黎 迎，朱春燕（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193）

?綜述?

細(xì)胞共培養(yǎng)模型在口服藥物吸收研究中的應(yīng)用

黎 迎，朱春燕（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193）

細(xì)胞共培養(yǎng)體系能很好地模擬人體小腸生理環(huán)境，準(zhǔn)確預(yù)測藥物在腸道內(nèi)的轉(zhuǎn)運和代謝情況，增強體外細(xì)胞模型與整體動物實驗研究之間的相關(guān)性，近年來在評價口服藥物吸收方面發(fā)揮著越發(fā)重要的作用，已成為新藥研發(fā)過程中評價藥物口服吸收的熱點。綜述體外模擬腸道環(huán)境的細(xì)胞共培養(yǎng)模型，并對其應(yīng)用于口服藥物研發(fā)的體外評價吸收做出展望。

細(xì)胞模型；共培養(yǎng)體系；口服藥物；胃腸道吸收；新藥篩選

口服給藥因其具有方便、安全、有效的特點，最容易為人們所接受。成功開發(fā)一個口服制劑的關(guān)鍵是要深入了解藥物的吸收特點，確定藥物的適宜吸收部位，考察影響藥物吸收的因素，從而選擇適宜的給藥系統(tǒng)以提高藥物的生物利用度。評價藥物口服吸收的方法包括：體外法（如細(xì)胞模型）、體內(nèi)法（如整體動物的藥動學(xué)）、在體法（如單向灌流）等。由于體內(nèi)或在體藥物胃腸道滲透性評價不僅成本高、耗時長，且有悖倫理，故體外細(xì)胞模型評價藥物的胃腸道吸收日益受到重視。

胃腸道內(nèi)環(huán)境比較復(fù)雜，小腸部位的上皮細(xì)胞由許多細(xì)胞組成，包括腸細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、潘納斯細(xì)胞、M細(xì)胞等；小腸中的胰液素、胰蛋白酶、脂酶、肽酶和麥芽糖酶等多種酶均影響藥物的口服吸收（圖1）。Caco-2和MDCK細(xì)胞模型是目前公認(rèn)的較好的體外吸收模型，但均存在一定缺陷，體內(nèi)外結(jié)果之間存在一定差異。建立體外細(xì)胞共培養(yǎng)體系，最大程度地模擬體內(nèi)小腸生理環(huán)境，彌補了單一細(xì)胞模型的不足。本文就細(xì)胞共培養(yǎng)體系及其在口服藥物吸收中的應(yīng)用進行綜述。

1 分泌黏液的胃腸道細(xì)胞模型

HT29細(xì)胞為人類腺癌細(xì)胞系，在甲氨蝶呤（M TX）誘導(dǎo)下可分化為成熟的杯狀細(xì)胞，可以分泌黏液，缺點是單層細(xì)胞跨膜電阻（TEER）值過低，且不表達P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp），將Caco-2細(xì)胞與HT29細(xì)胞系共培養(yǎng)可以克服上述不足，較好地模擬體內(nèi)黏液層情況，適于研究生物黏附制劑或大分子藥物的轉(zhuǎn)運。

有些HT29細(xì)胞亞系形成多層細(xì)胞，只有上層細(xì)胞分化為杯狀分泌細(xì)胞，而HT29-D1和HT29-E12細(xì)胞亞系均為M TX轉(zhuǎn)染，能夠全部轉(zhuǎn)化為杯狀分泌細(xì)胞，在Caco-2細(xì)胞上形成均一的黏液層，可以通過阿爾藍(lán)染色法判定共培養(yǎng)細(xì)胞是否分泌黏液質(zhì)［2］。Behrens等［3］報道HT29-D1分泌黏液層厚度為（53±52）μm，HT29-M TX-E12分泌黏液層的厚度為（142±51）μm，可以用于模擬胃腸道的不同片段。Caco-2／HT29-M TX細(xì)胞模型的不足是對以主動轉(zhuǎn)運為主的藥物能產(chǎn)生負(fù)結(jié)果［4］。

1.1 評價藥物胃腸道吸收機制 Caco-2／HT29共培養(yǎng)模型可以更好地模擬胃腸道內(nèi)黏液情況，因此能更準(zhǔn)確地評價那些依賴胃腸道黏液吸收的藥物經(jīng)胃腸道吸收情況。Woitiski等［5］將胰島素制成納米粒，其在Caco-2細(xì)胞上的滲透性是胰島素原藥的2.1倍，在Caco-2／HT29細(xì)胞模型上的滲透性是原藥的3.7倍，而離體小腸吸收實驗證明是原藥的3.9倍，Caco-2／HT29和動物模型證明，胃腸道黏液層對難溶性藥物的納米制劑的吸收起著重要作用。有些研究者［6-8］通過建立Caco-2／HT29-MTX共同培養(yǎng)的細(xì)胞模型用于預(yù)測化學(xué)元素的口服吸收，發(fā)現(xiàn)胃腸道黏液層在胃腸道吸收過程中起重要作用，是一種很有價值的體外評價模型。

1.2 評價藥物胃腸道吸收的影響因素 Caco-2／

HT29-MTX共同培養(yǎng)的細(xì)胞模型用于研究藥物在胃腸道吸收的影響因素，比如藥物、食物或制劑輔料等。Sam等［9］以膜分泌型腸細(xì)胞模型HT29-MTXE12研究蜂毒肽作為吸收促進劑促進胃腸道吸收的可能機制和細(xì)胞毒性。Maresca等［10］用HT29細(xì)胞模型研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的脫氧瓜蔞鐮菌醇能有選擇性地調(diào)節(jié)腸道轉(zhuǎn)運蛋白的活性，從而影響各種營養(yǎng)素（如糖類、氨基酸和脂類）的吸收。

1.3 評價細(xì)菌胃腸道轉(zhuǎn)運及抗菌藥物應(yīng)用 有些細(xì)菌對胃腸道的侵襲依賴于黏液，因此Caco-2／ HT29共培養(yǎng)體系可用于抗菌藥物的研發(fā)。Gagnon等［11］研究并比較沙門菌對Caco-2細(xì)胞、HT-29細(xì)胞和HT29-M TX細(xì)胞的黏附性和侵襲性，由于沙門菌對小腸上皮細(xì)胞的侵襲性主要依賴于黏蛋白，因此HT29-M TX細(xì)胞更適合作為體外細(xì)胞模型評價沙門菌的小腸細(xì)胞黏附性和侵襲性，從而更好地評價抗菌藥物在胃腸道的作用。

2 M細(xì)胞模型

M細(xì)胞是腸道黏膜濾泡相關(guān)上皮細(xì)胞內(nèi)一種特殊的抗原攝取細(xì)胞，主要存在于有囊泡的上皮組織中，在腸道中M細(xì)胞與腸上皮細(xì)胞緊密排列，共同形成天然的上皮屏障。與正常的腸上皮細(xì)胞相比，M細(xì)胞具有高內(nèi)吞和低降解的特征；與Caco-2細(xì)胞相比，M細(xì)胞的TEER值小，堿性磷酸酶的活性降低了15%～36%，聚苯乙烯和白蛋白微粒在M細(xì)胞上的滲透性明顯增高［12］。生物大分子、納米顆粒、微生物等物質(zhì)可以經(jīng)M細(xì)胞跨腸上皮轉(zhuǎn)運［13］，M細(xì)胞介導(dǎo)的跨上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運可分為3個階段：腸腔內(nèi)物質(zhì)首先被吸附于細(xì)胞頂膜，然后通過內(nèi)吞囊泡被轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)內(nèi)涵體，最后從基底膜經(jīng)胞吐作用出胞，且呈溫度依賴性［13，14］。

Gullberg等［15］建立了Caco-2／Raji B細(xì)胞共培養(yǎng)模型，誘導(dǎo)分化出形態(tài)及功能特征與M細(xì)胞極其類似的M樣細(xì)胞，如圖2A所示。des Rieux等［16］對上述方法進行了優(yōu)化，該方法Raji B細(xì)胞與Caco-2細(xì)胞通過聚碳酸酯膜密切接觸，促進了M樣細(xì)胞的分化，如圖2B所示?？梢岳妹庖呓M織化學(xué)法檢測M樣細(xì)胞表層，若出現(xiàn)β1和α5β1整合蛋白的表達，即可證明M樣細(xì)胞的形成［17］。另外，Pielage等［18］利用DNA微陣列分析并比較M樣細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞基因表達水平的差別，發(fā)現(xiàn)凝集素-9可以作為M細(xì)胞表面標(biāo)記物。

2.1 評價藥物胃腸道吸收機制 M細(xì)胞可以用來研究一些生物大分子及納米粒子等在胃腸道的轉(zhuǎn)運情況。des Rieux等［16］用M細(xì)胞研究聚苯乙烯羧酸納米粒（粒徑為200 nm）的轉(zhuǎn)運機制，分別加入乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸和吞飲抑制劑時發(fā)現(xiàn)，前者對納米粒的轉(zhuǎn)運無影響，后者能限制其轉(zhuǎn)運，且具有能量和溫度依賴性，說明聚苯乙烯羧酸納米粒在M細(xì)胞上是通過細(xì)胞吞噬作用被攝取，而不是經(jīng)細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運。Kadiyala等［19］對殼聚糖-DNA納米粒在人小腸M樣細(xì)胞模型和正常腸細(xì)胞模型上的轉(zhuǎn)運進行了比較，發(fā)現(xiàn)納米粒在M樣細(xì)胞上的轉(zhuǎn)運速率是Caco-2細(xì)胞的5倍。

圖2 M樣細(xì)胞模型培養(yǎng)過程

2.2 評價細(xì)菌胃腸道轉(zhuǎn)運及抗菌藥物應(yīng)用 有些細(xì)菌經(jīng)M細(xì)胞在胃腸道內(nèi)轉(zhuǎn)運，可以通過M細(xì)胞評價細(xì)菌轉(zhuǎn)運情況，可為抗菌藥物的合理應(yīng)用提供參考。Tonry等［20］研究炭疽桿菌及其孢子經(jīng)M細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)運情況，發(fā)現(xiàn)炭疽桿菌孢子更容易經(jīng)M細(xì)胞轉(zhuǎn)運，為炭疽桿菌發(fā)病機制提供參考，從而更準(zhǔn)確地指導(dǎo)抗菌藥物的應(yīng)用。

2.3 Caco-2／HT29／Raji B細(xì)胞共培養(yǎng)模型 Caco-2、HT29和Raji B這3種細(xì)胞共培養(yǎng)時，能同時模擬腸上皮細(xì)胞、黏液分泌細(xì)胞和M細(xì)胞，可考察不同藥物的多種吸收機制。Antunes等［21］采用Caco-2／HT29-M TX／Raji B細(xì)胞共培養(yǎng)模型，研究胰島素溶液及其納米粒的體外滲透情況，新建立的模型能更準(zhǔn)確地模擬體內(nèi)胃腸道環(huán)境。A raújo等［22］建立了Caco-2／HT29-M TX／Raji B細(xì)胞共培養(yǎng)模型，并篩選了Caco-2和HT29-M TX細(xì)胞共培養(yǎng)的比例，當(dāng)兩者比例為90∶10時，共培養(yǎng)細(xì)胞模型具有更好的生理學(xué)特性。

3 表達酶及轉(zhuǎn)運體胃腸道細(xì)胞模型

藥物單種細(xì)胞模型中，CYP酶和其他轉(zhuǎn)運蛋白的表達低于小腸上皮細(xì)胞。一些研究者［23-25］用細(xì)胞系轉(zhuǎn)染一些轉(zhuǎn)運體，比如人氨基酸轉(zhuǎn)運體，還有一些外排轉(zhuǎn)運體，例如MDR1，這些修飾的細(xì)胞系在載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運的體外滲透模型中具有可預(yù)見性。

有的研究者［26，27］以CYP3A4轉(zhuǎn)染的Caco-2細(xì)胞為模型，用于評價藥物的吸收和代謝情況；有的研究者［28-31］利用MDCK-MDR1細(xì)胞模型研究P-gp對藥物胃腸道吸收的影響，能有效評價P-gp底物的藥物胃腸道吸收情況；而有的研究者［32］則建立了同時表達胃腸道細(xì)胞色素酶和外排蛋白的細(xì)胞模型，即利用MDCK轉(zhuǎn)染MDR1或MRP2形成單轉(zhuǎn)染模型，并同時轉(zhuǎn)染MDR1或MRP2和CYP3A4形成雙轉(zhuǎn)染模型，用于研究藥物胃腸道的代謝與轉(zhuǎn)運，并可用于研究CYP3A4和P-gp對藥物吸收的影響。

4 炎癥病變胃腸道細(xì)胞模型

由于沒有合適的體外細(xì)胞模型模擬炎癥狀態(tài)的胃腸道屏障，治療炎癥的藥物評價通常采用動物模型，建立有效模擬炎癥狀態(tài)胃腸道的體外細(xì)胞模型對于研發(fā)治療胃腸道炎癥藥物及其制劑具有重要的現(xiàn)實意義。

Schmohl等［33］建立了體外Caco-2上皮細(xì)胞和人類全血的共培養(yǎng)體系，他們建立的免疫系統(tǒng)可以用來研究抗炎藥物的胃腸道吸收和模擬免疫調(diào)節(jié)處理過程。有人［34，35］建立IEC-巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)模型，主要用于體外評價治療炎癥性腸病藥物的胃腸道吸收。Leonard等［36］建立了人胃腸道上皮細(xì)胞系-巨噬細(xì)胞-樹枝狀細(xì)胞系共培養(yǎng)細(xì)胞模型，此模型不僅可以用來模擬炎癥性腸病的狀態(tài)，還可以研究外源性物質(zhì)與炎癥狀態(tài)的上皮細(xì)胞之間的相互作用。

5 其他

陳曉清等［37］構(gòu)建了Caco-2細(xì)胞與乳雙歧桿菌、植物乳酸桿菌、大腸桿菌和糞腸球菌組成的混合菌群體外共培養(yǎng)體系，用于評價食源性抗菌藥及其耐藥菌作用于腸道菌群時對人體健康造成的危害。Le Hégarat等［38］將Caco-2細(xì)胞系在Transwell板上培養(yǎng)21 d分化成熟后，將類淋巴母細(xì)胞TK6細(xì)胞系加入BL層，AP層加入致突變化合物［如苯并［α］-苾（BαP）］，在Caco-2細(xì)胞代謝轉(zhuǎn)運后靶向于TK6細(xì)胞，然后檢測轉(zhuǎn)運后代謝物對Caco-2及TK6細(xì)胞的基因毒性，結(jié)果BαP對Caco-2細(xì)胞具有基因毒性，但對TK6細(xì)胞無毒性。因為其代謝物不能從AP側(cè)轉(zhuǎn)移至BL側(cè)，說明胃腸道上皮細(xì)胞能阻止類似基因毒性藥物的損害，同時胃腸道的首過效應(yīng)也會降低藥物的生物利用度。

6 展望

與體內(nèi)評價相比，體外評價藥物胃腸道吸收的方法既便宜又方便，細(xì)胞模型已經(jīng)是制藥企業(yè)藥物研發(fā)中最經(jīng)濟的評價藥物胃腸道吸收的方法。體外細(xì)胞模型能否成功評價藥物經(jīng)胃腸道的吸收情況，取決于其與體內(nèi)胃腸道特征的相似性。為了能夠建立更類似于體內(nèi)環(huán)境的培養(yǎng)體系，應(yīng)使體外環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境相吻合，從而使細(xì)胞間能相互溝通信息，相互支撐生長和增殖。根據(jù)藥物的性質(zhì)挑選合適的細(xì)胞共培養(yǎng)模型，有效評價多因素影響過程，比如代謝作用或者免疫反應(yīng)，旨在增加結(jié)論的準(zhǔn)確性，擴大其應(yīng)用范圍和評價效率。

目前，細(xì)胞共培養(yǎng)在技術(shù)和應(yīng)用方面有以下幾點尚待加強：①共培養(yǎng)體系的培養(yǎng)條件仍不成熟，重復(fù)性較差，需要進一步優(yōu)化和統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，以保證實驗室之間結(jié)果的重現(xiàn)性。②人體胃腸道含有多種細(xì)胞，細(xì)胞之間相互作用復(fù)雜，并不能完全反應(yīng)體內(nèi)情況，需要加強體外細(xì)胞模型評價和體內(nèi)評價結(jié)果的相關(guān)性研究，建立準(zhǔn)確且完整的藥物結(jié)構(gòu)-細(xì)胞滲透性-體內(nèi)吸收三者之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，以實現(xiàn)藥物口服吸收體外細(xì)胞模型評價方法代替體內(nèi)評價方法的目標(biāo)。③細(xì)胞共培養(yǎng)需向微型化（如384孔板或1 536孔板）、智能化和自動化方向發(fā)展，實現(xiàn)新藥及其制劑的快速篩選及評價。相信隨著基因蛋白水平研究和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，用于評價藥物胃腸道吸收的細(xì)胞模型將進一步完善，將為建立更加快捷準(zhǔn)確的藥物口服吸收評價方法開拓廣闊的前景。

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Application of cell co-culturemodels in absorption of oral drug

LIYing，ZHU Chunyan（Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193，China）

Cell co-culture system can better simulate the inner environment of human body，predict drug transport and metabolism in intestinal environment and increase the relation between in vitro cellmodel and integral animal test.In recent years，co-culture cellmodel plays an increasingly important role in evaluating the absorption of oral drugs，which becomes the highlight in the evaluation of drug oral absorption during new drug discovery.This essay summarized co-culture cellmodel which simulates intestinal environment and their application，and looked into the future of their application in evaluating oral drug intestinal absorption during oral drug discovery.

cellmodel；co-culture system；oral drug；intestinal absorption；new drug screening

R945

A

1006-0111（2015）04-0289-05

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.04.001

2014-09-21

2015-03-05［本文編輯］李睿旻

國家自然科學(xué)基金面上項目（81274094）；協(xié)和研究生創(chuàng)新基金項目（10023-1007-1017）

黎 迎，博士研究生.研究方向：口服新型給藥系統(tǒng).Tel：（010）57833263；E-mail：lysole＠126.com

朱春燕，研究員，博士生導(dǎo)師.研究方向：新型給藥系統(tǒng).Tel：（010）57833276