梁 磊，馬 暢，劉 捷，董 敏，方 天，胡文娟，陳 莉，賈春梅，惲?xí)r鋒

（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科，全軍實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科普與倫理教育基地，全國科普教育基地，南京 210002）

制動(dòng)致福利損傷大鼠肝細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)

梁 磊，馬 暢，劉 捷，董 敏，方 天，胡文娟，陳 莉，賈春梅，惲?xí)r鋒

（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科，全軍實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科普與倫理教育基地，全國科普教育基地，南京 210002）

目的研究制動(dòng)導(dǎo)致的福利損傷大鼠肝細(xì)胞內(nèi)NF-κB的表達(dá)變化。方法選取±170g SD大鼠，雌雄各半，使用制動(dòng)的方式造成其福利損傷，記錄實(shí)驗(yàn)過程中的體增重和飼料消耗，而后分別使用實(shí)時(shí)定量PCR和免疫印跡法檢測(cè)大鼠肝細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65的mRNA量和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與對(duì)照組相比，制動(dòng)組大鼠的體增重和飼料能耗比均降低，且差異極顯著（P＜0.01）；肝細(xì)胞中NF-κB p65的mRNA量和蛋白表達(dá)水平均大幅提升，同樣差異極顯著（P＜0.01）。其中制動(dòng)組雄性大鼠的NF-κB p65的mRNA量和蛋白表達(dá)水平顯著高于雌性（P＜0.05），但對(duì)照組大鼠的雄性與雌性之間未表現(xiàn)出差異（P＞0.05）。結(jié)論大鼠福利受損時(shí)，肝細(xì)胞中NF-κB表達(dá)水平大幅提升，提示兩者之間存在一定關(guān)聯(lián)，表明NF-κB參與了大鼠福利損傷過程。

福利損傷；NF-κB；基因表達(dá)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中的一個(gè)重要問題，因?yàn)楦＠軗p的動(dòng)物達(dá)不到“康樂”狀態(tài)［1］，不是標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。其生存質(zhì)量下降，機(jī)體各系統(tǒng)狀態(tài)紊亂，會(huì)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的進(jìn)行造成影響，降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性［2］。但對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利水平的評(píng)估尚缺乏直接的、具代表性的指標(biāo)。NF-κB（nuclear factor-kappaB，核因子-κB）是一類廣泛存在于哺乳動(dòng)物的各種組織和細(xì)胞中的調(diào)控因子，在介導(dǎo)機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)尤其是炎性反應(yīng)的過程中起關(guān)鍵作用，多種因素―應(yīng)激、毒素、感染、LPS、TNF-α、放射性物質(zhì)等―均可刺激其活化，使其表達(dá)水平上調(diào)［3-4］。而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的各類干預(yù)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來說都是應(yīng)激刺激，符合NF-κB的活化條件。因此，本研究使用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常用的SD大鼠，通過束縛制動(dòng)以降低其福利水平［5］，觀測(cè)其肝組織中NF-κB表達(dá)水平的變化，探尋實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與NF-κB之間的聯(lián)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼育環(huán)境

SD大鼠32只，雌雄各半，體重±170g，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供【SCXK（軍）2012-0014】，實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所為南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科屏障環(huán)境【SYXK（軍）2012-0047】。Co60滅菌全價(jià)飼料與高溫高壓滅菌飲用水，自由采食。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與福利損傷模型建立

SD大鼠隨機(jī)挑選并分組如下（n=8）：

對(duì)照組雄（control male，CM）：雄性SD大鼠，正常飼養(yǎng)。

制動(dòng)組雄（restrain male，RM）：雄性SD大鼠，每日9：00～10：00、15：00～16：00各使用圓筒形容器束縛制動(dòng)1h，制動(dòng)程度為大鼠不感覺壓迫但無法自由活動(dòng)，干預(yù)時(shí)間為4周。

制動(dòng)組雌（restrain female，RF）：雌性SD大鼠，干預(yù)過程同RM組。

1.3 試劑及儀器

反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，#RR047A），PCR儀（MJ research，PTC 200），熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)（Roche LightCyclery 96）；一抗10745-1-AP p65 antibody（Proteintech），二抗山羊抗兔-HRP（santa cruze），Protein Marker（Takara），Acr、Bis、Tris（Sigma），TEMED、Gel Doc2000成像系統(tǒng)、垂直電泳系統(tǒng)（BIO-RAD）。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 實(shí)驗(yàn)過程中記錄各組大鼠體重變化及進(jìn)食量，實(shí)驗(yàn)結(jié)束計(jì)算體增重和飼料能效比：

體增重=實(shí)驗(yàn)結(jié)束體重-初始體重

The stability simulation and evaluation about massive karst cavern of Zhushabao tunnel on

飼料能效比（food efficiency ratio，F(xiàn)ER）=體增重/總進(jìn)食量×100％

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NF-κB p65 mRNA含量

取大鼠肝臟組織，充分裂解后按Trizol操作說明提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄體系為20μL，每管加入總RNA4μg，按照TaKaRa#RR047A反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作，37℃反應(yīng)1h，70℃15min。反轉(zhuǎn)錄后的cDNA用于實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，引物由南京申興醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司合成，p65上游引物5′-TCACCAAA GACCCACCTCACCG-3′，下游引物5′-GGACCGCA TTCAAGTCATA GTCCC-3′，擴(kuò)增片段長度243bp，退火溫度60℃；GAPDH上游引物5′-ATCATCTCCG CCCCTTCTGC-3′，下游引物5′-GCCTGCTTCACCA CCTTCTT-3′，擴(kuò)增片段長度437bp，退火溫度57℃。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq II（2×）10μL，cDNA2μL，上、下游引物各1μL（10μmol/L），加入Nuclease-Free Water至20μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min，（95℃10s，60℃60s）×40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品3次重復(fù)。將對(duì)照組雄性大鼠基因表達(dá)水平定為1，分析其他組別的基因表達(dá)差異。

1.4.3 Western blot檢測(cè)NF-κB p65蛋白表達(dá)

取肝臟組織，裂解細(xì)胞提取總蛋白。10％SDSPAGE凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5％脫脂牛奶封閉，一抗4℃過夜，二抗37℃反應(yīng)1h，洗膜ECL顯影。以GAPDH為內(nèi)參照，每組樣本進(jìn)行3次重復(fù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 體增重與飼料能效比較

如表1所示，制動(dòng)組大鼠無論雌雄其體增重?cái)?shù)據(jù)均遠(yuǎn)低于同性別對(duì)照組大鼠，且差異極其顯著（P＜0.01）；制動(dòng)組大鼠的飼料能效（food efficiency ratio，F(xiàn)ER）數(shù)據(jù)也與同性別的對(duì)照組大鼠有較大差距，其中雄性制動(dòng)組大鼠FER數(shù)據(jù)差異顯著（P＜0.05）。

2.2 基因表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR目的基因NF-κB p65和內(nèi)參GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，引物擴(kuò)增效率為99.8％。結(jié)果如圖1所示，無論雌雄，制動(dòng)組大鼠的該基因表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組。數(shù)據(jù)分析表明，與對(duì)照組大鼠相比，制動(dòng)組大鼠的該基因表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。但制動(dòng)組不同性別大鼠之間表達(dá)量也存在顯著差異（P＜0.01），對(duì)照組不同性別大鼠之間未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 各組大鼠體增重與飼料能效比Tab.1 Body weight gain and food efficiency ratio of different groups

注：**表明與同性別對(duì)照組比較，P＜0.01；##表明與同組別雄性相比，P＜0.01（n=8）。圖1 各組大鼠肝細(xì)胞NF-κB p65基因表達(dá)Note：**means compare with control group，P＜0.01；##means compare with male，P＜0.01（n=8）.Fig.1 Gene expression of NF-κB p65 in liver of different groups

2.3 蛋白表達(dá)

圖2 各組大鼠肝細(xì)胞NF-κB p65蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of NF-κB p65 in liver of different groups

Western Bolt結(jié)果如圖2所示，制動(dòng)組大鼠肝細(xì)胞中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組大鼠。表2將各組大鼠蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，表明制動(dòng)組大鼠蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組大鼠（P＜0.01）。同組別雄性大鼠的相對(duì)表達(dá)量均高于雌性大鼠，其中制動(dòng)組的差異顯著（P＜0.05），但對(duì)照組的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠肝細(xì)胞NF-κB p65表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.2 The statistical results of NF-κB p65 expression in liver of different groups

3 討論

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的各種處理因素對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成的身心創(chuàng)傷及其累積效應(yīng)是主要的福利損害［6］，本實(shí)驗(yàn)中正是使用反復(fù)制動(dòng)來模擬正常實(shí)驗(yàn)過程中的抓取與保定過程，以試圖對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利造成損害。制動(dòng)術(shù)目前廣泛應(yīng)用于身心壓力引發(fā)各類動(dòng)物損害的實(shí)驗(yàn)研究中［5］，是一種較為常用的輕度福利損害手段。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)，制動(dòng)組大鼠的體增重和飼料能耗均顯著低于對(duì)照組大鼠，可以認(rèn)為制動(dòng)組大鼠已經(jīng)福利受損。

NF-κB是1986年Sen和Baltimore［7］在B淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一類能和免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強(qiáng)子特異結(jié)合的核因子，廣泛存在于各種真核細(xì)胞中。它由兩類Rel家族亞基組成，活性DNA結(jié)合形式是兩類亞基的同源或異源二聚體，其中以P50和P65組成的二聚體最為常見［8］。當(dāng)受到如應(yīng)激等細(xì)胞外信號(hào)的刺激時(shí)，經(jīng)過一系列連鎖的酶促反應(yīng)，IκB（核因子-κB抑制蛋白）從NF-κB三聚體上解離下來，從而使NF-κB二聚體活化、入核，啟動(dòng)特異靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)［9-11］。它在調(diào)控炎性因子、細(xì)胞因子、粘附分子等的表達(dá)，免疫應(yīng)答及細(xì)胞增殖、分化、凋亡的過程中均起關(guān)鍵作用［12-13］。其中經(jīng)NF-κB介導(dǎo)調(diào)控的多種因子如TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6均可促進(jìn)機(jī)體的炎性反應(yīng)，產(chǎn)生機(jī)體損傷。通常情況下，當(dāng)福利水平下降時(shí)動(dòng)物往往表現(xiàn)出毛色不順、食欲下降、免疫抑制、代謝及內(nèi)分泌紊亂等一系列問題，本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組大鼠NF-κB僅輕微表達(dá)，但制動(dòng)組大鼠經(jīng)制動(dòng)處理后福利受損，NF-κB表達(dá)水平顯著上調(diào)，其中制動(dòng)組雄性大鼠的基因表達(dá)量甚至到達(dá)了相應(yīng)對(duì)照組大鼠的近14倍之多，表明了NF-κB極有可能在這一系列過程中產(chǎn)生了作用，即NF-κB參與了福利損傷及其導(dǎo)致的機(jī)體內(nèi)功能紊亂過程。

對(duì)多種動(dòng)物的觀察和研究表明，動(dòng)物的福利水平表現(xiàn)為動(dòng)物在適應(yīng)環(huán)境改變過程中付出的生物學(xué)代價(jià)，評(píng)價(jià)這一生物學(xué)代價(jià)必須綜合考慮動(dòng)物外觀、行為模式、生長發(fā)育水平、特異性和非特異性免疫力、神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)以及器官組織病理等多個(gè)指標(biāo)的變化［14］。因此，我們?cè)谠u(píng)估動(dòng)物福利水平變化時(shí)大都要綜合分析行為學(xué)、生長發(fā)育、免疫及神經(jīng)內(nèi)分泌等多方面指標(biāo)。但這些指標(biāo)已經(jīng)是福利水平降低所引發(fā)的一系列復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)、調(diào)控的終末表現(xiàn)，當(dāng)我們觀察到這些指標(biāo)時(shí)就表明福利損害已經(jīng)發(fā)生，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的福利水平已經(jīng)受到了影響。NF-κB是一種廣泛存在于組織和細(xì)胞中，能介導(dǎo)機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子，在機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)過程中發(fā)揮重要的作用，而本研究所探討的福利損傷其本質(zhì)是實(shí)驗(yàn)因素的身心壓力累積而對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物形成的一個(gè)慢性應(yīng)激過程，引發(fā)福利損傷的因素恰屬于NF-κB的激活因素。并且NF-κB是一種上游調(diào)控因子，相對(duì)于能較早的提示福利損傷的發(fā)生。

根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們認(rèn)為NF-κB有可能作為一個(gè)具代表性的福利衡量指標(biāo)，用以評(píng)估實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利損害，但通過本次實(shí)驗(yàn)我們也發(fā)現(xiàn)了若干問題。首先，制動(dòng)組雄性大鼠的NF-κB水平不但顯著高于對(duì)照組，同時(shí)與同組的雌性大鼠也存在統(tǒng)計(jì)差異。經(jīng)我們研究發(fā)現(xiàn)，其原因可能有2個(gè)方面：一是由于雌性大鼠生長速度低于雄性，相對(duì)于束縛容器而言體型較小，導(dǎo)致其束縛效果不如雄性大鼠，從而導(dǎo)致了表達(dá)水平的差異；二是由于性別差異，杜曉輝等［15］的研究表明，性別差異對(duì)膿毒癥大鼠肝臟NF-κB活化具有影響，雌性大鼠的NF-κB、TNF-α及ALT的變化均顯著低于雄性。自然界中雌性個(gè)體對(duì)于應(yīng)激等因素的耐受性往往要強(qiáng)于雄性個(gè)體，在本實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)也是如此。由此可見性別和干預(yù)因素對(duì)于NF-κB的表達(dá)具有很大的影響，這也引發(fā)了我們對(duì)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中性別選擇的思考。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)使用的制動(dòng)術(shù)是經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)研究論證的，其福利損傷效果目前已被廣泛接受。若實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)其他因素處理，NF-κB與福利水平是否仍有關(guān)聯(lián)？其次，NF-κB要成為一個(gè)具代表性的福利衡量指標(biāo)，并且要及早提示福利損傷的發(fā)生，那么NF-κB能否于行為學(xué)、免疫、內(nèi)分泌等指標(biāo)變化之前發(fā)生顯著變化，同時(shí)NF-κB與行為學(xué)、免疫、內(nèi)分泌等指標(biāo)之間是否具有相關(guān)性，我們?nèi)圆坏枚３酥?，根?jù)嵇晴等［16］的研究，特定劑量的氯胺酮可以抑制NF-κB的活性，減少TNF-α的釋放，有益于機(jī)體恢復(fù)。那么我們?cè)O(shè)想既然NF-κB參與了福利損傷過程，那么當(dāng)我們使用抑制劑抑制NF-κB的表達(dá)時(shí)，能否緩解福利損傷情況？因此，要明確NF-κB能否成為一個(gè)具代表性的福利衡量指標(biāo)，我們?nèi)杂泻芏喙ぷ饕觯S多問題仍有待進(jìn)一步研究論證。

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The study of expression of NF-κB in rats’liver after welfare impaired by restrain stress

LIANG Lei，MA Chang，LIU Jie，DONG Min，F(xiàn)ANG Tian，HU Wen-juan，CHEN Li，JIA Chun-mei，YUN Shi-feng
（Department of Comparative Medicine，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command，Army Education Base of Science and Ethics of Experimental Animal，National Sciene Education Base，Nanjing，210002，China）

ObjectiveTo study the expression of NF-κB in rats’liver after welfare impaired by restraint stress.MethodsSD rats，±170 g，male and female half，welfare were impaired by restraint stress.Body weight gain and food consumption were recorded throughout the study，mRNA and protein expression of NF-κB p65 in liver were detected after the study finished by real-time quantitative PCR and Western blotting.ResultsCompared with the control group（group C），the body weight gain and food efficiency ratio（FER）of restraint group（group R）were decreased（P＜0.01），but mRNA and protein expression of NF-κB p65 were much higher（P＜0.01）.Compared with female，mRNA and protein expression of NF-κB p65 of male rats were much higher in group R（P＜0.01），but showed no significant difference in group C（P＞0.05）.ConclusionAfter welfare impaired，the expression of NF-κB in rats’liver are much higher than before.It shows that NF-κB has effects during the process of welfare being impaired.

Welfare impaired；NF-κB；Gene expression

R-332

A

1671-7856（2015）11-0028-04

10.3969.j.issn.1671-7856.2015.11.007

梁磊（1982-），男，技師，理學(xué)學(xué)士，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理，人類疾病動(dòng)物模型。

惲?xí)r鋒（1965-），男，主任技師，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)，E-mail：yunshifeng1@163.com。

﹞2015-09-16