。如果LQRR≥3，判定為陽(yáng)性樣本；如果2≤LQRR＜3，則判定為可疑；如果LQRR＜2，則判定為陰性。參與計(jì)數(shù)的熒光編碼微球均≥100個(gè)，表明用于計(jì)數(shù)的熒光編碼微球數(shù)量有效，所產(chǎn)生的MFI值可信，各個(gè)熒光編碼微球的空白對(duì)照MFI均＜500，表明結(jié)果有效，試驗(yàn)可以進(jìn)行結(jié)果判定。從圖2b、2c、2d看出，偶聯(lián)微球的探針與IHNV RT-PCR產(chǎn)物在Red-A、Yellow-A檢測(cè)通道下均有熒光信號(hào)，表明IHNV液相芯片構(gòu)建成功。

圖2 IHNV液相芯片檢測(cè)結(jié)果

2.3 液相芯片檢測(cè)體系的重復(fù)性分析

將提取的IHNV RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，然后在相同的反應(yīng)條件下進(jìn)行液相芯片體系進(jìn)行三次檢測(cè)，計(jì)算各批次間檢測(cè)的平均熒光強(qiáng)度值的變異系數(shù)，結(jié)果顯示變異系數(shù)小于4%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.4 液相芯片檢測(cè)體系特異性分析

分別以SVCV、IHNV、EHNV、VHSV和IPNV的RT-PCR產(chǎn)物或PCR產(chǎn)物模板，進(jìn)行液相芯片檢測(cè)。結(jié)果（表2）表明，對(duì)目標(biāo)病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，而對(duì)非目標(biāo)病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)值均為陰性，表明所建立的方法具有很好的特異性。

2.5 液相芯片檢測(cè)體系靈敏性驗(yàn)證

將IHNV 病毒核酸進(jìn)行10倍系列稀釋，得到10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1等 不同稀釋度的稀釋液，用已經(jīng)建立的液相芯片檢測(cè)體系進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度檢測(cè)結(jié)果如表3，檢測(cè)IHNV最低檢測(cè)限為100pg。

表2 液相芯片檢測(cè)體系特異性驗(yàn)證

表3 液相芯片檢測(cè)體系靈敏度驗(yàn)證

2.6 樣本檢測(cè)

對(duì)30份實(shí)驗(yàn)室保存的樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，5份樣品為陽(yáng)性，該法與OIE推薦的RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果基本一致，但RT-PCR檢測(cè)結(jié)果中有2份陽(yáng)性樣品電泳譜帶較弱，較難辯別。液相芯片法比PCR要靈敏（表4）。

3 討論

本研究建立了傳染性造血器官壞死病毒的液相芯片快速檢測(cè)技術(shù)，可應(yīng)用于快速檢測(cè)水生動(dòng)物疫病、進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查等工作。

與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，液相芯片技術(shù)集合了核酸擴(kuò)增、液相微球雜交、激光等諸多檢測(cè)技術(shù)，具有快速、簡(jiǎn)便、高通量等優(yōu)點(diǎn)[16]。雜交與檢測(cè)過程中無(wú)需繁瑣的洗滌步驟，且整個(gè)反應(yīng)都在同一密閉反應(yīng)管中進(jìn)行，避免了開蓋的交叉污染。與固相芯片相比，由于采用了流式懸浮微球雜交技術(shù)，其反應(yīng)更為高效，操作也更為靈活。與常規(guī)PCR方法相比，由于液相芯片檢測(cè)體系通過激光檢測(cè)核酸雜交微球的集合體，有效避免了多種核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的相互干擾，提高了靈敏度。

表4 液相芯片檢測(cè)體系與PCR對(duì)樣品檢測(cè)結(jié)果的比較

液相芯片檢測(cè)的技術(shù)關(guān)鍵是設(shè)計(jì)多重?cái)U(kuò)增引物與探針[17]。本研究通過比對(duì)不同IHNV毒株的基因組序列，初步篩選多種引物，通過反復(fù)優(yōu)化，選定適合檢測(cè)IHNV的引物。在優(yōu)化探針實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，G、C堿基含量應(yīng)該在40～60%，過少不易與PCR產(chǎn)物雜交，過多則會(huì)出現(xiàn)特異性雜交。探針內(nèi)部的互補(bǔ)序列如果超過4個(gè)堿基則會(huì)出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)。此外，探針的每個(gè)堿基必須與擴(kuò)增產(chǎn)物一一配對(duì)，因此，在設(shè)計(jì)探針時(shí)應(yīng)選擇IHNV高度保守的序列。

在方法建立過程中，本研究對(duì)雜交溫度選擇、碳二亞胺溶液濃度、探針與微球偶聯(lián)次數(shù)等進(jìn)行了探索。通過多次實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)雜交溫度的主要根據(jù)探針Tm值而確定，一般選擇Tm值上下各6℃范圍進(jìn)行摸索。碳二亞胺溶液最合適濃度為10mg/mL，低于此濃度會(huì)影響偶聯(lián)。探針與微球偶聯(lián)次數(shù)在2～3次較為合適，如果偶聯(lián)不成功可以增加次數(shù)，但不要超過5次，否則本底值過高，會(huì)影響結(jié)果。同時(shí)研究表明，在分析結(jié)果時(shí)，首先要圈定微球范圍（如圖2a），盡量圈定微球集中地區(qū)域，分散于其他位置的微球可以忽略不計(jì)，否則會(huì)造成結(jié)果的偏差。

由本實(shí)驗(yàn)中對(duì)30樣品臨床檢測(cè)結(jié)果可知，液相芯片檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)PCR方法基本一至，但PCR檢測(cè)結(jié)果中有2份樣品電泳帶較弱，肉眼較難辯別，而液相芯片檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，說明靈敏度比傳統(tǒng)PCR方法高。所建立的液相芯片檢測(cè)體檢測(cè)IHNV最低限量為100pg。

本方法能夠?qū)魅拘栽煅鞴賶乃啦《具M(jìn)行快速檢測(cè)，從樣品處理到出結(jié)果僅需2.5小時(shí)左右。由于采用了接近生物反應(yīng)體系的液相芯片系統(tǒng)和特異性的探針，使該方法的特異性高于傳統(tǒng)檢測(cè)方法，大大杜絕了非特異性擴(kuò)增造成的假陰性結(jié)果。采用了液相反應(yīng)體系，使該方法靈敏度高于PCR，避免了PCR檢測(cè)中溴化乙錠對(duì)人員和環(huán)境的污染，非常適合對(duì)進(jìn)出境水生動(dòng)物進(jìn)行高通量檢測(cè)。

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