梁麗建，葉曉青，鄧衍明，賈新平，孫曉波

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，江蘇 南京 210014;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，江蘇 南京210014)

土壤鹽漬化是當(dāng)今農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的重要危害之一，它不僅嚴(yán)重的影響了作物產(chǎn)量，也在一定程度上制約了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。目前，全世界約有22.1%的農(nóng)業(yè)用地正遭受到鹽害［1］，我國(guó)約有鹽漬土2 700萬(wàn)hm2［2］，并隨著生態(tài)環(huán)境的惡化、盲目過(guò)量的施用化肥和不合理地開(kāi)發(fā)利用，土壤鹽漬化在進(jìn)一步擴(kuò)大。利用體細(xì)胞篩選技術(shù)培育、選育耐鹽植物品種是開(kāi)發(fā)利用鹽堿地的一種有效方法。近年來(lái)，通過(guò)體細(xì)胞突變篩選技術(shù)已篩選獲得水稻、番茄、甘薯等多種植物的耐鹽變異體［3-5］。然而，利用體細(xì)胞突變篩選技術(shù)獲得的耐鹽突變體在抗性、產(chǎn)量、育性等方面也存在不協(xié)調(diào)的問(wèn)題［6］，因此，通過(guò)對(duì)耐鹽突變體材料形態(tài)和生理生化功能上差別的鑒定，可為判斷耐鹽突變體提供一些依據(jù)。

狼尾蕨(Davallia bullata)作為水龍骨目骨碎補(bǔ)科多年生匍匐草本蕨類植物，具有極高的觀賞價(jià)值。篩選具有高耐鹽特性的狼尾蕨品種對(duì)改善鹽堿地綠化景觀、利用和治理鹽堿地具有十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)室前期以狼尾蕨無(wú)菌苗葉片為外植體，通過(guò)體細(xì)胞耐鹽篩選獲得了NY-4、NY-5和NY-6 3個(gè)突變體再生株系，并認(rèn)為0.6%的NaCl為適宜的突變體篩選濃度［7］。本研究在已有研究的基礎(chǔ)上，以3個(gè)耐鹽突變體的一年生植株為材料，以野生型為對(duì)照，比較了它們經(jīng)脅迫后的生長(zhǎng)情況和生理生化特性，為開(kāi)展狼尾蕨突變體再生植株的耐鹽性鑒定和耐鹽育種研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)室前期分別以0.4%、0.5%和0.6%的NaCl作為篩選劑，通過(guò)體細(xì)胞耐鹽篩選獲得了NY-4、NY-5和NY-6 3個(gè)狼尾蕨再生株系。再生植株經(jīng)過(guò)移栽培養(yǎng)1年后形成具有根狀莖的小植株，將該小植株放置溫室培養(yǎng)6個(gè)月后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)以3種篩選植株和野生型植株(WT)的新鮮葉片為材料，葉片采自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)所試驗(yàn)苗圃地，取樣后迅速放入液氮中冷凍，然后置－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。2012年12月選取生長(zhǎng)良好、大小、長(zhǎng)勢(shì)基本一致的WT、NY-4、NY-5和NY-6一年生植株種于花盆中，花盆直徑為10 cm，高10 cm，每盆2株，共72株。盆土為泥炭土和珍珠巖的混合物(V(泥炭土)∶V(珍珠巖)=3∶1)，溫室中培養(yǎng)6個(gè)月后用1%NaCl脅迫處理，在處理0 d和20 d各澆NaCl溶液一次，每次每盆施加100 mL，花盆下墊塑料托盤，滲出液澆回花盆中，防止鹽分流失。NaCl脅迫期間，定期定量澆水，在脅迫處理0，20，40 d時(shí)對(duì)植株的形態(tài)外觀進(jìn)行觀測(cè)并取樣。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

在脅迫處理0，20，40 d時(shí)對(duì)植株的形態(tài)進(jìn)行觀察，記錄植株的生長(zhǎng)和鹽害情況，計(jì)算植株的存活率和鹽害指數(shù)。

鹽害分級(jí)參照孫海菁等［8］的標(biāo)準(zhǔn)，具體為:0級(jí):未受害;1級(jí):葉片出現(xiàn)少量卷曲;2級(jí):葉片出現(xiàn)黃化，部分葉尖或葉緣焦萎或輕度落葉;3級(jí):部分葉片焦萎或出現(xiàn)嚴(yán)重落葉;4級(jí):葉片全部脫落，植株死亡。

葉綠素含量測(cè)定采用乙醇浸提法［9］;丙二醛(MDA)含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法［10］;脯氨酸含量測(cè)定采用茚三酮顯色法［10］;可溶性蛋白的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法［10］;SOD活性的測(cè)定采用氮藍(lán)四唑法［10］。測(cè)定均重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0和Microsoft Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫下4種材料的存活率和鹽害指數(shù)

由表1可知，隨著NaCl脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，4種材料的存活率均呈下降趨勢(shì)，鹽害指數(shù)呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。鹽脅迫20 d時(shí)，4種材料均未有植株死亡，葉片傷害不大，僅有少量葉片泛黃脫落。在脅迫延長(zhǎng)至40 d時(shí)，4種材料均有部分植株死亡。3種突變體中NY-5和NY-6表現(xiàn)出了較好的耐鹽性，植株存活率分別為61.11%和69.14%，均高于 WT 的 55.55%;鹽害指數(shù)分別為 79.16%和 69.54%，均低于 WT 的81.94%;NY-4則耐鹽性最差，植株存活率較低，半數(shù)植株死亡，鹽害指數(shù)也最高為83.33%。

表1 鹽脅迫下供試植株的存活率和鹽害指數(shù)Tab.1 Survival rate and degree of salt injury in salt stress of experimental plant

2.2 NaCl脅迫對(duì)葉片葉綠素含量的影響

由圖1可以看出，未經(jīng)脅迫處理時(shí)，NY-5的Chl a、Chl b和Chl(a+b)含量顯著(P＜0.05)低于其它3種材料;脅迫處理期間，4種植物葉片Chl a、Chl b和Chl(a+b)含量均隨著鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而減少。鹽脅迫處理20 d時(shí)，與0 d時(shí)相比，WT和NY-4的Chl a含量均顯著性(P＜0.05)降低，分別降為0 d的60.44%和71.11%，而NY-5和NY-6的Chl a含量則無(wú)顯著性變化;WT、NY-4與NY-6的Chl b和Chl(a+b)含量均顯著性(P＜0.05)降低，降低幅度由大到小均為WT＞NY-4＞NY-6，而NY-5的Chl b和Chl(a+b)含量則無(wú)顯著性變化。當(dāng)脅迫延長(zhǎng)至40 d時(shí)，與0 d相比，4種材料的Chl a、Chl b和Chl(a+b)含量均顯著性(P＜0.05)降低，其中 Chl a含量下降幅度由大到小為 WT＞NY-6＞NY-4＞NY-5，分別為 0 d 的 42.34%、48.33%、51.14%和 51.86%;Chl b 含量下降幅度由大到小為 NY-5＞W(wǎng)T＞NY-6＞NY-4，分別為 0 d 的 51.1%、56.7%、65.13%和 69.12%;Chl(a+b)下降幅度由大到小依次為 NY-5＞NY-4＞W(wǎng)T＞NY-6，分別為 0 d 的44.87%、53.1%、53.15%和 55.37%;

圖1 鹽脅迫對(duì)4種狼尾蕨葉片葉綠素含量的影響Fig.1 Effect of salt stress on the blade chlorophyll content of four kinds of Davallia bullata

2.3 NaCl脅迫葉片脯氨酸、可溶性蛋白含量的影響

由圖2可以看出，未經(jīng)脅迫處理時(shí)，4種材料的脯氨酸含量差異不顯著(P＞0.05);脅迫處理期間，隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，WT葉片脯氨酸含量呈持續(xù)增加趨勢(shì)，3種突變體中NY-4、NY-5的變化趨勢(shì)與WT一致，而NY-6則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。在脅迫20 d時(shí)，脯氨酸含量增加幅度由大到小依次為WT、NY-4、NY-5、NY-6，分別為 0 d 的 1.433、1.188、1.12 和 1.034 倍;當(dāng)脅迫延長(zhǎng)至 40 d 時(shí)，脯氨酸含量增加幅度由大到小依次為 NY-4、NY-5、WT、NY-6，分別為 0 d 的 2.061、1.972、1.973 和 0.786 倍。

未經(jīng)脅迫處理時(shí)，4種材料的可溶性蛋白含量差異不顯著(P＞0.05);脅迫處理期間，隨鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，WT葉片可溶性蛋白含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，3種突變體呈現(xiàn)先降低后增高的趨勢(shì)。至脅迫處理40 d時(shí)，WT葉片可溶性蛋白含量顯著(P＜0.05)高于0 d，為0 d的1.549倍。3種突變體中NY-6葉片可溶性蛋白含量顯著(P＜0.05)低于0 d，為0 d的88.09%，NY-4、NY-5與0 d相比無(wú)顯著性變化。

圖2 鹽脅迫對(duì)4種狼尾蕨葉片脯氨酸和可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effect of salt stress on the blade proline and souble protein content of four kinds of Davallia bullata

2.4 NaCl脅迫對(duì)葉片丙二醛含量的影響

由圖3可以看出，在未受鹽脅迫時(shí)，3種突變體的MDA含量均顯著(P＜0.05)高于WT;在脅迫處理20天后，各材料葉片MDA含量均得到提高，其中3種突變體的增加幅度均小于WT，MDA增加幅度由大到小依次為 WT、NY-4、NY-6、NY-5，分別為0 d 的1.44、1.23、1.1 和1.07 倍;當(dāng)脅迫延長(zhǎng)至40 d 時(shí)，WT的MDA含量雖有所下降，但仍高于其0 d時(shí)的含量。3種突變體中NY-5的MDA含量有所升高，NY-4和NY-6則均降低，且均顯著(P＜0.05)低于0 d時(shí)含量。

2.5 葉片SOD 含量

由圖3可以看出，在沒(méi)有鹽脅迫時(shí)，3種突變體的SOD含量均顯著(P＜0.05)高于WT;在脅迫處理20 d時(shí)，4種材料葉片SOD含量均得到提高，增加幅度由大到小依次為WT、NY-4、NY-6、NY-5，分別為0 d時(shí)的 1.8、1.25、1.12 和 1.06 倍;當(dāng)脅迫延長(zhǎng)至 40 d 時(shí)，WT 的 SOD 含量持續(xù)升高，3 種突變體材料則均顯著(P＜0.05)降低，降低幅度由大到小依次為 NY-6＞NY-5＞NY-4。

圖3 鹽脅迫對(duì)4種狼尾蕨葉片MDA含量和SOD活性的影響Fig.3 Effect of salt stress on the blade MDA content and SOD activity of four kinds of Davallia bullata

2.6 4種材料生長(zhǎng)、生理指標(biāo)相關(guān)性分析

4種材料生長(zhǎng)、生理指標(biāo)測(cè)定值相關(guān)分析表明(表2):鹽脅迫下4種材料的生長(zhǎng)與生理指標(biāo)間均有一定的相關(guān)性，但不同指標(biāo)間的相關(guān)程度不同。其中，在植株存活率和鹽害指數(shù)這兩個(gè)生長(zhǎng)指標(biāo)中，植株存活率與Chl a、Chl b和Chl(a+b)呈極顯著(P＜0.01)正相關(guān)，與與脯氨酸含量呈顯著(P＜0.05)負(fù)相關(guān);鹽害指數(shù)與Chl a、Chl b和Chl(a+b)呈極顯著(P＜0.01)負(fù)相關(guān)，與脯氨酸含量呈顯著(P＜0.05)正相關(guān)。

表2 鹽脅迫下4種材料生長(zhǎng)、生理各指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)Tab.2 Correlation coefficient among different indexes of growth and physiology of four kinds of materials under salt stress

3 討論

鹽脅迫會(huì)對(duì)植物造成傷害，改變植物的形態(tài)和解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，引起植物的生理代謝發(fā)生紊亂，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育受到不同程度的抑制，甚至造成植物死亡。葉片是植物重要的功能器官，也是在脅迫下響應(yīng)最明顯的器官之一，多數(shù)植物受鹽害后葉尖、葉緣及至整張葉片出現(xiàn)枯焦、黃化、脫落、失水萎蔫等癥狀。在鹽脅迫下對(duì)植株的存活率和葉片鹽害指數(shù)進(jìn)行測(cè)定是植物耐鹽性鑒定最直接的方法［11］。耐鹽性較強(qiáng)的種類，其存活率隨著鹽害的加劇變化幅度較小，且其鹽害指數(shù)較低;而耐鹽性較弱的種類，其存活率隨著鹽害的加劇變化幅度增大，且其鹽害指數(shù)較高［8］。本試驗(yàn)中，隨著鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，4種供試材料的鹽害癥狀逐漸加劇，葉片相繼出現(xiàn)不同程度的枯黃、萎蔫和脫落等。在脅迫20 d時(shí)，4種材料均未有植株死亡，植株葉片呈現(xiàn)輕度鹽害癥狀，僅有少量葉片泛黃脫落，觀賞價(jià)值未受到較大影響;當(dāng)脅迫延長(zhǎng)至40 d時(shí)，4種材料均有部分植株死亡，植株葉片呈現(xiàn)重度鹽害癥狀，大量葉片泛黃、萎蔫和脫落;3種突變體中NY-6表現(xiàn)出了較好的耐鹽性，存活率變化幅度和鹽害指數(shù)均低于其它3種材料，耐鹽性明顯高于其它3種材料;而NY-4在4種材料中耐鹽性最差，存活率變化幅度和鹽害指數(shù)均高于WT。

葉綠素是植物耐鹽性的重要生理指標(biāo)之一，鹽脅迫不僅會(huì)使葉綠素酶活性增強(qiáng)，加速葉綠素分解，還會(huì)影響葉綠素合成酶的活性，抑制葉綠素合成，最終導(dǎo)致植物葉片葉綠素含量降低，引起植株光和能力下降［12］。在鹽脅迫下，植株葉綠素含量降低的程度和幅度反映了其對(duì)鹽脅迫的敏感性［13］。本試驗(yàn)中，在未經(jīng)脅迫處理時(shí)，NY-4和NY-6葉片中Chl a、Chl b和Chl(a+b)含量與WT均無(wú)顯著性差異，而NY-5葉片中Chl a、Chl b和Chl(a+b)含量則均顯著(P＜0.05)低于WT。這可能是由于NY-5的葉綠體結(jié)構(gòu)有別于WT，致使其葉綠素含量明顯的不同于其它材料，具體原因還有待于進(jìn)一步研究。在鹽脅迫初期，4種材料的Chl a、Chl b和Chl(a+b)均降低，且降低幅度由大到小依次為WT、NY-4、NY-6、NY-5，這一結(jié)果表明WT較突變體對(duì)鹽更為敏感，在脅迫初期葉綠素就開(kāi)始大量分解。當(dāng)脅迫延長(zhǎng)至40 d時(shí)，僅NY-6葉片中的Chl a、Chl b和Chl(a+b)降幅均小于WT，說(shuō)明NY-6具有一定的耐鹽性。NY-6的光合作用會(huì)有所增強(qiáng)以適應(yīng)高鹽環(huán)境，使其降低幅度較小，但隨著鹽脅迫的加劇，其細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧破壞葉綠素的合成，使其整體表現(xiàn)為葉綠素含量降低，這與張景云等［14］在對(duì)黃瓜不同耐鹽品種葉綠素含量的研究中的結(jié)果相似。

脯氨酸和可溶性蛋白是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，逆境條件下，植物可通過(guò)滲透調(diào)節(jié)作用減輕傷害［15］。目前對(duì)于逆境條件脯氨酸積累的研究尚無(wú)一致意見(jiàn)。從脯氨酸在逆境條件下的積累來(lái)看，它既可能是適應(yīng)性，又可能是細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損傷的表現(xiàn)［16］。可溶性蛋白與調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的滲透勢(shì)有關(guān)，高含量的可溶性蛋白可幫助維持植物細(xì)胞較低的滲透勢(shì)以抵抗逆境帶來(lái)的脅迫［17］。本試驗(yàn)中，未經(jīng)脅迫處理時(shí)，4種材料的脯氨酸和可溶性蛋白含量差異不顯著(P＞0.05)，說(shuō)明突變體材料的脯氨酸和可溶性蛋白含量與野生型本身差異不大，孔凡巖等［18］在對(duì)百喜草體細(xì)胞耐鹽突變體的耐鹽性研究中也得到相似結(jié)果;在鹽脅迫20 d時(shí)，4種材料的脯氨酸含量均得到提高，增加幅度由大到小為WT、NY-4、NY-5、NY-6;當(dāng)脅迫延長(zhǎng)至40天時(shí)，除NY-6略有降低外，其余3種材料的脯氨酸含量均增長(zhǎng)為對(duì)照的2倍左右。這一結(jié)果可能更為支持脯氨酸積累是植物受損傷的表現(xiàn)。在脅迫初期，4種材料均受到不同程度的鹽害，使其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損，引起脯氨酸含量升高，當(dāng)脅迫加劇時(shí)，植物受損加劇，脯氨酸含量繼續(xù)升高達(dá)到一個(gè)峰值。而NY-6具有一定的耐鹽性，植株受到的傷害較小，脯氨酸含量維持在較低水平。宗會(huì)等［19］在對(duì)水稻的研究中也發(fā)現(xiàn)抗逆性較強(qiáng)的水稻品種脯氨酸積累較少，而抗逆性弱的水稻品種脯氨酸積累較多。鹽脅迫下，WT的可溶性蛋白持續(xù)升高，變化幅度較大，3種突變體材料的可溶性蛋白含量呈先降低后升高，但變化幅度較小，這可能是突變體材料具有一定的耐鹽性，對(duì)鹽的敏感性不高，可溶性蛋白變化不大。

MDA作為膜脂過(guò)氧化作用的最終產(chǎn)物，是判定膜質(zhì)過(guò)氧化作用的重要指標(biāo)，它通過(guò)與膜結(jié)構(gòu)上的蛋白質(zhì)和酶結(jié)合使其失去活性，會(huì)破壞膜結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞毒性物質(zhì)［20］。本試驗(yàn)中，未進(jìn)行脅迫處理時(shí)，3種耐鹽突變體的MDA含量均高于對(duì)照，這與肖雯等［21］報(bào)道的情況相一致，可能是因?yàn)榭蛇z傳的抗鹽植物(包括鹽誘耐鹽品系)受制于各自遺傳性控制，能夠在高鹽環(huán)境長(zhǎng)期脅迫下維持所形成的獨(dú)特的生理代謝機(jī)制所致，甚至在較為平穩(wěn)的低鹽脅迫或者沒(méi)有鹽脅迫下也表現(xiàn)出來(lái)，即保持較高的MDA含量。在脅迫20 d時(shí)，各材料葉片MDA含量均得到提高，增加幅度由大到小依次為WT、NY-4、NY-6、NY-5，這表明鹽脅迫時(shí)發(fā)生了膜質(zhì)過(guò)氧化作用。3種突變體的增加幅度均小于WT，說(shuō)明突變體材料膜質(zhì)受損程度要低于WT，具有一定的耐鹽性;在脅迫40d后，除NY-5含量持續(xù)升高，其它3種材料MDA含量出現(xiàn)降低，這可能是由于加劇的鹽害造成細(xì)胞生化平衡系統(tǒng)的紊亂［22］。

在正常情況下，植物體內(nèi)的自由基的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。在鹽脅迫下，其體內(nèi)的活性氧平衡遭到破壞，自由基積累，引起植物氧化損傷。SOD是植物酶促防御系統(tǒng)的重要保護(hù)酶，具有清除活性氧自由基的作用，因此，SOD活性的高低以及在逆境中的變化趨勢(shì)在一定程度上可反映植物抗逆性的強(qiáng)弱［23］。本試驗(yàn)中，未進(jìn)行脅迫處理時(shí)，3種突變體的SOD含量均顯著(P＜0.05)高于WT，這可能與MDA情況相類似，是因?yàn)榭蛇z傳的抗鹽植物在維持其獨(dú)特的生理代謝機(jī)制。3種突變體材料隨著鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)SOD含量均呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，且達(dá)到最大值的時(shí)間明顯的短于WT，表明在一定鹽脅迫內(nèi)突變體材料可通過(guò)較短的時(shí)間提高SOD含量來(lái)減緩鹽害。

相關(guān)性分析結(jié)果表明:植株存活率和鹽害指數(shù)兩個(gè)最直接鑒定植株耐鹽性指標(biāo)與7個(gè)生理指標(biāo)都呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，尤其是葉綠素和脯氨酸含量的貢獻(xiàn)較大，說(shuō)明不同狼尾蕨植株耐鹽能力受光合作用和脯氨酸合成能力的影響較大。其中，植株的耐鹽性與葉綠素呈顯著正相關(guān)，與脯氨酸呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)。在脅迫處理期間，NY-6葉綠素下降幅度與脯氨酸增加幅度均最小，故其耐鹽能力強(qiáng)于其它3種材料。然而，由于各指標(biāo)所提供的信息發(fā)生重疊，故直接利用這些指標(biāo)中的單一指標(biāo)進(jìn)行耐鹽能力評(píng)價(jià)可能會(huì)有一定的片面性。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了以NaCl作為選擇劑，通過(guò)體細(xì)胞突變的方法確實(shí)可以獲得耐鹽性得到提高的狼尾蕨突變體，且不同的突變體耐鹽能力不同。植物的耐鹽性是多基因控制的復(fù)合遺傳性狀，植物的耐鹽機(jī)理涉及到從植株到器官、組織、生理生化直至分子的各個(gè)水平［24］。本實(shí)驗(yàn)雖然從形態(tài)及生理角度對(duì)3種突變體植株的耐鹽性差異進(jìn)行了研究，但為全面、系統(tǒng)的揭示突變體的耐鹽機(jī)理，尚需從器官、組織以及分子水平對(duì)其進(jìn)行更深入的解析。

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