王金鳳，趙 楠，魏 穎，楊翠燕，王 芳，劉 丹（解放軍208醫(yī)院，吉林長春 130062）

?論著?

正交試驗(yàn)法優(yōu)選葛花異黃酮的提取工藝

王金鳳，趙 楠，魏 穎，楊翠燕，王 芳，劉 丹（解放軍208醫(yī)院，吉林長春 130062）

目的優(yōu)選葛花異黃酮的提取工藝。方法乙醇回流提取葛花異黃酮，采用紫外分光光度（UV）法和高效液相色譜（HPLC）法測定葛花中總黃酮及鳶尾苷、鳶尾苷元含量。在對乙醇濃度、溶劑用量、提取時(shí)間等進(jìn)行單因素考察基礎(chǔ)上，選用L9（34）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝。結(jié)果葛花異黃酮的最佳提取工藝為第1次加入12倍量70%乙醇提取90min，第2次加入10倍量70%乙醇提取60 m in。結(jié)論優(yōu)選的葛花異黃酮提取工藝合理可行，能為實(shí)際生產(chǎn)提供參考。

葛花；鳶尾苷；鳶尾苷元；提取工藝；正交試驗(yàn)

葛花是豆科植物葛根Pueraria lobata（Willd）Ohw i的干燥花蕾。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載葛花主要用于解酒醒脾，治傷酒發(fā)熱煩渴、不思飲食、嘔呃吐酸、吐血和腸風(fēng)下血等，是最具代表性的解酒藥物?，F(xiàn)代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，葛花中含有13種異黃酮［1］，鳶尾苷和鳶尾苷元為其主要成分［2］?？诜S尾苷經(jīng)腸道細(xì)菌作用轉(zhuǎn)化為鳶尾苷元而具有生物活性。鳶尾苷元具有保肝、降血糖、降血脂、抗炎、抗過敏和防治糖尿病并發(fā)癥等多種生物活性［3-6］。本實(shí)驗(yàn)采用乙醇回流提取的方法，在單因素考察基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)法優(yōu)選葛花異黃酮提取工藝，為其開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

葛花藥材：2012年6月下旬采于吉林省臨江市，取花蕾、花及其頂生20 cm以內(nèi)的莖葉，自然陰干后，粉碎至60目。鳶尾苷、鳶尾苷元對照品（實(shí)驗(yàn)室自制20050817、20051208，純度＞99.0%）。乙醇等化學(xué)試劑均為分析純，北京化工廠生產(chǎn)。水為重蒸水。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司），SHZD（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠），UV-3200S紫外可見分光光度儀（上海美譜達(dá)儀器有限公司），CP225D電子天平（德國賽多利斯股份公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 紫外分光光度法檢測葛花異黃酮

2.1.1 溶液的制備 對照品溶液：精密稱取鳶尾苷對照品4 mg，用70%乙醇定容于10 m l容量瓶中，搖勻，即得0.4 mg／m l鳶尾苷對照品儲備液。精密量取鳶尾苷對照品儲備液3 m l，用70%乙醇定容于50 m l容量瓶中，搖勻，得24μg／m l鳶尾苷對照品溶液。

供試品溶液：取干燥的葛花粗粉10 g，按照不同方法提取，冷卻后70%乙醇定容于200 m l量瓶中，搖勻。精密量取0.5 m l，用70%乙醇定容于10 m l容量瓶中，搖勻。再精密量取0.5 m l置于10 m l容量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確立 測定波長的選擇：取鳶尾苷對照品溶液3 m l，以70%乙醇為空白對照，在波長200～400 nm處進(jìn)行掃描，結(jié)果在264 nm處有最大吸收，因此將測定波長確定為264 nm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取鳶尾苷對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、5.0和10.0 m l，置于10 m l容量瓶中，加70%乙醇定容，在264 nm處測定吸光度。以對照品溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y＝0.081 8X＋0.015 2，r＝0.999 9，表明鳶尾苷在1.20～24.0μg／m l范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取鳶尾苷對照品溶液3 m l，加70%乙醇定容至10 m l。以70%乙醇為空白對照，在264 nm處連續(xù)測定5次，測得吸光度的相對偏差（RSD）為0.11%。表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、24 h，測定其吸光度。RSD＝0.46%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性考察 取同一次定容后提取液5份，按供試品溶液制備方法制備，依次測定吸光度。RSD＝1.87%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.1.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知異黃酮含量的葛花提取液9份，分別加入不同體積的鳶尾苷對照品溶液，加70%乙醇定容至10 m l，搖勻，以70%乙醇為空白對照，在264 nm處測定吸光度。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得總黃酮含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 HPLC法檢測葛花異黃酮 按照本實(shí)驗(yàn)室建立的方法［7］，色譜條件：美國Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流動相：甲醇-乙腈-水（2∶1∶2），流速1.0 m l／min；檢測波長264 nm，柱溫為室溫?；貧w方程分別為Y＝44 122X＋5 039.1和Y＝61 603X－6 210.4，r＝0.999 8和r＝0.999 9。鳶尾苷、鳶尾苷元分別在2.0～120.0μg／m l、0.8～80.0μg／m l范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求供試品溶液中的鳶尾苷和鳶尾苷元含量，將鳶尾苷按等摩爾濃度換算成苷元含量，計(jì)算總鳶尾苷元含量。即供試品中總鳶尾苷元含量（mg）＝鳶尾苷含量（mg）÷鳶尾苷相對分子質(zhì)量（462）×鳶尾苷元分子量（300）。對照品及供試品色譜圖見圖1。

圖1 對照品及供試品HPLC色譜圖

2.3 提取工藝優(yōu)選

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 提取次數(shù)的考察：精密稱定干燥葛花粗粉10 g，加入14倍量70%乙醇（V／W），回流提取3次，每次1 h。按供試品溶液制備項(xiàng)下操作，測定吸光度。結(jié)果第1次70%乙醇回流提取，可提取異黃酮總量的77.9%，第2次提取14.2%，第3次僅有7.8%。2次提取可達(dá)90%以上，因此正交試驗(yàn)設(shè)定為提取2次。

溶媒濃度的考察：取干燥葛花粗粉5份，每份10 g，精密稱定，分別加入14倍量50%、60%、70%、80%、90%乙醇，回流提取1次，每次提取時(shí)間1 h。按供試品溶液制備項(xiàng)下操作，測定吸光度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)從50%～70%乙醇提取異黃酮總量隨乙醇濃度的增加而增加，80%、90%乙醇提取量并未增加，得出70%乙醇的提取效果最好，因此選擇60%、70%、80%作為正交試驗(yàn)的考察因素，進(jìn)一步考察其對提取效果的影響。

提取時(shí)間的考察：取干燥葛花粗粉5份，每份10 g，精密稱定，加入14倍量70%乙醇，分別回流提取30、50、60、90、120 min。按供試品溶液制備項(xiàng)下操作，測定吸光度。結(jié)果顯示，從30～120 min提取量逐漸上升，因此選擇30、60、90和120min作為正交試驗(yàn)的考察因素，進(jìn)一步考察其對提取效果的影響。

溶媒用量的考察：取干燥葛花粗粉5份，每份10 g，精密稱定，分別加入8、12、14、16、20倍量70%乙醇，回流提取60 m in。按供試品溶液制備項(xiàng)下操作，測定吸光度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從8～14倍量溶煤提取異黃酮總量隨溶媒用量的增加逐漸上升，以14倍量提取效果最佳。但溶煤用量進(jìn)一步增加，提取量并未隨之增加，因此選擇10、12、14倍量作為正交試驗(yàn)的考察因素，進(jìn)一步考察對提取效果的影響。

2.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，選擇乙醇濃度（A）、提取時(shí)間（B）、溶媒用量（C）為考察因素，以HPLC法檢測鳶尾苷和鳶尾苷元含量為指標(biāo)，優(yōu)選回流提取工藝，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。因素水平見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 乙醇回流提取葛花異黃酮因素水平

根據(jù)極差R分析結(jié)果得知，對總黃酮提取率影響的主要因素順序?yàn)椋篈＞C＞B，即乙醇濃度＞溶媒用量＞提取時(shí)間，把D（空白）作為誤差列進(jìn)行分析。由表4方差分析結(jié)果可知，A因素對提取效果的影響有顯著意義（P＜0.05），而B因素和C因素在經(jīng)過單因素實(shí)驗(yàn)后，無顯著意義?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)過程中，減少溶媒用量有利于節(jié)約資源、降低成本。因此，A2B2C2可作為最佳提取工藝，即第1次加入12倍量70%乙醇提取90 min，第2次加入10倍量70%乙醇提取60 m in。

2.3.3 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為進(jìn)一步驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果，取葛花粗粉250 g，加入70%乙醇3 000 m l回流提取90 m in，濾過，收集濾液。殘?jiān)尤?0%乙醇2 500 m l回流提取60 min，濾過，收集濾液。合并兩次濾液，測定體積后按“2.1.1”項(xiàng)下操作，按上述色譜條件測定鳶尾苷和鳶尾苷元的含量，重復(fù)5次。結(jié)果見表5。結(jié)果表明，在最佳提取條件下提取的鳶尾苷和鳶尾苷元含量高且均較穩(wěn)定。

表5 最佳提取工藝驗(yàn)證

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選出葛花的最佳提取工藝為乙醇濃度、乙醇用量、提取時(shí)間。按最佳提取條件進(jìn)行5次平行的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，穩(wěn)定性較理想，適合于工業(yè)生產(chǎn)，且該工藝操作簡單，有效成分含量較高，提取工藝合理可行。

［1］ 尹俊亭，仲英，孫敬勇，等.葛花的研究進(jìn)展［J］.中草藥，2005；36（12）：1905-1906.

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Optim ized extraction technology of flos Puerariae lobata isoflavone using orthogonal test

WANG Jinfeng，ZHAO Nan，WEIYing，YANGCuiyan，WANG Fang，LIU Dan（No.208 Hospitalof PLA，Changchun 130062，China）

ObjectiveTo optimize the extraction technology of flos Puerariae lobata isoflavone.MethodsThe flos Puerariae lobata isoflavone was distilled by ethanol circum fluence.Total flavonoids，tectoridin and tectorigenin extracted from Puerariae using the UV and HPLC spectromertry methods were taken as evaluation indexes.Extraction technology was optimized w ith L9（34）orthogonal teston the baseof singleobservation of ethanol concentration，solvent dosageand distilling time.ResultsThe bestextraction technology of flos Puerariae lobata isoflavonewas：to add 12 times the amountof 70%ethanol for 90 minutes for the first time，and 10 times theamountof 70%ethanol for 60minutes for the second time.ConclusionThe optim ized extraction process of flos Puerariae lobata isoflavone is reasonable and feasible，and it can offer reference to actual production.

flos Puerariae lobata；tectoridin；tectorigenin；extract technology；orthogonal test

R284.2

A

1006-0111（2015）04-0338-04

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.04.013

2013-09-29

2014-04-15［本文編輯］李睿旻

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20090919，20130101 145JC）

王金鳳，主任醫(yī)師.研究方向：心血管疾病的新藥研發(fā).E-mail：13944927368＠139.com