馬越,歐亮龍,王興明

(1.洛陽軸研科技股份有限公司，河南 洛陽，471039; 2.洛陽軸承研究所有限公司，河南 洛陽 471039;3.西南科技大學 材料科學與工程學院化學系，四川 綿陽 621010)

茜素黃R與溶菌酶作用方式的光譜法研究

馬越1,歐亮龍2,王興明3

(1.洛陽軸研科技股份有限公司，河南 洛陽，471039; 2.洛陽軸承研究所有限公司，河南 洛陽 471039;3.西南科技大學 材料科學與工程學院化學系，四川 綿陽 621010)

在接近生理條件下，采用UV-Vis光譜、熒光光譜、熱力學等方法研究了有機小分子茜素黃R(AYR)與溶菌酶(Lys)的作用機理.研究表明，AYR與Lys作用摩爾比為AYR∶Lys=5∶1,摩爾吸光系數(shù)εAL=3.87×105L·mol-1·cm-1，說明AYR對Lys具有熒光猝滅特性，作用模式為靜態(tài)猝滅，通過熱力學實驗可知，兩者之間的作用方式主要是疏水作用和范德華力作用.

茜素黃R; 溶菌酶; 作用機制

茜素黃 R 是一種茜草類有機小分子植物染料，研究發(fā)現(xiàn)這種小分子可作為生物探針來探究蛋白質(zhì)的結構也可以通過研究兩者之間的相互作用來深入了解蛋白質(zhì)的生物功能[1].研究茜素黃R與溶菌酶蛋白質(zhì)之間的相互作用方式，在新型抗癌藥物的選擇、抗癌功能的緩釋改良以及抗病毒作用機理等方面有重要應用和理論意義.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

溶菌酶(Lysozy me), 分析純, 上海伯奧生物科技有限公司; 茜素黃R (Alizarin Yellow R), 分析純, 成都科龍化工試劑廠; Tris生物緩沖溶液，自制; UV-2102-PCS型紫外可見分光光度計, 上海尤尼科有限公司; FL-4500型熒光光譜儀, 日本日立公; pHS-2C型酸度計, 成都方舟科技開發(fā)公司.

1.2 實驗方法

當小分子與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用時，紫外吸收光譜會發(fā)生一定的變化，這是由于蛋白質(zhì)的構象發(fā)生了變化[2].本實驗以光譜法獲得AYR與Lys作用的摩爾比，AYR-Lys復合物的摩爾吸光系數(shù)，結合過程的熱力學性質(zhì)變化等參數(shù)，并對AYR與Lys間的作用機制進行了研究.

2 結果與討論

2.1 紫外光譜法研究茜素黃R與溶菌酶的摩爾比

本文利用紫外光譜的摩爾比法，具體操作為：固定茜素黃R溶液的濃度，然后逐漸加入溶菌酶(Lys)溶液，掃描AYR-Lys體系的紫外可見光譜圖，如圖1所示.由圖1可知，隨著溶菌酶(Lys)溶液的加入，在206 nm左右處，茜素黃R(AYR)的吸收光譜的吸光度出現(xiàn)了規(guī)律性的增加并且可以看出存在有一定程度的紅移，而在280 nm左右處的比較弱的一個紫外吸收峰同樣也出現(xiàn)了吸光度增強的現(xiàn)象.這種現(xiàn)象的原因是由于Lys與AYR之間發(fā)生了相互作用[3-5]，對206 nm處的的吸光度作摩爾比圖1，得出nAYR∶nLys=5∶1.根據(jù)Beer定律A=εALbcAL其中εAL是AYR-Lys的摩爾吸光系數(shù)，cAL是AYR-Lys的濃度.由圖1計算得到εAL=3.87×105L·mol-1·cm-1.

λ/(nm)

圖1AYR對Lys紫外吸收光譜的影響

Fig.1InfluenceofLysonUV-VisabsorptionspectraofAYR(pH7.40)cAYR= 6.40×10-6mol/L;cLys= 4.80×10-5mol/Lλ/(nm)

圖2AYR對Lys熒光光譜的影響

Fig.2TheFlourescencespectracurveofAYRtoLys(pH7.40)cLys= 1.00×10-5mol/L;cAYR= 1.50×10-3mol/L

2.2 AYR和Lys的熒光猝滅機理及其猝滅常數(shù)

通過AYR加入到Lys溶液的熒光光譜圖2可知AYR能夠?qū)ys產(chǎn)生熒光猝滅，進一步說明兩者能夠發(fā)生作用.利用溫度對反應平衡的影響，通過熒光發(fā)射強度與組份濃度的關系，作不同溫度下F0/F～cAYR的變化圖，根據(jù)Stern-Volmer方程[6](1).

F0/F=1+KSV[R]=1+Kq×τ0×[R]

(1)

其中F0代表Lys與AYR體系里沒有猝滅劑AYR時體系的熒光值，F(xiàn)是每加入一次猝滅劑AYR時的熒光值.[R]為加入體系里AYR的現(xiàn)時濃度.KSV即動態(tài)猝滅常數(shù)，它表示蛋白質(zhì)分子與AYR分子相互擴散與相互碰撞的過程達到平衡時的量與效的關系.Kq即動態(tài)熒光猝滅速率，在此闡述的是Lys和AYR的擴散與碰撞對蛋白質(zhì)的熒光時間衰減的速率影響.τ0是沒有猝滅劑存在的時候，體系熒光分子的平均壽命，本文中熒光分子的平均壽命取值為10-8s[7].靜態(tài)猝滅常數(shù)KLB則可以用Lineweaver-Burk[8]雙倒數(shù)公式(2)來表示，這其中F、F0、R與之前所描述的相同，只是在這里進行了倒數(shù)處理.

(2)

當溫度變化時(285.65K及310.15K)按照光度滴定法向Lys中逐漸加入AYR測量其熒光變化，數(shù)據(jù)通過公式(1)與(2)分別繪制Stern-Volmer和Lineweaver-Burk曲線圖3和4線性相關擬合后得到直線方程、相關系數(shù)等見表1.

根據(jù)圖3和圖4，再結合表1，計算得到室溫下KSV=1.6599×104L·mol-1，又因為KSV=Kq·τ0，而且熒光物質(zhì)的τ0=10-8s，所以計算得到Kq=1.6599×1012L·mol-1·s-1.一般情況下，各種的熒光猝滅劑的最大擴散猝所產(chǎn)生的滅常數(shù)等于2×1010L·mol-1·s-1[7]，通過比較可以看出AYR對Lys的熒光猝滅常數(shù)遠大于擴散所產(chǎn)生的Kq值，因此可以得出結論，即AYR對Lys的熒光猝滅是以形成AYR-Lys復合產(chǎn)物的方式進行的，即靜態(tài)熒光猝滅.

圖3AYR與Lys作用的Stern-Volmer曲線(477nm)

Fig.3TheStern-VolmerplotsofAYRvsLys(477nm)cLys= 1.00×10-5mol/L;cAYR= 1.50×10-3mol/L

圖4 AYR與Lys作用的雙倒數(shù)曲線(477 nm)

Fig.4 The Double reciprocal plots of AYR vs Lys (477 nm)cLys= 1.00×10-5mol/L;cAYR= 1.50×10-3mol/L

表1 AYR與Lys相互作用的線性方程和相關系數(shù)

Table 1 Regression equations and interrelated coefficients of the AYR vs Lys

根據(jù)Lineweaver-Burk曲線得出的方程，可以計算得到AYR對Lys的熒光猝滅常數(shù)KLB=1.09×104L·mol-1.

2.3 AYR與Lys的結合常數(shù)和相互作用的熱力學函數(shù)

Ross[9]等人通過對大量的實驗結果進行統(tǒng)計，總結出了判斷生物大分子與一些有機小分子結合時的作用力類型和生物大分子自身作用力類型的熱力學規(guī)律，由圖4中直線的斜率和截距計算得到285.65K和310.15K時AYR與Lys的結合常數(shù)，KLB, 285.65K=1.09×104L·mol-1和KLB, 310.15K=9.71×103L·mol-1，由于溫度變化范圍不大，而且焓變對溫度變化所造成的誤差很小，可以忽略不計，所以本章實驗中做了近似處理，認為反應的ΔrHm是一個固定的值，所以可以根據(jù)熱力學公式(3)-(5)計算表觀焓變ΔrHm，表觀熵變ΔrSm和表觀吉布斯自由能ΔrGm.結果見表2

(3)

(4)

(5)

表2AYR和Lys結合常數(shù)和熱力學參數(shù)

Table 2 The binding constants and the thermodynamic parameters of AYR and Lys

從表2可以看出，AYR與Lys在相互作用時，吉布斯自由能和焓變都為負值，說明作用過程是一個放熱的自發(fā)進行的過程，又由于熵值是正的，這是由于疏水作用，所以AYR與Lys的作用方式是疏水作用.

2.4AYR與Lys-CBBG-250體系的相互作用

CBBG-250(G-250)即考馬斯亮藍，它是一種堿性條件下呈藍色的染料，分子中包含有磺酸基，被用作測定蛋白質(zhì)的含量，其功能在于，能和蛋白質(zhì)通過范德華力相互結合形成一種藍色的復合物[10].

這種復合物的顏色深淺與蛋白質(zhì)的含量成定量的關系.當在Lys-CBBG-250體系中加入AYR，AYR就會在和蛋白質(zhì)發(fā)生作用時與CBBG-250發(fā)生競爭.從這種競爭可以了解到AYR與Lys的相互作用方式.

具體實驗方法是，固定Lys-CBBG-250的摩爾比，然后向含不同量CBBG-250的Lys中加入AYR，掃描熒光光譜，結果如圖5.

對圖中數(shù)據(jù)進行線性回歸結果見圖6，線性方程和相關系數(shù)見表3從數(shù)據(jù)可以看出AYR對Lys-CBBG-250體系具有熒光猝滅作用，這可能是由于AYR與CBBG-250發(fā)生競爭，將CBBG-250替換出來，形成熒光強度更低的AYR-Lys復合物，從而導致熒光強度降低的現(xiàn)象，說明AYR與Lys之間存在范德華力.

表3AYR與Lys-CBBG-250相互作用的線性方程和相關系數(shù)

Table3RegressionequationsandinterrelatedcoefficientsoftheAYRandLys-CBBG-250

cC/cLRegressionequationsRR20∶1F0-F=3．80+16．40×105cAYR0．998330．996660．5∶1F0-F=22．23+28．44×105cAYR0．992210．984481∶1F0-F=32．28+33．06×105cAYR0．991600．983271．5∶1F0-F=32．75+38．68×105cAYR0．991610．98329

3 結 論

[1]胡亞敏, 蔣琪英, 張歡, 等.堿性介質(zhì)中茜素黃R與牛血清蛋白相互作用研究[J].西南科技大學學報, 2007, 22(3)：14-19.

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[責任編輯：徐明忠]

Study on the interaction between alizarin yellow R and lysozyme by spectrometry

MA Yue1,OU Lianglong2，WANG Xingming3

(1.Luoyang Bearing Science&Technology Co.,Ltd., Luoyang 471039, China;2.Luoyang Bearing Research Institute, Luoyang 471039, China; 3.Department of Chemistry, School of Materials Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, China)

The mechanism of interaction between alizarin yellow R and lysozyme has been investigated by UV spectroscopy, fluorescence spectroscopy, thermodynamics, etc.The results indicate that the molar ratio of AYR and Lys is 5∶1, the molar absorption coefficient is εAL=3.87×105L·mol-1·cm-1.The action type of AYR and Lys is static quenching.The thermodynamic experiment shows that the main effect of is hydrophobic effect and van der Waals force.

alizarin yellow R; lysozyme; mechanism

2015-05-30

馬越 (1988-)，女，安徽合肥人，洛陽軸研科技股份有限公司助理工程師，碩士，主要從事分析化學的研究.

O

A

1672-3600(2015)12-0041-05