黃曉雷， 李元濤， 李 泳， 齊曉非， 文亞杰， 吳銘廣

南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院麻醉科，深圳 518028

利多卡因是剖宮產(chǎn)手術(shù)中常用局麻藥［1－2］。臨床濃度的局麻藥可抑制子宮平滑肌收縮并減弱子宮收縮力，進(jìn)而增加產(chǎn)后出血的發(fā)生率［3－5］。而剖宮產(chǎn)后給予催產(chǎn)素促進(jìn)子宮收縮已成為防治術(shù)后子宮出血的常規(guī)手段［6］。那么，利多卡因是否可影響催產(chǎn)素促子宮平滑肌收縮？其導(dǎo)致子宮平滑肌收縮功能減弱的具體機(jī)制是什么？研究表明，子宮平滑肌收縮功能與細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度密切相關(guān)［7－9］。產(chǎn)婦生產(chǎn)過程中，催產(chǎn)素可通過激活催產(chǎn)素受體導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度升高［10－11］。細(xì)胞內(nèi) Ca2＋濃度升高可誘發(fā)鈣調(diào)蛋白相關(guān)肌球蛋白輕鏈激酶激活進(jìn)而導(dǎo)致子宮平滑肌收縮［12］。由此可見，利多卡因所致子宮收縮力減弱可能與催產(chǎn)素及其Ca2＋調(diào)節(jié)功能異常相關(guān)。因此，本研究擬觀察利多卡因?qū)ψ园l(fā)性及催產(chǎn)素誘發(fā)人子宮平滑肌收縮的影響并探討其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

利多卡因及催產(chǎn)素購自美國Sigma公司；Krebs 液 含 有 NaCl 119mmol／L，MgSO41.2 mmol／L，KH2PO41.2mmol／L，NaHCO325mmol／L，CaCl22.5mmol／L，葡萄糖11.5mmol／L，EDTA 0.026mmol／L；鈣離子熒光染料 Fluo-3AM 購自美國Molecular Probe公司；抗磷酸化PKC抗體、抗總PKC抗體、抗催產(chǎn)素受體購自美國Abcam公司；抗β-actin抗體購自武漢博士德公司；應(yīng)變式傳感器購自日本Kyowa公司，型號(hào)LVS-20GA；共聚焦顯微鏡購自德國Zeiss公司，型號(hào)LSM-510。

1.2 子宮平滑肌組織培養(yǎng)

本研究流程經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。選擇孕足月（孕周≥38周）擬行剖宮產(chǎn)術(shù)的健康產(chǎn)婦，胎兒及胎盤取出后于子宮下段切口上緣取條形子宮平滑肌組織，將其置入預(yù)冷無菌Krebs液中。Krebs液沖洗3遍去除組織表面殘留血液。37℃ Krebs液中仔細(xì)剝離子宮及環(huán)形子宮平滑肌層，僅保留外層縱行子宮平滑肌并將其修剪為寬2mm、長15mm左右的組織塊。平滑肌組織置入37℃的培養(yǎng)液中，并將組織塊的一段與應(yīng)變式傳感器相連，并給予0.5g的初始張力。

1.3 實(shí)驗(yàn)給藥

初始張力設(shè)置后，一部分平滑?。?0條）給予催產(chǎn)素（10－9mol／L）處理，另一部分（40條）給予等量生理鹽水使其保持自主收縮狀態(tài)。之后，經(jīng)催產(chǎn)素處理或未經(jīng)催產(chǎn)素處理的平滑肌組織被隨機(jī)分為5組（n＝8），包括對(duì)照組及利多卡因（L）1～4組。L1～4組分別給予10－5、5×10－5、10－4、5×10－4mol／L利多卡因，而對(duì)照組僅給予生理鹽水。

1.4 鈣離子濃度檢測(cè)

平滑肌條塊置入含5μmol／L Fluo-3AM 的培養(yǎng)液中室溫孵育3h。Fluo-3AM孵育后，平滑肌組織置入37℃的培養(yǎng)液中，并將組織塊的一段與應(yīng)變式傳感器相連，并給予0.5g的初始張力。組織塊的一段與應(yīng)變式傳感器連接30min后，共聚焦顯微鏡下測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度（激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長505nm）。

1.5 蛋白提取及 Western blot檢測(cè)

利多卡因處理1h后，子宮平滑肌用PBS洗3次，加入RIPA裂解液，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，收集到Eppendorf管中，用BCA試劑盒對(duì)所抽提的蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白定量，將蛋白樣品調(diào)整為相同濃度。相同濃度體積的蛋白樣品加入5×樣品緩沖液，100℃沸水中煮8min，12 000g離心8min，之后進(jìn)行SDSPAGE電泳，并經(jīng)電轉(zhuǎn)移將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。PVDF膜在5%的脫脂牛奶中室溫封閉1h。封閉結(jié)束后，PVDF膜浸于5%脫脂牛奶稀釋的相應(yīng)濃度一抗（抗磷酸化PKC抗體，1∶500；抗總PKC抗體，1∶1 000；抗催產(chǎn)素受體抗體，1∶1 000；抗β-actin抗體，1∶500）中在4℃環(huán)境下孵育過夜。次日將膜取出，TBST液洗滌3次，加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)生物二抗（武漢博士德公司），室溫孵育2h，TBST液洗滌3次，然后進(jìn)行ECL顯色，在凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio Rad公司）中成像，采用Image Lab 3.0軟件進(jìn)行灰度分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。其中，連續(xù)變量的組間比較采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 利多卡因?qū)ψ园l(fā)性人子宮平滑肌收縮的影響

與對(duì)照組比較，10－4及5×10－4mol／L利多卡因可導(dǎo)致自發(fā)性收縮子宮平滑肌收縮幅度和收縮頻率減少（P＜0.05或P＜0.01，表1），而10－5及5×10－5mol／L利多卡因?qū)ψ园l(fā)性收縮子宮平滑肌收縮幅度和收縮頻率的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，表1）。

2.2 利多卡因?qū)Υ弋a(chǎn)素誘發(fā)人子宮平滑肌收縮的影響

與對(duì)照組比較，10－4及5×10－4mol／L利多卡因可導(dǎo)致催產(chǎn)素處理的子宮平滑肌收縮幅度和收縮頻率減少（P＜0.05或P＜0.01，表1），而10－5及5×10－5mol／L利多卡因?qū)Υ弋a(chǎn)素處理的子宮平滑肌收縮幅度和收縮頻率的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，表1）。

2.3 利多卡因?qū)θ俗訉m平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

與對(duì)照組比較，10－4及5×10－4mol／L利多卡因可導(dǎo)致自發(fā)性收縮子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度減少（P＜0.05或P＜0.01，表2），而10－5及5×10－5mol／L利多卡因?qū)ψ园l(fā)性收縮子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，表2）。與對(duì)照組比較，5×10－5、10－4及5×10－4mol／L利多卡因可導(dǎo)致催產(chǎn)素處理的子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度減少（P＜0.05或P＜0.01，表2），而10－5mol／L利多卡因?qū)Υ弋a(chǎn)素處理的子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表1 不同濃度利多卡因?qū)ψ訉m平滑肌收縮功能的影響（±s，n＝8）Table 1 Effects of lidocaine on the contractions of isolated myometrial smooth muscles from pregnant women（±s，n＝8）

表1 不同濃度利多卡因?qū)ψ訉m平滑肌收縮功能的影響（±s，n＝8）Table 1 Effects of lidocaine on the contractions of isolated myometrial smooth muscles from pregnant women（±s，n＝8）

與對(duì)照組比較，＊P＜0.05＊＊P＜0.01

分組生理鹽水處理幅度（g） 頻率（次／10min）催產(chǎn)素處理幅度（g） 頻率（次／10min）對(duì)照組1.73±0.21 1.37±0.12 2.16±0.30 1.90±0.21 L1 1.64±0.20 1.34±0.12 2.14±0.30 1.88±0.21 L2 1.56±0.19 1.32±0.12 2.06±0.29 1.76±0.19 L3 1.38±0.18＊ 1.19±0.11＊ 1.98±0.20＊ 1.54±0.17＊L4 1.31±0.17＊ 1.06±0.10＊＊ 1.91±0.27＊ 1.33±0.15＊＊

表2 不同濃度利多卡因?qū)ψ訉m平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響（±s，n＝8，nmol／L）Table 2 Effects of lidocaine on the intracellular Ca2＋concentration in isolated myometrial smooth muscles from pregnant women（±s，n＝8，nmol／L）

表2 不同濃度利多卡因?qū)ψ訉m平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響（±s，n＝8，nmol／L）Table 2 Effects of lidocaine on the intracellular Ca2＋concentration in isolated myometrial smooth muscles from pregnant women（±s，n＝8，nmol／L）

與對(duì)照組比較，＊P＜0.05＊＊P＜0.01

分組 生理鹽水處理 催產(chǎn)素處理對(duì)照組67.2±5.6 228.5±17.8 L1 63.8±5.1 201.9±18.4 L2 60.6±4.4 191.2±18.1＊L3 57.6±4.6＊ 153.1±12.2＊＊L4 54.7±4.1＊＊ 128.6±9.9＊＊

2.4 利多卡因?qū)θ俗訉m平滑肌催產(chǎn)素受體及磷酸化PKC表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組比較，10－4及5×10－4mol／L利多卡因可導(dǎo)致自發(fā)性收縮和催產(chǎn)素處理的子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)磷酸化PKC表達(dá)水平降低（P＜0.05或P＜0.01，表3）。但10－4及5×10－4mol／L利多卡因?qū)ψ园l(fā)性收縮和催產(chǎn)素處理的子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)催產(chǎn)素受體的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表3）。

3 討論

已有研究表明，局麻藥如利多卡因可導(dǎo)致離體子宮平滑肌自發(fā)性收縮減弱［13－14］。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利多卡因不僅可減弱人子宮平滑肌自發(fā)性收縮，亦可抑制催產(chǎn)素促子宮平滑肌收縮作用；而這種作用可能與平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度減少及PKC磷酸化水平降低相關(guān)。

妊娠期婦女子宮平滑肌具有自發(fā)性收縮活動(dòng)。而體外情況下子宮平滑肌亦可產(chǎn)生類似的自發(fā)性規(guī)律收縮［15］。這種自發(fā)性規(guī)律收縮受到細(xì)胞動(dòng)作電位、平滑肌內(nèi)鈣離子濃度及表面功能受體的調(diào)控［16－17］。利多卡因等局麻藥的主要作用機(jī)制是抑制細(xì)胞膜鈉離子通道介導(dǎo)鈉離子內(nèi)流［18－19］。鈉離子內(nèi)流過度減少可影響動(dòng)作電位生成和鈣離子內(nèi)流，從而減弱細(xì)胞興奮性［20］。但利多卡因能否影響自發(fā)性及催產(chǎn)素誘發(fā)子宮平滑肌收縮功能仍有待進(jìn)一步探討。

表3 利多卡因?qū)ψ訉m平滑肌細(xì)胞內(nèi)PKC磷酸化水平及催產(chǎn)素受體表達(dá)水平的影響（±s，n＝5）Table 3 Effects of lidocaine on the levels of PKC phosphorylation and oxytocin receptor protein expression in isolated myometrial smooth muscles from pregnant women（±s，n＝5）

表3 利多卡因?qū)ψ訉m平滑肌細(xì)胞內(nèi)PKC磷酸化水平及催產(chǎn)素受體表達(dá)水平的影響（±s，n＝5）Table 3 Effects of lidocaine on the levels of PKC phosphorylation and oxytocin receptor protein expression in isolated myometrial smooth muscles from pregnant women（±s，n＝5）

與對(duì)照組比較，＊P＜0.05＊＊P＜0.01

PKC磷酸化水平（%）分組催產(chǎn)素受體（%）生理鹽水處理 催產(chǎn)素處理對(duì)照組生理鹽水處理 催產(chǎn)素處理90.2±10.8 91.6±8.3 100.0±14.0 157.4±17.3 100.0±12.0 95.0±8.6 L1 97.3±12.5 147.8±14.9 96.2±11.0 92.0±6.6 L2 87.0±13.4 135.4±17.8 96.3±14.0 94.0±7.9 L3 72.4±12.8＊ 124.1±13.9＊ 94.8±11.4 92.9±8.4 L4 64.5±12.4＊ 95.2±11.0＊＊

利多卡因是臨床上常用的局麻藥，在剖宮產(chǎn)手術(shù)硬膜外麻醉中得到廣泛應(yīng)用［21］。研究表明，在常規(guī)使用利多卡因行硬膜外麻醉的剖宮產(chǎn)術(shù)中，血漿中利多卡因的濃度約為10－5～10－4mol／L［22］。因此，本實(shí)驗(yàn)通過給予子宮平滑肌10－5、5×10－5、10－4及5×10－4mol／L利多卡因，觀察不同濃度利多卡因?qū)ψ訉m平滑肌收縮功能的影響。與前期研究結(jié)果一致［13－14］，我們的結(jié)果表明，10－4及5×10－4mol／L的利多卡因可顯著減弱子宮平滑肌自主收縮功能。

催產(chǎn)素是剖宮產(chǎn)手術(shù)中的常規(guī)用藥［23］。臨床上常于胎兒及胎盤取出后靜脈給予催產(chǎn)素以促進(jìn)子宮收縮，防止術(shù)后子宮出血的發(fā)生。因此，本實(shí)驗(yàn)亦觀察了催產(chǎn)素預(yù)處理狀況下，利多卡因?qū)ψ訉m平滑肌收縮功能的影響。結(jié)果表明，10－4及5×10－4mol／L的利多卡因可顯著減弱催產(chǎn)素誘發(fā)的子宮平滑肌收縮。這就說明，利多卡因不僅可導(dǎo)致子宮平滑肌自主收縮功能下降，亦可導(dǎo)致催產(chǎn)素促子宮平滑肌收縮能力減弱。因此，較高劑量的利多卡因可能導(dǎo)致子宮平滑肌對(duì)催產(chǎn)素反應(yīng)性降低進(jìn)而增加剖宮產(chǎn)后產(chǎn)后出血的風(fēng)險(xiǎn)。

利多卡因誘發(fā)子宮平滑肌收縮能力減弱的機(jī)制尚不清楚。研究表明，細(xì)胞鈣離子是調(diào)節(jié)子宮平滑肌收縮的關(guān)鍵分子［24］。催產(chǎn)素可作用于子宮平滑肌表面的催產(chǎn)素受體，通過激活PKC信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度增加，從而促進(jìn)子宮平滑肌收縮［25］。而子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低可能是導(dǎo)致子宮收縮異常及產(chǎn)后出血的重要機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，10－4及5×10－4mol／L的利多卡因可顯著減少自主收縮子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，并減弱催產(chǎn)素誘發(fā)的鈣離子內(nèi)流作用。與此同時(shí)，10－4及5×10－4mol／L的利多卡因亦可導(dǎo)致子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)磷酸化PKC水平下降。PKC活性（磷酸化水平）下降可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜平滑肌內(nèi)肌球蛋白動(dòng)能減弱［25］，從而加重子宮平滑肌收縮異常。

綜上所述，利多卡因可能通過抑制子宮平滑肌PKC信號(hào)通路，從而降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，最終減弱人子宮平滑肌自發(fā)性收縮并抑制催產(chǎn)素的促收縮作用。

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