張璐璐，苗 琦，葉招澆，李洪嬌，姜遠英，曹永兵（.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 004；.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州 5008；.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院口腔科，上海 004）

?論著?

不同制法納米銀的抗真菌活性研究

張璐璐1，苗 琦1，葉招澆2，李洪嬌3，姜遠英1，曹永兵1（1.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州 350108；3.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院口腔科，上海 200433）

目的探討不同制備方法得到的納米銀的體外抗真菌活性。方法 采用微量液基稀釋法測定納米銀對氟康唑不同敏感型白色念珠菌的最低抑菌濃度；棋盤實驗測定納米銀與氟康唑的協(xié)同抗真菌作用。結(jié)果 不同制備方法得到的納米銀對白色念珠菌的抑制作用不同，對敏感菌與耐藥菌的抑制作用無顯著差異，與氟康唑合用對白色念珠菌能產(chǎn)生協(xié)同作用。結(jié)論 不同制備方法得到的納米銀在體外的抗真菌作用有差異，但與氟康唑合用可產(chǎn)生協(xié)同作用。

納米銀；白色念珠菌；抑菌作用

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，銀有殺菌作用。很早以前人們就利用銀來加速傷口愈合、治愈感染、凈化水和保存食物、飲料等［1］。納米級的銀具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，在電學(xué)、光學(xué)和催化等諸多方面具有十分優(yōu)異的特性。在生物學(xué)方面，很高的比表面積使得納米銀粒子與微生物表面接觸的概率大大增加，抗菌性能遠大于傳統(tǒng)的銀系抗菌劑［2，3］。目前，已有納米銀應(yīng)用于燒傷創(chuàng)面的敷料［4］及軟襯材料的報道［5］。近年來，真菌感染率不斷上升，在深部真菌感染中，念珠菌是最常見的病原菌［6］。本研究以白色念珠菌為研究對象，探討不同制備方法得到的納米銀對白色念珠菌生長抑制作用的差異。

1 儀器與材料

1.1 儀器 THZ-82A臺式恒溫振蕩器（上海躍進醫(yī)療器械廠）；SW-CT-IF型單人雙面超凈化工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；XW-80A漩渦混合器（上海琪特分析儀器有限公司）；UV-2802型紫外可見光分光光度計（UNIC）；96孔細胞培養(yǎng)板（丹麥Nunclon公司）。

1.2 材料 納米銀；0.9%生理鹽水；AgNO3；AgCl；氟康唑（fluconazole）注射液（上海信誼金朱藥業(yè)有限公司）。

RPM I1640液體培養(yǎng)液：RPM I1640（GibcoBRL）10 g、NaHCO3 2 g、嗎啡啉丙磺酸（MOPS，Sigma公司）34.5 g（0.165 mol／L），加三蒸水900 m l溶解，用NaOH調(diào)pH值至7.0（25℃），三蒸水定容至1 000 m l，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

沙堡葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）：蛋白胨10 g、葡萄糖40 g、瓊脂18 g，加三蒸水900 m l溶解，加入2 mg／m l氯霉素水溶液50 m l，調(diào)整pH值至7.0，定容至1 000 m l，高壓滅菌，4℃保存。

YEPD培養(yǎng)液：酵母浸膏10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g，加三蒸水900 m l溶解，加入2 mg／m l氯霉素水溶液50 m l，三蒸水定容至1 000 m l，高壓滅菌（121℃，15 m in），于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

YEPD固體培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，加三蒸水900 m l溶解，加入2 mg／m l氯霉素水溶液50 m l，三蒸水定容至1 000m l，高壓滅菌（121℃，15min），趁熱將液體鋪于無菌的平皿（直徑9 cm）中，于4℃保存?zhèn)溆谩?.3 菌株 白色念珠菌（Candida albicans）SC5314由W illiam A Fonzi教授惠贈；白色念珠菌（Candida albicans）Y0109由第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院真菌室提供；白色念珠菌（Candida albicans）100、103由第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院真菌室提供，所有菌株均經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化學(xué)鑒定。

2 實驗方法

2.1 納米銀的制備 兩種方法分別命名為W法和D法，得到的納米銀溶膠分別命名為AgW和AgD。

W法［7］：稱取硝酸銀0.037 g加去離子水100 m l溶解，稱取檸檬酸三鈉0.26 g加去離子水26 m l溶解。取100 m l硝酸銀溶液與2.6 m l檸檬酸三鈉溶液混合，置于微波爐中以中高火加熱6 m in，得到灰綠色溶膠，冷卻至室溫，避光保存。

D法［8］：稱取90 mg硝酸銀溶于500 m l去離子水中加熱至沸騰，逐滴加入1%的檸檬酸鈉10 m l，保持沸騰，同時劇烈攪拌1 h，繼續(xù)攪拌至溶液冷卻，得到黃綠色的銀溶膠，冷卻后避光保存。

2.2 微量液基稀釋實驗

2.2.1 藥敏板的制備 將白色念珠菌SC5314、Y0109、103、100以1∶100接種至1 m l YEPD培養(yǎng)液，于30℃、200 r／m in培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)16 h，活化2次，使真菌處于指數(shù)生長期后期。用血細胞計數(shù)板計數(shù)，用RPM I1640培養(yǎng)液將菌液濃度調(diào)整至（1～5）×103cfu／m l。取無菌96孔板，于每排1號孔加RPM I1640液體培養(yǎng)基100μl作空白對照；3～12號孔各加新鮮配制的菌液100μl；2號孔分別加菌液和藥物溶液共200μl；12號孔不含藥物，只加菌液100μl作為陽性生長對照。2～11號孔進行倍比稀釋。

2.2.2 最低抑菌濃度（M IC）的判定 在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用酶標分析儀分別測定24 h和48 h各孔在630 nm波長處的消光度（OD值）。陽性對照孔的OD值控制在0.2左右，與陽性對照孔對比，以O(shè)D值下降80%以上的最低濃度孔中的藥物濃度為M IC80（真菌生長80%被抑制時的藥物濃度）。當藥物的M IC80值超過測定濃度范圍時，按以下方法進行統(tǒng)計：M IC80值高于最高濃度64μg／m l時，計為“＞64μg／m l”；M IC80值為最低濃度或在最低濃度以下時，均計為“≤0.125μg／m l”。上述實驗均平行操作3次。

2.3 棋盤式微量稀釋實驗

2.3.1 藥敏板的制備 合用的2種藥物于96孔板上以二維棋盤的縱（A～H）、橫（2～11）兩方向分別進行2倍的倍比稀釋。使得氟康唑的終濃度為16、8、4、2、1、0.5μg／m l（敏感菌）；0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 6、0.007 8、0.003 9μg／m l（耐藥菌），納米銀的終濃度為16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg／m l。實驗所用試劑、藥物、實驗操作步驟同上述體外藥敏實驗。

2.3.2 聯(lián)合用藥的效果評價 部分抑菌濃度指數(shù)（FICI）是評價聯(lián)合用藥的兩藥相互作用方式的主要參數(shù)。抑菌濃度分數(shù)（FIC），分別為每一種藥物聯(lián)合抑菌時所需M IC與單用時M IC的比值。而FICI則等于兩種藥物FIC之和，即FICI＝ΣFIC＝FICA＋FICB＝CA聯(lián)用／M ICA單用＋CB聯(lián)用／M ICB單用，M ICA和M ICB分別是藥物A和B單用時的M IC值，CA和CB為兩藥聯(lián)用時達到相同藥效時各自的濃度。當M IC值高于檢測最高限時，以最高限濃度的2倍值用以計算FICI。很多文獻報道，當FICI≤0.5時，兩藥的相互作用確定為協(xié)同作用，且FIC指數(shù)越小，協(xié)同作用越強；0.5＜FICI≤1時，兩藥的相互作用為相加；1＜FICI≤4時，為無關(guān)作用；當FICI＞4時，兩藥產(chǎn)生拮抗作用。

3 結(jié)果

3.1 納米銀顆粒的形態(tài)觀察

3.1.1 粒徑 兩種方法制備的納米銀溶膠經(jīng)上海材料研究所檢測中心檢測。AgW中納米銀顆粒的平均粒徑為105.8 nm，AgD中納米銀顆粒的平均粒徑為64.2 nm。

3.2 微量液基稀釋實驗 AgW對氟康唑敏感菌株白色念珠菌SC5314、Y0109于24、48 h的M IC80為0.25、4μg／m l，對氟康唑耐藥菌株白色念珠菌100、103于24、48 h的M IC80為1、4μg／m l；AgD對不同敏感性的菌株沒有抑制作用（表1）。納米銀對敏感型白色念珠菌的抑制作用弱于氟康唑，對耐藥菌則表現(xiàn)出較氟康唑更低的M IC80值。

3.3 棋盤式微量液基稀釋實驗 對氟康唑不同敏感性的菌株，AgW、AgD與氟康唑聯(lián)合使用均可產(chǎn)生協(xié)同作用。AgW與氟康唑聯(lián)用，兩者的M IC80值均有不同程度的下降，并且氟康唑的用量顯著下降。單用無抑菌作用的AgD在與氟康唑合用后，F(xiàn)IC＜0.5，表現(xiàn)出協(xié)同作用，且兩藥的用量均明顯減少（表2）。從單用的結(jié)果看，W法制備的納米銀其抑菌效果要遠優(yōu)于D法。與氟康唑合用后，D法制備的納米銀的用量明顯降低，可與氟康唑產(chǎn)生協(xié)同抗真菌的作用，但協(xié)同的用量仍高于W法制備的納米銀。綜上所述，W法制備的納米銀有更好的抗真菌作用。

表1 兩種納米銀溶膠對白色念珠菌不同菌株藥敏試驗的M IC80值（ρB／μg?m l－1）

表2 兩種納米銀溶膠與氟康唑合用對白色念珠菌的作用（ρB／μg?m l－1）

4 討論

納米銀的抗真菌機制復(fù)雜，主要包括銀的金屬離子作用和光催化作用。多數(shù)學(xué)者認為銀離子在納米銀的殺菌過程中發(fā)揮了不可忽視的作用。目前，已報道的機制主要包括銀離子與菌體中的酶蛋白巰基（-SH）結(jié)合，使一些以此為必要基團的酶失去活性，致使細胞喪失分裂增殖能力而死亡。Feng等［9］發(fā)現(xiàn)銀離子可與致病菌中的DNA堿基相結(jié)合形成交叉鏈接，進而置換嘌呤和嘧啶中與氮相鄰的氫鍵，使真菌的DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，喪失復(fù)制能力，導(dǎo)致致病菌失去增殖能力，從而達到殺滅真菌的作用。而Kim等［10］的觀點則認為納米銀與真菌表面的蛋白質(zhì)分子發(fā)生結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性，質(zhì)子泵裂解，膜蛋白或磷脂雙分子層的通透性增強，H＋容易外漏，導(dǎo)致真菌的細胞膜裂解而發(fā)揮殺菌作用。

本實驗結(jié)果表明，不同制備方法得到的納米銀對白色念珠菌的抑制作用不同，這種抑制作用在不同敏感性的白色念珠菌中沒有明顯差異。此外，納米銀的粒徑不同，抗菌效果也存在差異，根據(jù)本實驗結(jié)果，納米銀的粒徑越大，抗菌效果越好。目前，納米銀粒徑與抗菌效果的關(guān)系仍未見文獻報道，可作為今后研究的方向。

目前，抗真菌藥物種類有限，耐藥真菌的出現(xiàn)給臨床治療帶來更大的挑戰(zhàn)［11］。因此，低耐藥性、高安全性的納米材料在抗真菌藥領(lǐng)域值得進一步研究。

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Fungistasis of nanometer silvers synthesized by differentmethods on Candida albicans

ZHANG Lulu1，M IAO Qi1，YE Zhaojiao2，LIHongjiao3，JIANG Yuanying1，CAO Yongbing1（1.Schoolof Pharmacy，Second M ilitary Medical University，Shanghai 200433，China；2.School of Pharmacy，F(xiàn)uJian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350108，China；3.Department of Stomatology，Changhai Hospital A ffliated to Second M ilitary Medical University，Shanghai200433，China）

ObjectiveTo explore the in vitro fungistasis of nanometer silversmade by differentmethods on Candida albicans.MethodsThem inimal inhibitory concentrations（M ICs）of Candida albicans strains stimulated to silver nanoparticles were determ ined by m icrodilutionmethod.The combination effects of silver nanoparticles w ith fluconazole were determ ined by chess board check assay.ResultsThe inhabitation effect of two kinds of silver nanoparticles were different on the grow th of Candida albicans.Silver nanoparticles had a synergistic effect w ith fluconazole on Candida albicans.ConclusionThe two kinds of silver nanoparticles had various antifungal activities in vitro and had a synergistic effect w ith fluconazole on Candida albicans.

silver nanoparticles；Candida albicans；fungistasis

R978.5

A

1006-0111（2015）04-0328-04

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.04.010

2014-03-11

2015-01-14［本文編輯］李睿旻

張璐璐，碩士研究生.Tel：15000621731；E-mail：594361017＠qq.com

曹永兵，教授.研究方向：真菌耐藥，中藥抗腫瘤.Tel：13386270390