呂 昉，周 瑾，費(fèi) 揚(yáng)，陳 雨，張國慶，趙 亮（第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院藥材科，上海 200438）

?研究報(bào)告?

應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定貓人參中積雪草酸的含量

呂 昉，周 瑾，費(fèi) 揚(yáng)，陳 雨，張國慶，趙 亮（第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院藥材科，上海 200438）

目的建立貓人參藥材中積雪草酸的含量測(cè)定方法。方法采用高效液相色譜法，色譜柱為Agilent HC-C18柱（4.6 mm×250mm，5.0μm），流動(dòng)相為乙腈（30 mmol／L）-醋酸銨水溶液（35∶65），流速1.0 m l／min，柱溫25℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量25μl，運(yùn)行時(shí)間35 min。結(jié)果積雪草酸與周圍干擾峰達(dá)到基線分離，線性范圍25.3～506.0μg／m l，r＝0.999 6；日內(nèi)及日間精密度均＜3%（n＝5），平均回收率為99.4%（RSD＝1.9%，n＝6），貓人參中積雪草酸的含量為0.751 mg／g。結(jié)論該法簡(jiǎn)便快捷、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、實(shí)用性強(qiáng)，可用于貓人參藥材中積雪草酸的含量測(cè)定。

貓人參；積雪草酸；含量測(cè)定；高效液相色譜法

貓人參為獼猴桃科植物鑷合獼猴桃（Actinidia valvata Dunn）的根，具有清熱解毒、消腫癤的功效，主要用于治療骨髓炎、瘡瘍膿腫、肝硬化、黃疸、腹水、消化系統(tǒng)腫瘤等［1］。藥理學(xué)研究表明，貓人參提取液具有良好的抗肝癌作用［2，3］，對(duì)貓人參藥材化學(xué)成分的研究表明其含有積雪草酸［4，5］。積雪草酸是烏蘇烷型五環(huán)三萜酸，具有抑制肝癌細(xì)胞增生、保肝及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等多種作用［6-9］。目前針對(duì)貓人參藥材的質(zhì)量控制方法鮮有報(bào)道，而積雪草酸的含量測(cè)定方法文獻(xiàn)報(bào)道也較少［10］。為了對(duì)貓人參藥材進(jìn)行質(zhì)量控制，保障臨床用藥安全有效，本研究以積雪草酸為對(duì)象，采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)貓人參中的積雪草酸進(jìn)行含量測(cè)定。

1 儀器與試藥

Agilent-1100系列HPLC儀（美國安捷倫公司），包括G1379A真空脫氣機(jī)、G1311A四元泵、G1367A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱和G1315A單波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器；AE240型十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒公司）。

貓人參藥材飲片（產(chǎn)地：安徽，批號(hào)：120503、100901；產(chǎn)地：湖南，批號(hào)：130601），經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)生藥學(xué)教研室孫連娜副教授鑒定為獼猴桃科植物鑷合獼猴桃的根；對(duì)照品積雪草酸購自成都思曼特生物科技有限公司（純度≥98.0%），醋酸銨為分析純（上海國藥集團(tuán)），甲醇為色譜純（美國Honeywell），水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Agilent HC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5.0μm），流動(dòng)相：乙腈（30 mmol／L）-醋酸銨（35∶65）；流速1.0 m l／min，柱溫25℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量25μl，運(yùn)行時(shí)間35 m in。

2.2 供試品溶液的制備 取貓人參藥材飲片適量，置粉碎機(jī)中打碎，過60目篩，取粉末約1 g，精密稱定，置50 m l錐形瓶中，加入甲醇20 m l，超聲提取60 min，過濾，收集濾液；置水?。?0℃）濃縮甲醇至約5 m l，轉(zhuǎn)移至10 m l量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻，用0.45μm有機(jī)濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制 精密稱取積雪草酸對(duì)照品10.12 mg，置10 m l量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，得積雪草酸濃度為1.012 mg／m l的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1系統(tǒng)適應(yīng)性 取積雪草酸對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣25μl，結(jié)果見圖1。積雪草酸保留時(shí)間約為27.5 m in，峰形對(duì)稱，理論塔板數(shù)＞8 000，與周圍干擾峰分離度均＞1.5。

2.4.2線性關(guān)系 按逐級(jí)稀釋法，精密量取積雪草酸對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置5 m l量瓶中，用甲醇定容至刻度，得濃度分別為506.0、253.0、101.2、50.6、25.3μg／m l的系列對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，以濃度為橫坐標(biāo)（X），色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得積雪草酸回歸方程：Y＝7.436 3 X＋2.631 9，r＝0.999 6，線性范圍25.3～506.0μg／m l。

2.4.3 精密度實(shí)驗(yàn) 取積雪草酸低（25.3μg／m l）、中（101.2μg／m l）、高（506.0μg／m l）3個(gè)濃度的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，在1 d內(nèi)分別進(jìn)樣5次，以及連續(xù)3 d每天分別進(jìn)樣2次，考察日內(nèi)、日間精密度。積雪草酸在低、中、高濃度的日內(nèi)精密度分別為1.8%、2.2%、0.9%，日間精密度分別為2.3%、2.1%、0.9%，均＜3%，表明此法精密度良好。

圖1 貓人參提取物HPLC圖

2.4.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取貓人參樣品（批號(hào)：120503）粉末約1 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行操作6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算積雪草酸的含量，積雪草酸含量RSD＝2.6%，表明此法重復(fù)性良好。

2.4.5 回收率實(shí)驗(yàn) 取貓人參樣品（批號(hào)：120503）粉末約0.5 g，精密稱定，置50 m l錐形瓶中，再加入新配制濃度為1.010 mg／m l的積雪草酸對(duì)照品溶液0.4 m l，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行操作6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定含量。積雪草酸的平均加樣回收率為101.8%，RSD＝1.6%，符合對(duì)準(zhǔn)確度的要求。

2.4.6 檢測(cè)限及定量限 取濃度為25.3μg／m l積雪草酸的對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析，以信噪比為10∶1確定其最低定量限，積雪草酸的最低定量限為25.3μg／m l；將此溶液稀釋后進(jìn)樣，以信噪比為3∶1確定其最低檢測(cè)限，積雪草酸的最低檢測(cè)限為12.65μg／m l。

2.4.7 穩(wěn)定性考察 取貓人參樣品（批號(hào)：120503）粉末約1 g，精密稱定，置50 m l錐形瓶中，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，放入進(jìn)樣器樣品盤中，分別于0、1、2、4、6、8 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算積雪草酸的濃度，計(jì)算RSD＝2.9%，表明樣品溶液在8 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.5 含量測(cè)定 取不同批次貓人參藥材飲片，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定積雪草酸的含量，結(jié)果見表1。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 由于積雪草酸在紫外檢測(cè)器上為末端吸收，且吸收較弱，采用210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)能夠降低背景噪音，使積雪草酸達(dá)到最好的信噪比，若波長(zhǎng)＜210 nm則會(huì)因?yàn)楸尘拔仗珡?qiáng)而導(dǎo)致色譜圖在積雪草酸保留時(shí)間處出現(xiàn)倒峰。

表1 貓人參中積雪草酸的含量測(cè)定結(jié)果

3.2 流動(dòng)相的考察 由于甲醇在210 nm處有紫外吸收，采用含甲醇系統(tǒng)的流動(dòng)相時(shí)，積雪草酸的吸收峰被流動(dòng)相背景吸收掩蓋，故采用乙腈-水系統(tǒng)考察，發(fā)現(xiàn)積雪草酸的峰形前延嚴(yán)重、對(duì)稱性較差。在水相中加入醋酸銨能夠改善峰形，考察了濃度為10、20及30 mmol／L醋酸銨時(shí)的色譜峰對(duì)稱性，發(fā)現(xiàn)醋酸銨濃度為30 mmol／L時(shí)積雪草酸色譜峰形對(duì)稱，達(dá)到定量分析的要求，同時(shí)對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行了優(yōu)化，使之與干擾峰達(dá)到基線分離。

3.3 色譜柱的考察 貓人參中成分復(fù)雜，為達(dá)到定量分析的要求，需要對(duì)積雪草酸及干擾峰進(jìn)行完全分離。考察了不同類型填料色譜柱對(duì)積雪草酸與雜質(zhì)分離的影響，如Chromasil-C18、Waters RP-C18、Agilent XDB-C18、SB-C18、Plus C18及HC-C18柱，發(fā)現(xiàn)在Agilent HC-C18（4.6 mm×250 mm，5.0μm）色譜柱上，積雪草酸色譜峰與周圍峰的分離度良好、保留時(shí)間合適，且峰形對(duì)稱，符合本研究要求。

3.4 前處理方法的考察 為能簡(jiǎn)便、快速地從貓人參藥材中提取積雪草酸，將藥材飲片粉碎后采用甲醇超聲提取，設(shè)計(jì)三因素、三水平正交試驗(yàn)，考察提取溶劑體積（10、20、30倍量）、超聲時(shí)間（20、40、60 min）及超聲次數(shù)（1、2、3次）對(duì)積雪草酸提取結(jié)果的影響，結(jié)果表明，影響積雪草酸提取效率的因素順序?yàn)槿軇┍稊?shù)＞提取時(shí)間＞提取次數(shù)，最終確定樣品前處理方法為20倍量甲醇超聲60 min提取1次。

本研究建立了HPLC法測(cè)定貓人參中積雪草酸含量的方法，通過對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)、色譜柱及流動(dòng)相組成等條件的摸索，確定最優(yōu)色譜條件；同時(shí)采用正交試驗(yàn)優(yōu)化得到貓人參中積雪草酸的提取方法。此法前處理?xiàng)l件簡(jiǎn)便快速，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，實(shí)用性強(qiáng)，可用于對(duì)貓人參藥材中積雪草酸的含量測(cè)定及質(zhì)量控制。

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Determ ination of asiatic acid in the root of Actinidia valvata by HPLC

LüFang，ZHOU Jin，F(xiàn)EIYang，CHEN Yu，ZHANG Guoqing，ZHAO Liang（Departmentof Pharmacy，Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital Affiliated to Second M ilitary Medical University，Shanghai200438，China）

ObjectiveTo establish a method for the determination of asiatic acid in the root of Actinidia valvata.MethodsHPLC-VWD was used in the analysis.The column was Agilent HC-C18（4.6mm×250mm，5μm）；themobile phase was acetonitrile：（30mmol／L）acetic acid amine solution（35∶65）；the flow ratewas 1.0m l／min；the temperature of column was 25℃；the detection wavelength was set at 210 nm；the injection volumewas 25μl；the running timewas 35 min.ResultsAsiatic acid was separated w ith interference in baseline.The linear range was 25.30-506.0μg／m lw ith linear correlation of 0.999 6 for asiatic acid.The resultof intra-day and inter-day precisionswere both within 5%（n＝3），and theaverage recovery was 99.4%with RSD 1.9%（n＝6）.ConclusionThemethod was simple，rapid，accurate and convenient for quality controlof asiatic acid in the root of Actinidia valvata.

Actinidia valvata；asiatic acid；determination；HPLC

R284.2；O657.72

A

1006-0111（2015）04-0356-03

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.04.017

2014-03-06

2014-09-09［本文編輯］李睿旻

呂 昉，藥師.Tel：（021）81875577；E-mail：lvfang-2005＠163.com

趙 亮，主管藥師.研究方向：中藥質(zhì)量控制研究.Tel：（021）81875584，E-mail：zhaoliangphar＠163.com