丁 浩， 朱 莉， 王 劍△

江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院1呼吸內(nèi)科2腎內(nèi)科，鎮(zhèn)江 212002

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是一種急性進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭，可由多種原發(fā)疾病引起，以肺順應(yīng)性下降、容積減小及通氣／血流比例嚴(yán)重失調(diào)為特征，具有較高的病死率［1］。目前，ARDS具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，雖然呼吸支持技術(shù)的改進(jìn)使其病死率有所降低，但仍是導(dǎo)致患者死亡的重要原因。研究表明［2－3］，不同原發(fā)病因所致的 ARDS均引起患者肺血管內(nèi)皮及肺泡上皮屏障通透性增加，使肺泡中出現(xiàn)大量蛋白性液體而導(dǎo)致肺水腫。血管生成素－1（angiopoietin-1，Ang-1）是 Ang重要亞型，在血管內(nèi)皮增殖、穩(wěn)定、凋亡及血管通透性方面發(fā)揮重要作用［4］。動物實驗表明［5］，將小鼠 Ang-1基因敲除后，血管內(nèi)皮細(xì)胞失去與周圍基質(zhì)的連接，而使血管通透性增加。有研究采取動物實驗的方法給予高氧誘導(dǎo)肺損傷大鼠外源性Ang-1，可改善其炎癥反應(yīng)及血管通透性［6］。本研究利用 RT-PCR技術(shù)對Ang-1在ARDS患者外周血中的表達(dá)進(jìn)行檢測，探討Ang-1在ARDS發(fā)病、診斷及判定預(yù)后中的價值，以期為臨床實踐提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年6月至2015年1月在江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院呼吸科及重癥醫(yī)學(xué)科接受治療的ARDS患者85例，所有患者均符合“柏林定義”關(guān)于ARDS診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡在18歲以下者；②住院時間在24h以內(nèi)者；③合并有惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病及使用免疫抑制藥物者；④孕婦及哺乳期婦女；⑤肺結(jié)核活動期、支氣管哮喘、COPD急性加重期、間質(zhì)性肺病等所致的ARDS。其中，男性56例，女性29例，平均年齡（58.7±15.3）歲；原發(fā)疾病類型：肺部感染31例，急性化膿性膽管炎8例，急性腹膜炎10例，多發(fā)傷合并肺挫傷9例，膿毒血癥8例，重癥胰腺炎7例，嚴(yán)重失血性休克7例，化膿性腦膜炎2例，農(nóng)藥中毒3例。根據(jù)患者氧化狀態(tài)進(jìn)行分組：輕度組（n＝25）：200＜氧合指數(shù)（PaO2／FiO2）≤300，且持續(xù)氣道正壓（CPAP）或呼氣末正壓（PEEP）＜5cmH2O；中度組（n＝36）：100＜PaO2／FiO2≤200，且5cmH2O≤CPAP或PEEP＜10cmH2O；重度組（n＝24）：PaO2／FiO2≤100，且CPAP或PEEP≥10cmH2O。同期，選取住院治療的非ARDS患者40例作為對照組，男性27例，女性13例，平均年齡（60.3±17.6）歲；疾病類型：急性腦梗死9例，急性心肌梗死8例，心肺復(fù)蘇術(shù)后4例，消化道出血7例，藥物中毒6例，低血糖昏迷3例，胃穿孔術(shù)后3例。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.2 臨床一般資料收集

收集所有研究對象性別、年齡、原發(fā)病、合并癥等一般情況，記錄患者入院后血尿常規(guī)指標(biāo)、血氣指標(biāo)檢查結(jié)果，分別對患者進(jìn)行急性生理學(xué)與慢性健康狀況評分系統(tǒng)Ⅱ評分（APACHEⅡ評分）、肺損傷評分（LIS）和序貫器官衰竭評分（SOFA）［8］。

1.3 實驗室檢測

1.3.1 主要試劑及儀器 總RNA提取試劑盒購自美國MOBIO公司，RT-PCR檢測試劑盒購自美國ABI公司，Ang-1、人內(nèi)皮細(xì)胞TEK酪氨酸激酶受體Tie2及內(nèi)參引物設(shè)計和合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，PCR儀購自德國Roche公司，IL-6檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)實業(yè)有限公司。

1.3.2 RT-PCR檢測外周血中Ang-1和Tie2表達(dá)所有研究對象入院次日抽取晨起肘靜脈血6mL分裝在2個試管中，各3mL，分別進(jìn)行3 500r／min離心后取血漿保存于－70℃冰箱備檢。取血漿標(biāo)本，利用總RNA提取試劑盒對血漿中總RNA進(jìn)行提取，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并定量。取cDNA加入PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)，Ang-1引物序列：上游5′-GAAGGGAACCGAGCCTATTC-3′，下游5′-GGGCACATTTGCACATACAG-3′；Tie2引物序 列：上 游 5′-TACACCTGCCTCATGCTCAG-3′，下 游 5′-TGTGCAGTTCACAAGCCTTC-3′。PCR反應(yīng)條件：94℃10min，90℃15s，56℃30s，72℃30s，連續(xù)進(jìn)行36次，每個樣品均設(shè)3個反應(yīng)復(fù)孔。反應(yīng)產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳后利用圖像分析軟件對Ang－1 mRNA和Tie2mRNA表達(dá)情況進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

利用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，利用Pearson相關(guān)分析對變量間相關(guān)關(guān)系進(jìn)行分析，利用多因素Logistic回歸分析對影響ARDS患者預(yù)后的相關(guān)因素進(jìn)行分析，利用受試者工作特征曲線（ROC曲線）對 Ang-1在預(yù)測ARDS發(fā)生中的效能進(jìn)行分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ARDS患者和對照組臨床一般資料比較

ARDS患者和對照組在性別、年齡方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），與對照組相比，ARDS患者PaO2／FiO2降低，而APACHEⅡ評分、LIS評分、SOFA評分、C-反應(yīng)蛋白（CRP）水平、IL-6水平和死亡率均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；對不同程度ARDS患者比較顯示，重度組患者PaO2／FiO2低于中度組和輕度組，而APACHEⅡ評分、LIS評分、SOFA評分、C-反應(yīng)蛋白、IL-6和死亡率均高于中度組和輕度組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），中度組患者PaO2／FiO2低于輕度組，而LIS評分、SOFA評分、C-反應(yīng)蛋白和IL-6均高于輕度組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

表1 ARDS患者和對照組臨床一般資料比較（±s）Table 1 Comparison of general clinical data between the ARDS patients and the control subjects（±s）

表1 ARDS患者和對照組臨床一般資料比較（±s）Table 1 Comparison of general clinical data between the ARDS patients and the control subjects（±s）

與對照組比較，aP＜0.05；與輕度組比較，b P＜0.05；與中度組比較，c P＜0.05

指標(biāo) 對照組（n＝40） ARDS患者合計（n＝85） 輕度組（n＝25） 中度組（n＝36） 重度組（n＝24）性別（男／女） 27／13 56／29 15／10 23／13 16／8年齡（歲） 60.3±17.6 58.7±15.3 59.6±16.2 58.3±15.1 57.9±15.3 PaO2／FiO2 396.5±59.4 161.4±57.3a 241.2±23.5 154.8±25.3b 92.4±8.5bc APACHEⅡ（分） 13.9±5.1 19.8±4.8a 17.3±3.3 19.4±4.9 23.8±3.7bc LIS（分） 0.26±0.13 1.71±0.65a 0.93±0.17 1.68±0.45b 2.49±0.38bc SOFA（分） 3.4±1.9 7.5±3.2a 5.3±2.1 7.6±3.1b 9.7±3.2bc CRP（mg／L） 13.5±4.3 97.8±11.5a 71.5±12.7 98.3±13.1b 151.4±15.2bc IL-6（ng／L） 12.9±5.4 55.7±12.5a 42.5±9.8 49.6±11.3b 128.7±13.8bc死亡率（n，%） 7（17.5） 38（44.7）a 6（24.0） 16（44.4） 16（66.7）b

2.2 ARDS患者和對照組外周血中Ang-1和Tie2表達(dá)情況

ARDS患者外周血中 Ang-1mRNA和Tie2 mRNA相對表達(dá)量均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；對不同程度ARDS患者比較顯示，重度組患者外周血中 Ang-1mRNA和 Tie2 mRNA相對表達(dá)量均低于中度組和輕度組，且中度組均低于輕度組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表2 ARDS患者和對照組血漿中Ang-1和Tie2mRNA表達(dá)（±s）Table 2 Expressions of Ang-1and Tie2mRNA in the plasma of ARDS patients and control subjects（±s）

表2 ARDS患者和對照組血漿中Ang-1和Tie2mRNA表達(dá)（±s）Table 2 Expressions of Ang-1and Tie2mRNA in the plasma of ARDS patients and control subjects（±s）

與對照組比較，aP＜0.05；與輕度組比較，b P＜0.05；與中度組比較，c P＜0.05

組別 n Ang 40 3.47±1.14 1.54±0.91 ARDS患者 85 1.85±0.93a 0.87±0.47a輕度組 25 2.30±1.04 1.33±0.79中度組 36 1.81±0.90b 0.82±0.43b重度組 24 1.27±0.82bc 0.54±0.26-1mRNA Tie2mRNA對照組bc

2.3 ARDS患者外周血中Ang-1和Tie2表達(dá)與其他臨床指標(biāo)相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析顯示，ARDS患者外周血中Ang-1mRNA和 Tie2mRNA表達(dá)均與PaO2／FiO2呈正相關(guān)（均P＜0.05）；而與 APACHEⅡ、LIS、SOFA、C-反應(yīng)蛋白和IL-6呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05），見表3。

表3 ARDS患者外周血中Ang-1和Tie2mRNA表達(dá)與其他臨床指標(biāo)相關(guān)性分析Table 3 Analysis of the correlation of the expressions of Ang-1 and Tie2in the peripheral blood of ARDS patients with other clinical parameters

2.4 ARDS患者死亡相關(guān)危險因素分析

根據(jù)患者28d死亡情況，分為生存組（n＝47）和死亡組（n＝38），對有關(guān)影響因素進(jìn)行多因素Logistic回歸分 析。結(jié)果顯示，PaO2／FiO2和 APACHEⅡ評分是ARDS患者死亡的獨立危險因素（P＜0.05），而 Ang-1mRNA和 Tie2mRNA 相對表達(dá)量則是ARDS患者死亡的的保護(hù)性因素（均P＜0.05），見表4。

表4 ARDS患者死亡相關(guān)危險因素多因素Logistic回歸分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis of the risk factors for death in ARDS patients

2.5 外周血的Ang-1和Tie2表達(dá)在ARDS患者診斷中的價值

ROC曲線分析顯示，Ang-1mRNA相對表達(dá)量在診斷ARDS患者時的ROC曲線下面積為0.874（95%CI：0.809～0.938），靈敏度為72.5%，特異度為85.9%，Tie2mRNA相對表達(dá)量在診斷ARDS患者時的ROC曲線下面積為0.824（95%CI：0.737～0.911），靈敏度為62.5%，特異度為92.9%，見圖1。

圖1 外周血Ang-1和Tie2mRNA的表達(dá)在ARDS患者診斷中的價值Fig.1 Diagnosis values of the expressions of Ang-1and Tie2mRNA in the peripheral blood of ARDS patients

3 討論

ARDS患者發(fā)生急性肺水腫是導(dǎo)致患者呼吸功能不全或衰竭而造成死亡的重要原因［9］，研究表明［10］，肺泡上皮細(xì)胞及肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是造成肺泡及肺間質(zhì)水腫的病理基礎(chǔ)。隨著多種致病因素作用于肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，損傷程度隨之增加，使血管通透性改變而加重肺水腫的程度。研究發(fā)現(xiàn)［11］，Ang及其受體Tie在血管新生、重塑、成熟及穩(wěn)定中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。Ang-1和Ang-2是Ang家族重要成員，是具特征性的血管生長因子。Ang-1可由多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生，通過旁分泌而作用于內(nèi)皮細(xì)胞膜上的Tie2受體而對維持內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)定發(fā)揮重要作用［12］。Ang-2則由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，可競爭Ang-1與Tie2受體的結(jié)合，從而破壞血管細(xì)胞穩(wěn)定性［13］。有研究指出［7］，Ang-2在 ARDS患者血漿中含量顯著增加。本研究顯示，ARDS患者外周血中Ang-1mRNA和Tie2mRNA相對表達(dá)量均低于對照組（均P＜0.05），說明 Ang-1和Tie2在ARDS患者外周血中呈低表達(dá)，提示Ang－1表達(dá)下調(diào)可能是造成ARDS患者肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)定性降低，通透性增加的因素［14］。

本研究對不同程度ARDS患者比較顯示，重度組患者外周血中Ang-1mRNA和Tie2mRNA相對表達(dá)量均低于中度組和輕度組，且中度組均低于輕度組，Pearson相關(guān)分析顯示，ARDS患者外周血中Ang-1和Tie2表達(dá)均與PaO2／FiO2呈正相關(guān)（均P＜0.05）；而與 APACHEⅡ、LIS、SOFA、CRP和IL-6呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05），說明ARDS患者外周血中Ang-1和Tie2表達(dá)與患者病情嚴(yán)重程度有關(guān)，患者肺損傷程度越嚴(yán)重，外周血中Ang-1和Tie2表達(dá)量越少，從而使血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙越嚴(yán)重［14］。CRP和IL-6是應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng)的重要標(biāo)志物［15－16］，本研究顯示 ARDS患者病情進(jìn)展中出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)和炎性因子大量釋放，Pearson相關(guān)分析顯示，ARDS患者外周血中Ang-1和Tie2表達(dá)均與CRP和IL-6呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05），提示Ang－1和Tie2在抗炎反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［17］。本研究對影響ARDS患者死亡的因素進(jìn)行多因素Logistic回歸分析顯示，PaO2／FiO2和APACHEⅡ是ARDS患者死亡的獨立危險因素（均P＜0.05），而Ang－1 mRNA和Tie2mRNA相對表達(dá)量則是ARDS患者死亡的保護(hù)性因素（均P＜0.05），說明ARDS患者呼吸功能越差和病情越重，越易發(fā)生死亡，而Ang-1和Tie2在外周血表達(dá)量增加則可減少死亡發(fā)生，是重要的保護(hù)性因素。動物實驗亦顯示［5］，敲除小鼠Ang-1基因可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加。提示Ang-1和Tie2可作為預(yù)測預(yù)后的指標(biāo)，有望為ARDS患者治療提供新的線索。本研究ROC曲線分析顯示，Ang-1mRNA相對表達(dá)量在診斷ARDS患者時的曲線下面積為0.874（95%CI：0.809～0.938），靈敏度72.5%，特異度85.9%，Tie2mRNA相對表達(dá)量在診斷ARDS患者時的曲線下面積為0.824（95%CI：0.737～0.911），靈敏度62.5%，特異度92.9%，說明檢測外周血Ang-1和Tie2表達(dá)水平對ARDS患者轉(zhuǎn)歸具有一定的預(yù)測價值，可作為臨床診斷的輔助性指標(biāo)。

綜上所述，Ang-1在ARDS患者外周血中呈低表達(dá)，與患者病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，可能通過減少與Tie2的結(jié)合而加速ARDS患者內(nèi)皮細(xì)胞損傷及增加血管通透性，可作為預(yù)測患者預(yù)后的參考指標(biāo)，有望為ARDS患者治療提供新的線索。

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