苑 旺，王美玲，石 巖，崔黎麗（第二軍醫(yī)大學 .藥學院無機化學教研室，.基礎部數(shù)理教研室，.海軍醫(yī)學系，上海 200433）

?論著?

季銨化殼聚糖胰島素納米粒的制備、處方優(yōu)化及其初步藥效學實驗

苑 旺a，王美玲b，石 巖c，崔黎麗a（第二軍醫(yī)大學 a.藥學院無機化學教研室，b.基礎部數(shù)理教研室，c.海軍醫(yī)學系，上海 200433）

目的采用正交設計試驗優(yōu)化載胰島素季銨化殼聚糖納米粒的處方工藝，并初步考察其降糖效果。方法 用離子交聯(lián)法制備載胰島素的季銨化殼聚糖納米粒，用正交試驗確定其最佳處方工藝。用透射電子顯微鏡觀察納米粒的表面形態(tài)；用粒徑／Zeta電位儀測定納米粒的粒徑和Zeta電位；用高效液相色譜（HPLC）法測定納米粒的包封率、載藥量及體外釋放情況。對糖尿病大鼠皮下注射給藥，對其藥效學進行初步考察。結果制得的納米粒呈球形，分布均勻；平均粒徑（63.26± 1.88）nm；Zeta電位（33.1±0.3）mV；包封率（37.92±2.11）%；載藥量（5.42±0.3）%；24 h累計釋放率63.83%。皮下注射給藥8 h，糖尿病大鼠血糖較單純注射胰島素組下降平緩，且藥效持久。結論優(yōu)化后的載胰島素的季銨化殼聚糖納米粒形態(tài)較好、粒徑較小，為研究胰島素的新型給藥途徑奠定了基礎。

胰島素；納米粒；離子交聯(lián)法；正交設計

糖尿病是常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)代謝疾病。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）公布的新版全球“糖尿病地圖”可以看出，隨著人們生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率逐年上升，糖尿病患者的治療費用給社會經(jīng)濟帶來巨大負擔，糖尿病并發(fā)癥對人類健康構成嚴重威脅［1］。我國已經(jīng)是世界上糖尿病患病人數(shù)最多的國家。

胰島素是一種具有降血糖作用的體內(nèi)激素［2］，注射胰島素是臨床上治療糖尿病的重要手段之一，但是長期注射胰島素會導致患者給藥部位產(chǎn)生炎癥，且常伴有低血糖等不良反應，給患者帶來痛苦。經(jīng)皮給藥系統(tǒng)是一種無創(chuàng)給藥方式，具有緩控釋等優(yōu)點，且皮膚內(nèi)酶的活性較低，是胰島素經(jīng)皮給藥的理想方式。但是，胰島素屬于大分子（分子量5 800）蛋白類藥物，很難自然透過皮膚致密的角質(zhì)層結構。因此，尋找一種合適的載體材料將胰島素包載于納米粒中，并與其他促滲方法結合，可以有效提高胰島素的經(jīng)皮吸收率。

殼聚糖是甲殼素脫乙酰基而得到的產(chǎn)物，是一種天然的聚陽離子多糖，具有黏膜吸附性、生物相容性、生物可降解性等特點，且已有報道殼聚糖具有促進藥物經(jīng)皮轉運的作用。但是，殼聚糖水溶性較差，限制了其廣泛應用，而季銨化殼聚糖較好地克服了殼聚糖的這一局限性，具有較好的水溶性，且保留了殼聚糖的優(yōu)點，是一種較好的載體材料。

本研究以胰島素為模型藥物，季銨化殼聚糖為載體材料，三聚磷酸鈉為交聯(lián)劑，采用離子交聯(lián)法制備載胰島素的季銨化殼聚糖納米粒（INS-NPs），對其進行處方優(yōu)化及表征。并初步考察其降血糖效果，為胰島素的經(jīng)皮給藥探尋新的思路和方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜（HPLC）儀（LC-2010A，日本島津公司）；C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm，迪馬公司）；FA2004B電子天平（上海精科天美科學儀器有限公司）；JB-3型定時恒溫磁力攪拌器（上海雷磁新涇儀器有限公司）；高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；DL-120超聲洗瓶器（浙江石浦海天電子儀器廠）；Zetasizer nano ZS粒徑／Zeta電位測定儀（英國MALVERN公司）；血糖儀（One Touch○R U tra EasyTM，美國強生公司）；JEM-1230透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）。

1.2 材料 羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖（南通綠神生物工程有限公司，取代度97.2%）；豬胰島素（徐州萬邦制藥有限公司）；鏈脲佐菌素（美國Sigma公司）；三聚磷酸鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、冰醋酸、磷酸、無水硫酸鈉（分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司）；乙腈、甲醇（高效液相純，均購自國藥集團化學試劑有限公司）；雄性SD大鼠（220±10）g（第二軍醫(yī)大學實驗動物中心）。

2 實驗方法

2.1 INS-NPs的制備［4］以季銨化殼聚糖為載體材料，胰島素為模型藥，三聚磷酸鈉為交聯(lián)劑，采用離子交聯(lián)法制備INS-NPs。分別配制一定濃度的季銨化殼聚糖醋酸溶液和一定濃度的三聚磷酸鈉水溶液。將一定量的季銨化殼聚糖溶液與一定量的胰島素溶液混合，磁力攪拌30 m in，滴加一定量的三聚磷酸鈉溶液，繼續(xù)攪拌30 min，即得。

2.2 INS-NPs的處方優(yōu)化 按照L9（34）正交設計表，3個因素分別為季銨化殼聚糖濃度（A）、三聚磷酸鈉濃度（B）、殼聚糖與三聚磷酸鈉體積比（V∶V）（C），研究它們對胰島素納米粒的粒徑和包封率的影響，各因素水平見表1。

表1 正交試驗的因素與水平

采用綜合評分法，粒徑和包封率權重系數(shù)均為0.5，以包封率最大值和粒徑最小值分別為100分對每一組數(shù)據(jù)進行綜合評分，應用統(tǒng)計分析軟件SPSS18.0對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析。

2.3 載藥納米粒的表征 按照最優(yōu)處方和工藝，平行制備3批載胰島素季銨化殼聚糖納米粒，對納米粒進行表征。

2.3.1 形態(tài)學考察 采用JEM-1230透射電子顯微鏡觀察納米粒的表面形態(tài)。

2.3.2 粒徑和電位 納米?；鞈乙航?jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后，使用馬爾文電位粒徑儀測定納米粒的粒徑和Zeta電位。

2.4 載藥納米粒中胰島素含量的測定

2.4.1 色譜條件 HPLC儀（島津LC-2010AHT），C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm，迪馬公司），流動相：0.2 mol／L無水硫酸鈉溶液（pH＝2.3）-乙腈（76∶24），檢測波長：214 nm，流速：1 m l／min，柱溫：30℃，進樣量：10μl。

2.4.2 胰島素標準曲線的繪制 精確配制500μg／m l胰島素溶液作為儲備液。分別精密吸取胰島素儲備液200、500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000μl于10 m l容量瓶中，用pH＝7.4的PBS緩沖液稀釋定容至刻度，即得系列濃度胰島素溶液。按照“2.4.1”色譜條件進樣，測定記錄胰島素峰面積，以胰島素峰面積為縱坐標，胰島素濃度為橫坐標，線性回歸，得到胰島素定量標準曲線。

2.4.3 包封率的測定 取新鮮制備的納米?；鞈乙? m l，高速離心機在轉速12 000 r／min條件下離心30 m in，以分離未包裹的胰島素，收集上清溶液。胰島素含量用HPLC法測定，計算納米粒包封率（entrapped efficiency，EE）和載藥量：

EE（%）＝（投入胰島素總量－上清液中游離胰島素量）／投入胰島素總量×100%

2.5 胰島素納米粒的體外釋放實驗 取新鮮制備的胰島素納米?；鞈乙海糜?7℃恒溫搖床中，以80 r／min速度振蕩，于0、1、2、4、6、8、10、12和24 h取出，離心，取上清液，用HPLC法測定釋放介質(zhì)中胰島素的含量，確定載胰島素季銨化殼聚糖納米粒的體外釋放曲線。

2.6 降血糖作用

2.6.1 糖尿病大鼠模型的建立 SD雄性大鼠，體重（220±10）g，腹腔注射鏈脲佐菌素溶液（60 mg／kg），1周后于大鼠尾靜脈采血，測定血糖含量，取連續(xù)2次測量血糖水平均≥18 mmol／L者，即為糖尿病大鼠模型。

2.6.2 實驗分組 隨機選取6只正常大鼠作為空白對照組（皮下注射PBS）。將“2.6.1”項下準備的糖尿病大鼠隨機分為3組：實驗對照組（皮下注射PBS）、胰島素溶液組（皮下注射胰島素）、納米粒組（皮下注射納米?；鞈乙海?，每組6只，分別于0.5、1.0、1.5、3.0、4.5、6.0和8.0 h尾靜脈采血，測定血糖含量。

3 實驗結果

3.1 INS-NPs的處方優(yōu)化 正交試驗結果見表2。評分規(guī)則采用參考文獻［5］進行評分。

表2 正交試驗結果（n＝3）

包封率：以9組試驗最高包封率（EEmax）組為100分，最低包封率（EEmin）組為0分，其余各組依下式計算得分：包封率評分＝100－100×（EEmax－包封率）／（EEmax－EEmin）。

粒徑：以9組試驗最大粒徑（Dmax）組為0分，最小粒徑（Dm in）組為100分，其余各組依下式計算得分：粒徑評分＝100×（粒徑－Dm in）／（Dmax－Dm in）。

由表3結果顯示，各因素作用大小依次為C＞A＞B。殼聚糖濃度（A）、三聚磷酸鈉濃度（B）、殼聚糖與三聚磷酸鈉體積比（V∶V）（C）對于胰島素納米粒的粒徑和包封率均有顯著影響（P＜0.05）。最終確定優(yōu)化水平組合為A2 B1 C2，即在殼聚糖濃度為5.0 mg／m l，三聚磷酸鈉濃度為0.5 mg／m l，兩者體積比為2∶1的條件下，制得的納米粒最佳。

表3 方差分析結果

3.2 納米粒的表征

3.2.1 形態(tài)學考察 采用透射電子顯微鏡觀察納米粒的表面形態(tài)。從圖1可以看出，納米粒呈球形，大小適中，分布均勻。

圖1 JEM-1230透射電鏡（×80 000）觀察納米粒形態(tài)

3.2.2 粒徑和電位 INS-NPs的平均粒徑為（63.26±1.88）nm，如圖2所示。Zeta電位（33.1±0.3）mV。

圖2 胰島素納米粒的粒徑分布

3.3 包封率的測定

3.3.1 標準曲線的繪制 按照“2.4.2”項下方法，以胰島素峰面積（A）為縱坐標，胰島素濃度（C）為橫坐標，得到回歸方程A＝10 856 C－32 686，r＝0.999 9，在10～150μg／m l的濃度區(qū)間內(nèi)，線性關系較好（圖3）。

圖3 胰島素定量的標準曲線

表4為胰島素定量檢測的日內(nèi)、日間精密度結果。結果顯示：日內(nèi)精密度RSD＜2%，日間精密度RSD＜2%，符合藥物分析日內(nèi)精密度RSD＜5%，日間精密度RSD＜15%的要求。

表4 胰島素檢測的日內(nèi)和日間精密度（n＝5）

3.3.2 包封率的測定 計算得到納米粒的包封率為（37.92±2.11）%，載藥量為（5.42±0.3）%。

3.4 胰島素納米粒的體外釋放實驗 由圖4可以看出，納米粒在前2 h釋放率達到44.15%，24 h累計釋放率63.83%。

圖4 胰島素納米粒的體外釋放曲線（n＝3）

3.5 降糖實驗 圖5為糖尿病大鼠血糖濃度隨時間變化曲線。結果顯示，皮下注射給藥后，實驗對照組（PBS）大鼠的血糖值隨著時間的推移變化不大，維持較高的血糖水平。胰島素溶液組給藥后，糖尿病大鼠血糖值迅速下降，并在1 h處出現(xiàn)極值，之后隨著時間的推移，血糖水平逐漸回升。皮下注射胰島素納米粒組給藥后，血糖值平緩下降，并隨著時間推移，血糖水平維持在穩(wěn)定水平。

圖5 血糖濃度隨時間的變化曲線

4 討論

經(jīng)皮給藥方式給慢性病患者及需要反復給藥的患者帶來了便利，可以有效降低給藥頻率、改善患者依從性、維持血漿藥物濃度穩(wěn)定、避免肝臟首過效應、提高藥物的生物利用度。因此，經(jīng)皮給藥是胰島素給藥的理想途徑。將胰島素包載于適當?shù)妮d體材料中制備成納米粒，可以有效改善經(jīng)皮吸收率低這一問題。納米粒具有包封率高、穩(wěn)定性強以及體內(nèi)特異性分布、緩控釋等特點。因此，我們選用季銨化殼聚糖作為載體材料，三聚磷酸鈉作為交聯(lián)劑，采用離子交聯(lián)法制備INS-NPs，并對其處方進行優(yōu)化，篩選出粒徑較小和包封率較高的納米粒，為胰島素的經(jīng)皮轉運奠定基礎。采用正交設計試驗和綜合評分法，篩選得到季銨化殼聚糖濃度5.0 mg／m l、三聚磷酸鈉濃度0.5 mg／m l、兩者體積比2∶1為最佳處方。按照最佳處方制備出的納米粒在體外釋放實驗中，2 h內(nèi)釋放率為44.12%，這可能是由于在納米粒的制備過程中，部分胰島素吸附在納米粒表面，當納米粒置于釋放介質(zhì)中時，胰島素迅速溶解于介質(zhì)中，因此產(chǎn)生突釋現(xiàn)象；24 h累計釋放率達63.83%，顯示納米粒對胰島素溶液具有持續(xù)保護作用?？疾炱渌幮W結果顯示，載胰島素納米粒可以很好地發(fā)揮降糖效果，與單純注射胰島素相比，顯示出更加溫和的藥性。

綜上所述，通過離子交聯(lián)法制備的載胰島素納米粒具有較小的粒徑，適合應用于經(jīng)皮轉運系統(tǒng)，且包封率較好，可有效發(fā)揮藥效。在降糖實驗中，糖尿病大鼠給藥后2 h血糖迅速下降，達到正常血糖水平，之后大鼠血糖緩慢下降，并且長時間維持在正常血糖水平范圍內(nèi)，INS-NPs顯示出較好的藥效性能。這與載藥納米粒的體外釋放度考察實驗結果相吻合，這可能是由于在納米粒制備過程中，部分胰島素吸附在納米粒表面，給藥后迅速釋放發(fā)揮藥效，使糖尿病大鼠的血糖較快降至正常水平，之后持續(xù)緩慢釋放，使血糖水平長時間穩(wěn)定在正常范圍。表明該法制備的納米粒性質(zhì)良好，可用于透皮吸收的研究，與其他促進藥物經(jīng)皮轉運的手段相結合，將有效促進胰島素經(jīng)皮轉運效率，這為胰島素等大分子藥物的經(jīng)皮轉運提出了新思路和新方法。

［1］ UnwinN，GanD，Whiting D.The ID Fdiabetesatlas：providingevidence，raisingawareness and promotingaction［J］.DiabetesResClinPract，2010，87（1）：2-3.

［2］ 韓麗娜，尹麗芳，趙月芳，等.胰島素／維生素B12-透明質(zhì)酸納米粒的制備及口服給藥體內(nèi)外性質(zhì)的評價［J］.中山大學學報，2012，33（5）：597-602.

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［5］ 曹 姍，胡凱莉，劉 梅，等.多西紫杉醇口服磷脂納米粒的制備與處方優(yōu)化［J］.中成藥，2013，35（9）：1896-1900.

Preparation，formulation optim ization and prelim inary pharmacodynam ic experiment of insulin-loaded N-trimethyl chitosan nanoparticles

YUANWanga，WANG Meilingb，SH IYanc，CUILilia（a.Department of Inorganic Chemistry，School of Pharmacy；b.Department of Physics and Mathematics，College of Basic Medical Sciences；c.College of Naval Medicine，Second M ilitary Medical University，Shanghai200433，China）

ObjectiveTo prepare and optim ize insulin-loaded N-trimethyl chitosan nanoparticles via orthogonal design，and prelim inarily study the effects on blood glucose level.MethodsThe insulin-loaded N-trimethyl chitosan nanoparticles（INS-NPs）were prepared by ionic gelation，and the optimal proportionwas obtained with orthogonal design.The nanoparticles were characterized by transmission electronmicroscopy and zeta／sizer nano analyzer.The entrapmentefficiency of insulin-loaded nanoparticles and the in vitro releasing characteristicswere studied by HPLC.A preliminary pharmacodynamic study of the insulin-loaded nanoparticles was also carried out.ResultsThe INS-NPs exhibited narrow distribution.Themean diameter of INS-NPswas（63.26±1.88）nm，while the entrapment efficiency was（37.92±2.11）%.After 8 hours of subcutaneous injection of the INS-NPs，the blood glucose level in diabetic rats decreased to normal level and kept stable.ConclusionThe optimized insulin-loaded nanoparticles had homogeneous spherical shape，small size，and could be a new approach of administration for insulin.

insulin；nanoparticles；ionic gelation；orthogonal design

R943.44；R977.15

A

1006-0111（2015）04-0319-05

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.04.008

2015-02-10

2015-06-02［本文編輯］顧文華

國家自然科學基金（No.51477175）

苑 旺，碩士研究生.E-mail：yuanwang1115＠126.com

崔黎麗，本科，教授，碩士生導師.研究方向：物理藥劑學.E-mail：cuilili39＠hotmail.com