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        不同溫育條件對酶聯(lián)免疫吸附試驗法測定乙型肝炎表面抗原結(jié)果的影響研究

        2015-05-15 08:14:56彭卓玲梁海英廣東省湛江市第三人民醫(yī)院廣東湛江524012
        吉林醫(yī)學(xué) 2015年11期
        關(guān)鍵詞:溫育孵育試劑盒

        宋 錦,彭卓玲,吳 斌,梁海英 (廣東省湛江市第三人民醫(yī)院,廣東 湛江 524012)

        ELISA 法檢測是目前實(shí)驗室生化檢測的常用方法之一,在臨床應(yīng)用較為廣泛。但ELISA 實(shí)驗中各個操作環(huán)節(jié)均可對試驗結(jié)果造成影響,進(jìn)而出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果,其主要影響因素包括血液樣本發(fā)生溶血、脂血及細(xì)菌污染、離心時間及離心轉(zhuǎn)速、標(biāo)本及實(shí)驗試劑加樣不準(zhǔn)確,以及溫度及溫育、洗板、顯色時間及溫度等[1]。其中,不同溫度及溫育是實(shí)際操作中影響結(jié)果的重要因素之一。我們對不同溫度及溫育條件下ELISA法測定HbsAg 的陽性結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)研究,現(xiàn)報告如下。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料:選擇2014 年1 月~2014 年5 月我院住院患者HbsAg 陽性標(biāo)本60 份,分離血清后置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2 方法:采用DR-200BS 酶標(biāo)儀、DRW-320 洗板機(jī)、HHW21-600BS 型數(shù)顯恒溫水浴鍋等設(shè)備及儀器,另外HBsAg ELISA 試劑盒由上海榮盛生物藥業(yè)有限公司提供,HBsAg 標(biāo)準(zhǔn)品廣東省臨檢中心提供。檢測時首先調(diào)節(jié)室溫至25℃,從冷藏環(huán)境中取出試劑盒,在室溫下平衡30 min,同時將濃縮洗滌液作1∶20 稀釋,分別采用兩種不同溫度及溫育時間進(jìn)行實(shí)驗,觀察組標(biāo)本采用37℃分別孵育10 min、20 min 及30 min,對照組采用25℃分別溫育10 min、20 min 及30 min。試驗操作嚴(yán)格按照試劑盒說明步驟進(jìn)行操作,每個樣本反復(fù)檢測4 次,每次置于5 微孔平行檢測,同時設(shè)空白對照孔一孔,陰性對照、陽性孔各兩孔。具體步驟如下:平衡,從-20℃冰箱中取出待測血清及2 ~8℃冷藏環(huán)境中取出檢測試劑盒,置于室溫中30 min 待用;配液,用蒸餾水或去離子水將濃縮洗滌液作1∶20 稀釋待用;加樣,分別取待檢樣品加入各孔中,其中陰性對照組、陽性對照組及室內(nèi)質(zhì)控品各取50 μl;加酶,取酶標(biāo)試劑50 μl 加入各孔中;溫育,用封板膜妥善封板后置于不同的溫育溫度下孵育不同的時間;洗滌;取出封板膜后用洗板機(jī)洗滌酶標(biāo)板5 次至扣干;顯色,將顯色劑A、B 各50 μl 加入各孔,不同溫度條件下避光顯色15 min;測定,將終止液50 μl 加入各孔,采用酶標(biāo)儀:檢測波長450 nm,參考波長630nm,測定各樣品的OD 值。讀數(shù)須在終止液反應(yīng)后10 分鐘內(nèi)完成。陰性對照平均值小于0.1,陽性對照平均值大于1.2。Cutoff 值計算:Cov=陰性對照平均值OD 值×2.1,比較兩組不同溫育條件下樣本的陽性率。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS12.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析。

        2 結(jié)果

        2.1 兩組陽性檢測結(jié)果比較:觀察組孵育10 min、孵育20 min、孵育30 min 的陽性率與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05)。見表1。

        表1 兩組陽性例數(shù)檢測結(jié)果比較[例(%)]

        2.2 兩組OD 值均值比較:觀察組孵育30 min 時OD 值明顯高于對照組,兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。見表2。

        表2 兩組OD 值均值比較

        表2 兩組OD 值均值比較

        注:與對照組比較,①P <0.05

        組別 例數(shù) 孵時育O1D0 值min孵時育O2D0 值min孵時育O3D0 值min觀察組30 1.81±0.24 2.11±0.22 2.45±0.21①對照組30 1.65±0.21 1.95±0.23 2.13±0.33 P 值0.250 0 0.310 8 0.031 2

        3 討論

        乙肝表面抗原(HbsAg)為乙肝病毒的外殼蛋白物質(zhì),廣泛存在于患者的血液、陰道分泌物、精液、唾液、乳汁、淚液、汗液以及鼻咽分泌物等體液中,是臨床檢測已感染乙肝病毒的重要標(biāo)志之一。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)在臨床應(yīng)用較為廣泛,是感染性疾病目前常用的血清學(xué)標(biāo)志物免疫測定方法之一,也是免疫學(xué)及分子生物學(xué)當(dāng)中最為中重要的方法之一,具有簡便、快捷、特異性強(qiáng)、靈敏度高以及可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),同時該檢測方法對實(shí)驗室設(shè)備及儀器要求低,不存在放射性污染,因此在臨床廣泛應(yīng)用[2]。盡管ELISA 操作過程簡便,原理簡潔,但在實(shí)際臨床實(shí)驗室工作中,經(jīng)常出現(xiàn)不同操作者得到的不同測定結(jié)果的情況,除了由于操作者對整個測定過程沒有進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化、操作細(xì)節(jié)出現(xiàn)偏差等因素對測定結(jié)果影響之外,溫育溫度和溫育時間是影響檢測結(jié)果不可忽視的因素之一。

        我們對不同溫度及溫育條件下ELISA 法測定HbsAg 的陽性結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)研究,觀察組孵育10 min、孵育20 min、孵育30 min 的陽性率與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05);觀察組孵育30 min 時OD 值明顯高于對照組,兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05);提示兩組不同條件下檢出率基本一致,而37℃孵育30 min 的檢出率略優(yōu)于其他實(shí)驗條件,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05)。試驗顯示,在同一孵育溫度下,反應(yīng)時間在10 ~30 min 內(nèi)其OD 值與反應(yīng)時間呈線性關(guān)系,即反應(yīng)時間越長,則OD 值越大。以上研究結(jié)果表明,在實(shí)驗設(shè)備及儀器、試劑、操作、離心時間及離心轉(zhuǎn)速、洗板、顯色時間均一致的條件下,37℃孵育30 min OD 值高于25℃反應(yīng)條件,檢出率隨之升高。為進(jìn)一步提高檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性,在采用37℃孵育30 min反應(yīng)的前提下,仍需要做好以下幾點(diǎn):首先嚴(yán)格選擇試劑,保證試劑的質(zhì)量,購買時嚴(yán)把三證齊全的關(guān)卡,禁止使用過期的試劑;試劑盒必須置于室溫平衡30 min 后方可使用。同時,注意保持標(biāo)本的新鮮性,最好是當(dāng)天采集的標(biāo)本當(dāng)天進(jìn)行檢測[3];若標(biāo)本采集后如無法進(jìn)行及時檢測則需分離血清置于-20℃以下保存?zhèn)溆?,?yán)禁反復(fù)凍融。嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度,溫育中應(yīng)封閉樣本,防止邊緣效應(yīng)的產(chǎn)生。洗板時需徹底,但切忌過度洗板,防止抗原抗體復(fù)合物脫掉;顯色時應(yīng)嚴(yán)格按操作時間,每批測試均需做室內(nèi)質(zhì)控,同時要建立完善審核制度[4]??傊?7℃孵育30 min OD 值高于25℃反應(yīng)條件,檢出率高,值得推薦,同時配合嚴(yán)格的操作細(xì)節(jié),保證檢驗結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。

        [1] 李金明.臨床酶免疫測定技術(shù)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2005:87-90.

        [2] 葛君琍,王麗娜.不同溫育方式對ELISA 法檢測HbsAg結(jié)果的影響[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2013,34(2):194.

        [3] 郭 翀,張真銘.ELISA 法檢測HBsAg 實(shí)驗條件的優(yōu)化[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2011,32(6):656.

        [4] 劉 婷.3 種不同實(shí)驗條件的ELISA 法檢測HBsAg 的比較研究[J].中外醫(yī)學(xué)研究,2012,10(726):48.

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