陜 光， 錢輝軍， 夏 樾

武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿Ⅱ科，武漢 430060

膀胱尿路上皮癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的首位。膀胱尿路上皮癌的病因復(fù)雜，既有內(nèi)在的遺傳因素，又有外在的環(huán)境因素［1］。其發(fā)病原因還不清楚，男女的膀胱癌發(fā)生率約為5∶2，美國每年（1997年估算）約有54 500新病例［2］。因此，研究膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制，尋找早期預(yù)測膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)標(biāo)記物，為膀胱癌的發(fā)生和復(fù)發(fā)的預(yù)測提供一定的參考依據(jù)具有重要的臨床意義。

過氧化物酶體增殖物激活受體（（peroxisome proliferator activated receptor，PPARs）是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，屬Ⅱ型核激素受體超家族成員。在兩棲類、嚙齒類動物及人類等PPARs均有3種亞型，即PPARα、PPARβ（亦稱PPARδ或 NUC－1）和PPARγ。這3種亞型在結(jié)構(gòu)及功能上均有差異〔3－4〕。其中，PPARγ備受關(guān)注。它在宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌、肝癌、胰腺癌中呈高表達(dá)，可通過與靶基因增強(qiáng)子中的過氧化物增殖反應(yīng)元件結(jié)合，參與細(xì)胞增殖、凋亡及終末分化的過程［5］，那么PPARγ在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)如何呢？又有何意義呢？這也是我們本次實驗需要研究和探討的。

本文采用免疫組化和圖像分析方法檢測和分析膀胱尿路上皮癌組織PPARγ的表達(dá)，以期能進(jìn)一步闡明膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制，為膀胱尿路上皮癌的診治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科2006～2009年膀胱尿路上皮癌存檔蠟塊50例（均經(jīng)病理學(xué)證實為膀胱尿路上皮癌），其中男性38例，女性12例，平均年齡50.3歲，另5例癌旁組織距瘤緣3～5cm。標(biāo)本均經(jīng)蘇木精－伊紅（HE）染色，光鏡觀察診斷，按WHO尿路腫瘤組織學(xué)分類（2004），浸潤性尿路上皮癌30例，非浸潤性乳頭狀尿路上皮癌20例；按UICC臨床分期，T1 31例，T2 11例，T3～T4 8例。其中未經(jīng)化療的初發(fā)腫瘤28例，化療后復(fù)發(fā)腫瘤22例。

1.2 主要試劑

即用型鼠抗人PPARγ單克隆抗體（北京中杉生物技術(shù)有限公司）；超敏即用型SP通用型免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中杉生物技術(shù)有限公司）；DAB顯色試劑盒及多聚賴氨酸（北京中杉生物技術(shù)有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 HE染色 常規(guī)取材、固定、脫水、透明、包埋、切片、HE染色及封片

1.3.2 免疫組織化學(xué)SP法檢測PPARγ抗原 具體步驟：5μm組織切片常規(guī)脫蠟至水后，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×3min；抗原修復(fù)，室溫自然冷卻后，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗5×3min；滴加3%過氧化氫，37℃濕盒孵育10min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×3min；正常羊血清37℃濕盒孵育10min以減少非特異性背景；甩去多余血清，分別滴加一抗，4℃孵育過夜，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×5 min；滴加生物素標(biāo)記的二抗37℃濕盒孵育10min，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×3min；滴加鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物復(fù)合物37℃濕盒孵育10 min，0.01mol／L PBS（pH 7.4）漂洗3×3min；滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色，光鏡下控制反應(yīng)時間（約3～5min），自來水沖洗終止反應(yīng)；蘇木精復(fù)染，流水沖洗，1%鹽酸乙醇分色數(shù)秒，流水沖洗，0.1%氨水返藍(lán)；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢；用PBS代替一抗作為陰性對照組，購買的陽性片作為PPARγ的陽性對照組。

1.3.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷 ①PPARγ以細(xì)胞核或胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，陰性對照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，無棕黃色反應(yīng)物。②采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)（同濟(jì)千屏影像公司）對PPARγ的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測定每個視野下陽性反應(yīng)的平均吸光度、陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計算陽性面積率（陽性面積率＝單位面積中陽性反應(yīng)的總面積／單位面積中細(xì)胞的總面積×100%）。以每例5個視野的平均吸光度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

對各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均吸光度、平均陽性面積率作單因素方差分析和q檢驗，檢驗水準(zhǔn)α為0.05。

2 結(jié)果

2.1 PPARγ的表達(dá)

膀胱尿路上皮癌細(xì)胞內(nèi)可見密集分布的棕黃色顆粒，PPARγ表達(dá)強(qiáng)（圖1）；癌旁組織胞核內(nèi)可見極少量的或未見棕黃色顆粒，PPARγ表達(dá)弱（圖2）。圖像分析結(jié)果見表1。經(jīng)q檢驗，膀胱尿路上皮癌與癌旁組織之間，PPARγ的平均吸光度及平均陽性面積率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 膀胱尿路上皮癌和癌旁組織PPARγ表達(dá)的平均吸光度和平均陽性面積率（±s）Table 1 The average optical density and the rate of positive area of PPARγin bladder urothelial cancer and para-carcinoma tissue（±s）

表1 膀胱尿路上皮癌和癌旁組織PPARγ表達(dá)的平均吸光度和平均陽性面積率（±s）Table 1 The average optical density and the rate of positive area of PPARγin bladder urothelial cancer and para-carcinoma tissue（±s）

與癌旁組織比較，＊P＜0.05

組別 n 平均吸光度 平均陽性面積率膀胱尿路上皮癌 50 0.295 4±0.007 5＊ 0.259 0±0.006 8＊癌旁組織5 0.080 1±0.003 0 0.075 9±0.002 9

圖1 膀胱尿路上皮癌組PPARγ的表達(dá)（SP染色，×200）Fig.1 Expression of PPARγin bladder urothelial cancer group（SP，×200）細(xì)胞核和胞質(zhì)內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒，PPARγ呈陰性表達(dá)（→）圖2 癌旁組織PPARγ的表達(dá)（SP染色，×200）Fig.2 Expression of PPARγin para-carcinoma tissue（SP，×200）

2.2 PPARγ表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系

結(jié)果見表2。

表2 膀胱尿路上皮癌組織中PPARγ的表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系Table 2 Relation of expression of PPARγwith TNM stage of bladder urothelial cancer

PPARγ蛋白在原發(fā)腫瘤直徑≥3cm組陽性率為72.4%，顯著高于直徑＜3cm 組（33.3%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。PPARγ蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性率（72.7%）顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（46.4%），差 異 有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義 （P＜0.05）。PPARγ蛋白在臨床分期T3～4期陽性率（75.0%），顯著高于 T1、T2期（41.9%、45.5%），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。PPARγ蛋白在低分化組陽性率為68.2%，顯著高于高、中分化組（42.9%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。PPARγ蛋白表達(dá)與患者性別、年齡、吸煙狀況無明顯相關(guān)性（均P＞0.05）。

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，目前發(fā)病率呈上升趨勢，且復(fù)發(fā)率高，易產(chǎn)生獲得性耐藥。膀胱癌的發(fā)生是復(fù)雜、多因素、多步驟的病理變化過程，既有內(nèi)在的遺傳因素，又有外在的環(huán)境因素。較為明確的兩大致病危險因素是吸煙和長期接觸工業(yè)化學(xué)產(chǎn)品［6］。吸煙是目前最為肯定的膀胱癌致病危險因素，約30%～50%的膀胱癌由吸煙引起，吸煙可使膀胱癌危險率增加2～4倍，其危險率與吸煙強(qiáng)度和時間成正比。另一重要的致病危險因素為長期接觸工業(yè)化學(xué)產(chǎn)品，職業(yè)因素是最早獲知的膀胱癌致病危險因素，約20%的膀胱癌是由職業(yè)因素引起的，包括從事紡織、染料制造、橡膠化工、藥物制劑和殺蟲劑生產(chǎn)、油漆、皮革及鋁、鐵和鋼生產(chǎn)。柴油機(jī)廢氣累積也可增加膀胱癌的發(fā)生危險。膀胱癌初發(fā)時80%為淺表性，其中70%術(shù)后復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)者30%向高級高期發(fā)展，15%～30%的患者初發(fā)時即具有侵襲性，即使經(jīng)過治療，也較早轉(zhuǎn)移［7］。因此，研究膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制，尋找早期預(yù)測膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)標(biāo)記物，為膀胱癌的發(fā)生和復(fù)發(fā)的預(yù)測提供一定的參考依據(jù)具有重要的臨床意義。

過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators activatedreceptor，PPARs）屬于Ⅱ型核激素受體超家族成員，是依賴配體的核轉(zhuǎn)錄因子［8－10］。PPARγ蛋白位于機(jī)體多種信號傳導(dǎo)途徑中心，調(diào)節(jié)體內(nèi)多種生理和病理活動，經(jīng)特異性配體激活后有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞分化，抑制血管生成，阻滯細(xì)胞周期等抗腫瘤作用。使用PPARγ特異性配體羅格列酮調(diào)節(jié)血糖的患者在除外其他混雜因素后，患肺癌的風(fēng)險較未用者低 33%［11－13］。PPARγ有望成為腫瘤預(yù)防和治療的新靶點，研究其配體及激活機(jī)制可以為腫瘤的治療提供新靶點。

PPARγ配體抑癌作用機(jī)制尚未完全明確，可能涉及多個方面：①PPARγ活化后可通過上調(diào)絲裂原活化蛋白激酶ERK1／2及下調(diào)細(xì)胞周期蛋白B1、細(xì)胞周期蛋白D1及細(xì)胞周期調(diào)控因子2、細(xì)胞周期調(diào)控因子4、細(xì)胞周期調(diào)控因子25的表達(dá)，使肺癌細(xì)胞停滯在G0／G1期，從而抑制肺癌細(xì)胞分裂，阻滯細(xì)胞周期。②PPARγ活化后可通過下調(diào)原癌基因C－myc、Bcl-2表達(dá)，增強(qiáng)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）、p53蛋白活性誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［14］。③PPARγ活化后通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，抑制腫瘤血管網(wǎng)絡(luò)的形成，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移［15］。④PPARγ活化后通過下調(diào)環(huán)氧酶2（COX-2）表達(dá)，抑制血管新生和腫瘤生長［16－17］。⑤PPARγ的N－末端磷酸化后與p56作用，可抑制NF-κB的活性，抑制細(xì)胞增殖。⑥活化的PPARγ通過降低基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，降低腫瘤組織的侵襲能力。目前關(guān)于PPARγ蛋白及配體的臨床研究尚不多見，體內(nèi)與體外腫瘤微環(huán)境的差異導(dǎo)致PPARγ配體臨床療效不確切，PPARγ蛋白高表達(dá)患者極有可能從PPARγ配體靶向治療中獲益。

我們采用免疫組織化學(xué)的方法，對膀胱尿路上皮癌組織中PPARγ蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測，旨在探討其與膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。結(jié)果顯示：PPARγ蛋白在膀胱尿路上皮癌中呈高表達(dá)，癌旁組織中呈低表達(dá)，我們的研究結(jié)果與Petta和Conconi等［18－19］的研究結(jié)果一致。提示：PPARγ可作為膀胱尿路上皮癌早期診斷指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)PPARγ蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)水平與腫瘤病理類型和分化程度、原發(fā)腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、臨床分期顯著相關(guān)。PPARγ蛋白在低分化組PPARγ蛋白顯著高于高分化組和中分化組，提示PPARγ蛋白高表達(dá)與腫瘤分化程度低，惡性程度高有關(guān)。原發(fā)腫瘤直徑≥3cm組陽性率72.4%，顯著高于直徑＜3cm組（33.3%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示PPARγ高表達(dá)與原發(fā)腫瘤增殖活躍有關(guān)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性率72.7%，顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組46.4%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示PPARγ蛋白高表達(dá)可能與膀胱尿路上皮癌惡性程度高、發(fā)展快、侵襲力強(qiáng)有關(guān)，更易于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。PPARγ蛋白在臨床分期T3～4組陽性率75.0%，顯著高于 T1、T2期組41.9%、45.5%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。提示PPARγ高表達(dá)可能與膀胱尿路上皮癌患者預(yù)后不良有關(guān)。PPARγ蛋白表達(dá)水平在膀胱尿路上皮癌中與患者性別、年齡及吸煙狀態(tài)暫未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。

近年來，傳統(tǒng)化療藥物的療效已經(jīng)處于平臺期，因此積極尋找有效的治療方法以及減少化療毒性的藥物是臨床急需解決的問題。目前對PPARγ及其激動劑的研究已涉及生物醫(yī)學(xué)的諸多領(lǐng)域，有關(guān)研究結(jié)果為臨床防治糖尿病、高血壓、腎臟病、肝臟病等提供了新的思路。可以相信，隨著研究的不斷推進(jìn)，PPARγ作為疾病治療新靶標(biāo)的價值將會逐步明晰。

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