胡樂琴，馬曉康，吳春燕

(上海海洋大學 水產(chǎn)與生命學院 ，上海 201306)

腹瀉性貝毒(diarrhetic shellfish poison，DSP)是危害比較嚴重的赤潮毒素之一，在世界廣泛存在［1-3］。DSP中導致腹瀉的主要成分是軟海綿酸(okadaicacid，OA)及其衍生物鰭藻毒素(dinophysistoxins，DTXs)，OA分布廣泛［4］、發(fā)病率高，對腸道、肝臟、神經(jīng)、胎盤等多種器官和組織具有致病性，引起的急性中毒癥狀為腹瀉、惡心、嘔吐及腸胃絞痛等［5－7］。要預防藻毒素的危害就必須有靈敏的檢測方法。免疫學技術具有快速、靈敏、操作簡單、不需要復雜儀器設備、價格低廉、便于制成可攜帶的檢測紙板和試劑盒等優(yōu)點，成為藻毒素現(xiàn)場快速檢測的首選方法［8］。國際上已經(jīng)有關于免疫檢測技術在藻毒素檢測的研究報道［9］，并且已經(jīng)制備出了部分藻毒素的ELISA試劑盒，如美國、日本、歐洲一些國家有微囊藻毒素(microcystin)和軟海綿酸(okadaic acid，OA)的ELISA檢測試劑盒銷售［10］;近年我國也有學者研究藻毒素的免疫檢測技術，如劉仁沿［11］研究了OA的膠體金檢測、趙曉聯(lián)［12］研究了MCs的免疫檢測、盧士英［13］建立了OA的ELISA檢測等。我國目前已經(jīng)有自制的OA ELISA檢測試劑盒，但尚無OA膠體金檢測試紙板銷售。研制具有我國自主知識產(chǎn)權的高質量的藻毒素膠體金檢測試紙條，是我國藻類學者努力的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

軟海綿酸購自北京伊普瑞斯公司;單抗為實驗室制備。其它試劑均購自上海生工。

1.2 OA-BSA 的制備

1.2.1 試劑配制 (1)將500 μg MC－LR(OA)溶于0.5 mL DMSO中，配制成1 mg/mL溶液;(2)配制交聯(lián)劑溶液:水溶性碳二亞胺－NHS液，濃度為10 μL純水中含EDC(水溶性碳二亞胺)50 μg和NHS(N － 羥基琥珀酰亞胺)30 μg及10 μL 純水中含 EDC150 μg 和 NHS100 μg。

1.2.2 偶聯(lián)方法 稱取4份100 μg OA分別放于4個燒杯中，每份中各加入上述交聯(lián)劑溶液10 μL，振蕩反應15 min，然后各管中加1 mg/mL BSA－PBS液300 μL，靜止4℃中過夜，次日各裝透析袋對pH7.2 0.01 mol/L PBS透析，換液4次。然后取出偶聯(lián)物OA－BSA，按所加入抗體量及體積計算抗體濃度。

1.3OA-BSA在檢測線(T)工作濃度的確定

調(diào)整OA-BSA的包被濃度，按工藝組裝試劑條，以陽性標本和PBS加樣比較不同包被濃度的靈敏度高低。

1.4 膠體金標記單抗的制備

1.4.1 單抗純化 采用飽和硫酸銨法純化抗體［14］，再用親合層析柱進一步純化。－20冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 鹽析抗體的定量 將鹽析單抗用PBS作1∶10稀釋，測定A260=0.337 4及A280=0.517 0，按公式A280×1.45－A260×0.74計算鹽析單抗的濃度。

1.5 膠體金的制備及對單抗的標記

采用檸檬酸三納還原法制備不同直徑大小膠體金的制備［15］。標記:分別取2 mL金溶膠與200單抗(質量濃度50 ～400 μg/mL)，混勻，攪拌1 h;加入 BSA 20 mg，攪拌30 min，10 000 r/min 離心30 min，傾上清液，加入100 μL 20 mmol/L Tris－HCL(pH7.4)，攪拌，使沉淀溶解，再加入適量BSA使終濃度為10 mg/mL。放置于4℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.1 金標時單抗?jié)舛鹊拇_定 用噴金機對各單抗質量濃度(50，100，200，300，400μg/mL)標記的金標鼠抗OA進行包被，均噴2.5 μL/cm，干燥后組裝試紙，以50 ng/mL OA陽性標本和PBS加樣，比較不同單抗?jié)舛葘饦藛慰轨`敏度的影響。

1.5.2 金標鼠抗OA單克隆抗體包被量的確定 用噴金機對金標抗OA單克隆抗體進行包被，噴不同的噴量，干燥，按工藝組裝試紙條，以陽性標本和PBS加樣比較不同包被量的檢測結果。

1.5.3 控制線(C)工作液濃度的確定 配制不同濃度的羊抗鼠IgG抗體，按工藝組裝試紙條，用PBS加樣，比較在不同包被濃度條件下對照線顯色的時間。

1.5.4 確定試紙條反應時間 在各金標反應試紙板塊上，分別加50 ng/mL OA陽性標本和PBS，設置4個實驗，A實驗方案:反應時間為2 min;B實驗方案:反應時間為3 min;C實驗方案:反應時間為5 min;D實驗方案:反應時間為10 min)，在2～10 min內(nèi)看T線顯色情況。

1.5.5 靈敏度的檢測 以各最佳實驗條件制備金標測試條，對各濃度單抗作靈敏度檢測。

1.6 加標貝肉的膠體金測試

取新鮮貝類，洗凈，取貝肉，勻漿，取少量勻漿肉，加 OA 標準品至質量濃度為3.08，6.25，12.5，25，50 ng/mL，每組設4個平行，提取物進行膠體金試紙條檢測。

1.7 使用方法

若測試板條放在4℃中保持，由冰箱中取出后需在室溫中放置30 min后方能啟封。板條平放，在加樣區(qū)中滴加2滴樣品，3～5 min內(nèi)觀察記錄結果。同時做陽性樣品和PBS陰性樣品，以利對待檢樣本結果的判斷。T線不顯色及微顯色為陽性，接近或同PBS顯色為陰性。C線顯色為該板條有效，不顯色為板條已失效。置2～30℃中保存，遠離潮濕和光照。有效期2 a。

2 結果與分析

2.1 交聯(lián)劑濃度的確定

以0.1 mg/mL OA-BSA包被反應膜，以一定量的金標單抗噴灑在膜上，以PBS作為陰性標本比較T線的顯色強度，觀察不同濃度交聯(lián)劑的T線強度，實驗結果如表1所示。顯示膠聯(lián)劑濃度高效果好，故在制備金標條時采用EDC150 μg NHS100 μg/10μL作為交聯(lián)劑制備的OA-BSA。

表1 交聯(lián)劑及濃度對偶聯(lián)效果的影響Tab.1 Effect of crosslinking agents and concentration on crosslinking efficiency

2.2OA-BSA在檢測線(T)工作濃度的確定

調(diào)整OA-BSA的包被濃度，按工藝組裝試劑條，以陽性標本和PBS加樣比較不同包被濃度的靈敏度高低，結果如表2所示。由表2可以得出:當包被濃度為0.05 mg/mL時，既能滿足陽性標本的檢出要求，又能達到PBS標本的要求，而進一步提高包被濃度則可能會降低OA的檢測靈敏度。降低包被濃度則不能滿足PBS標本的檢出要求，T線會顯色更淺，綜合考慮最終確定OA-BSA檢測線包被濃度為0.05 mg/mL。

表2 OA－BSA不同包被濃度對OA檢測的影響Tab.2 Effect of different OA －BSA enveloping concentration on OA detection

2.3 膠體金顆粒大小確定

膠體金顆粒本身帶有紫色，其顆粒大小將直接影響試紙條上的檢測效果。只有同時滿足了陽性標本檢測不出線和PBS標本檢測顯色明顯這2個要求的顆粒大小才能用于試紙條檢測要求。實驗結果表明，顆粒大小為30 nm的膠體金能同時滿足陽性標本檢出時間要求和PBS標本檢測效果要求，因此選擇30 nm的膠體金顆粒用于標記檢測和試紙條制備。

2.4 金標單抗?jié)舛鹊拇_定

取膠體金2 mL，加入不同濃度的單抗進行金標記，制得的金標抗體進行試紙條檢測，檢測效果顯示，金標記單抗?jié)舛葹?00 μg/mL時，陽性與陰性標本的檢測結果最好。

2.5 金標鼠抗OA單克隆抗體包被量的確定

用噴金機對金標鼠抗OA單克隆抗體進行包被，噴不同的噴量，以陽性標本和PBS加樣比較不同包被濃度的靈敏度高低。實驗結果顯示:當噴量達到2.5 μL/cm，陽性標本和PBS標本的檢出結果即已符合設計要求，綜合考慮最終確定金標單抗的包被量，即噴金機噴量為2.5 μL/cm。

2.6 控制線(C)工作液濃度的確定

調(diào)整羊抗鼠IgG抗體濃度，按正常制備工藝組裝試紙條，用PBS加樣比較不同包被濃度對照線顯色時間。結果如表3。

表3 控制線(C)工作液濃度對金標檢測效果的影響Tab.3 Effect of working liquid concentration for contorl line(C)on detecting efficiency for mcabs labeled with gold

包被濃度達到1.0 mg/mL時，對照線即在1 min清晰可辨，符合設計要求，最終確定對照線包被單抗鼠IgG濃度為1.0 mg/mL。

2.7 反應時間的確定

實驗結果顯示:A方案。檢測區(qū)(T)無條帶，PBS顯色弱，測試不合格;B方案:檢測區(qū)(T)無條帶，PBS顯色強，測試合格;C方案:檢測區(qū)(T)無條帶，PBS顯色強，測試合格;D方案檢測區(qū)(T)有條帶，PBS顯色強，測試不合格。由此可知，選擇反應時間為3～5 min觀察金標測試結果效果最佳，10 min的測試結果為無效。

2.8 靈敏度測試結果

以各最佳實驗條件制備的本批OA試紙條，對各濃度作靈敏度檢測結果，實驗結果顯示，以肉眼不出線為標準，該批試紙條的靈敏度為12.5 ng/mL，參照酶標50%抑制率為靈敏度判斷標準，則本金標試劑條的靈敏度為6.25 ng/mL。圖1為試紙條測試結果，6.25 ng/mL微弱顯色，靈敏度即為6.25 ng/mL。

2.9 加標貝肉樣品測試

用膠體金試紙條檢測貝肉模擬加標的靈敏性。將OA標準品加入貝肉勻漿中，使終濃度分別為 3.08，6.25，12.5，25，50 ng/mL，每組設 4 個平行，提取物進行膠體金試紙條檢測，檢測結果顯示，當加標濃度為12.5 ng/mL時，試紙條檢測線沒有顯色，完全是陽性結果;當加標濃度為6.25 ng/mL時，試紙條檢測線的顏色不夠穩(wěn)定，略微顯色，比控制線的顏色淺，檢測結果判斷為陰性;而當加標濃度為3.08 ng/mL時，試紙條檢測線的顏色和控制線的顏色完全一致，為陰性結果。由此檢測結果可知，研制的膠體金免疫層析檢測試紙條檢測加標貝肉樣品時，其檢測靈敏度和標準溶液一致，檢測線為6.25 ng/mL。

圖1 膠體金層析試紙條檢測結果Fig.1 Immunochromatographic detection of OA using test strip

3 結論

本研究利用制備的軟海綿酸單克隆抗體研制了OA的膠體金層析檢測技術，確定了最佳的OA-BSA檢測線(T)工作濃度為0.05 μg/mL;確定了最佳大小的金顆粒為30 nm;確定了金標時單抗?jié)舛葹?00 μg/mL;確定了金標時單抗包被量為2.5 μL/cm;確定了最佳MC-LR-BSA和OA-BSA控制線(C)工作濃度為1.0 mg/mL;確定了反應時間為3～5 min;制備了最低檢測線為6.25μg/mL的軟海綿酸膠體金檢測試紙條;用該試紙板條檢測實際樣品，檢測結果表明試紙板檢測效果較好，可以檢測較低濃度的毒素樣品，在一定程度上滿足了我國藻毒素的檢測要求。

建立的軟海綿酸藻毒素膠體金測試紙條的檢測限雖然與我國的毒素含量檢測標準尚有一定差距，但經(jīng)過適當前處理，同樣可以達到檢測水樣和食品是否符合國家標準效果，且整個檢測全過程時間僅為10～35 min，完全可以用于大量樣品初步篩查。由于膠體金試紙條檢測方法簡單、結果直觀、價格便宜、便于攜帶，因此，在水樣及水產(chǎn)品大量篩查中有更高的使用價值，與其他精細檢測方法結合使用，必能降少很大檢測工作量和節(jié)省大量檢測費用。預計將在檢驗檢疫、食品安全部門及衛(wèi)生監(jiān)控部門具有很好的應用前景，有一定的經(jīng)濟和社會效益。同時，可為水產(chǎn)品食用安全檢測國際方法的修訂或增補提供科學依據(jù)。

膠體金試紙板檢測快速、價廉，可用于大量樣品的初篩。且金標檢測技術尚有優(yōu)化空間，可以進一步優(yōu)化反應參數(shù)，尤其是優(yōu)化試紙條用材，可以提高試紙條檢測限度，并能直接達到世界衛(wèi)生組織的毒素最低含量標準。

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