鐘思燕，王維民，諶素華，蔡璐

(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江，524088)

巖藻聚糖硫酸酯是存在于褐藻中以L-巖藻糖為主，多種單糖殘基以及硫酸基組成的水溶性雜多糖，具有廣泛的生物活性，如抗凝血、抗腫瘤、抗病毒、抗血栓、降血脂等［1］。其分子質(zhì)量分布廣，從幾萬到幾十萬不等，多糖生物活性與其分子質(zhì)量和化學(xué)組成有密切關(guān)系，但是大分子質(zhì)量巖藻聚糖硫酸酯溶解性低，生物利用性不好，在很大程度上限制其生物活性的應(yīng)用。近年來，許多研究表明低分子質(zhì)量巖藻聚糖具有更好的溶解性、吸收性、生物利用率，及良好的生物活性［2－5］，因此研究巖藻聚糖降解條件是馬尾藻巖藻聚糖及其產(chǎn)品開發(fā)和應(yīng)用亟待解決的問題。多糖的降解方法大致分為物理法、化學(xué)法和生物法，其中化學(xué)法主要包括酸降解法和過氧化氫降解法，而酸降解法的優(yōu)點(diǎn)是工藝簡單，產(chǎn)品質(zhì)量易于控制，利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，雖會產(chǎn)生一定的脫硫作用，但溫和的條件仍可得到活性較好的低分子質(zhì)量巖藻聚糖硫酸酯。

本研究以圍氏馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯粗品為研究對象，通過控制酸水解條件分別降解2種硫酸基含量不同的大分子巖藻聚糖硫酸酯并對其進(jìn)行純化，獲得 MMWF1、LMWF1、MMWF2和LMWF2四個組分，對4組分的化學(xué)組成進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

圍氏馬尾藻(Sargassum fucoidan)，采于廣東湛江硇洲島，經(jīng)沖洗、曬干、粉碎、過80目篩，干燥保存?zhèn)溆?。用超聲波浸提工藝提取后得到?shí)驗(yàn)材料馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯粗品［6］。

1.2 主要試劑

濃H2SO4、乙酸酐等，均為國產(chǎn)分析純;標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量葡聚糖、L-巖藻糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖等試劑，均為進(jìn)口色譜純;DEAE-52纖維素，廣州鼎國生物技術(shù)有限公司;Sephacryl S-200HR，美國GE公司。

1.3 儀器設(shè)備

中低壓半制備色譜儀，日本埃朗科技;高速冷凍離心機(jī)，日本日立;紅外光譜儀，美國Nicolet;氣相色譜儀，上海天美科學(xué)儀器;真空冷凍干燥機(jī)，韓國ilshin。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 DEAE-52纖維素離子交換層析法初步分級巖藻聚糖硫酸酯粗品

稱取150 mg馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯粗品，用水稀釋后上樣，依次用蒸餾水、1、2和3 mol/L NaCl作洗脫液逐級洗脫，流速為1 mL/min，每管收集5 mL。用苯酚-硫酸法進(jìn)行比色，根據(jù)吸光度繪制洗脫曲線。依據(jù)洗脫曲線分別進(jìn)行收集，再經(jīng)濃縮、除鹽和冷凍干燥后得到每個多糖組分。

1.4.2 不同分子質(zhì)量巖藻聚糖硫酸酯的制備及其分子質(zhì)量的測定

采用稀酸降解法制備不同分子質(zhì)量的巖藻聚糖硫酸酯。將樣品溶解于不同濃度H2SO4溶液(0.01、0.05、0.10 mol/L)中制成1%的溶液，分別在不同溫度(40、60、80 ℃)下反應(yīng)，在不同時間點(diǎn)(0、2、4、8 h)下用2 mol/L NaOH終止反應(yīng)，再經(jīng)透析，凍干得到降解后樣品。根據(jù)不同反應(yīng)條件，研究稀酸對巖藻聚糖的降解規(guī)律，并測定不同時間點(diǎn)巖藻聚糖的分子質(zhì)量變化，確定酸降解條件。將降解后的組分過Sephacryl S-200HR柱進(jìn)行分級純化，獲得不同分子質(zhì)量的巖藻聚糖。

以葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用高效凝膠色譜法測定降解前后組分的分子質(zhì)量。取Dextran2000及標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖系列各10 mg，溶于1 mL去離子水中，上Sephacryl S-200層析柱，以0.5 mol/L NaCl溶液80 r/min速度洗脫，收集。以分子質(zhì)量對數(shù)(lgMw)對每種標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖的洗脫體積與藍(lán)色葡聚糖的洗脫體積之比(Ve/Vo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。分別再取稀酸降解后的各樣品稀釋至一定濃度后，上樣，測其洗脫體積Ve，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算不同組分的相對平均分子量。

1.4.3 不同分子量巖藻聚糖硫酸酯化學(xué)組成測定

總糖含量測定:采用苯酚硫酸法(校正系數(shù)為0.9)［7－8］;硫酸基含量測定:采用 Dodgson 法［9］;巖藻糖含量測定:采用Dische比色法［10］;糖醛酸含量測定:采用咔唑比色法［11］;單糖組成測定:采用糖醇乙酸酯衍生物氣相色譜法［12］。

1.4.4 不同分子量巖藻聚糖硫酸酯結(jié)構(gòu)分析

采用美國Nicolet SDXB FT IR紅外光譜儀，將干燥的不同分子質(zhì)量的多糖樣品與KBr混合、研磨后壓制成厚度1 mm左右的薄片，在4 000～500 cm－1區(qū)間進(jìn)行紅外掃描，檢測不同分子質(zhì)量的巖藻聚糖組分中多糖特征鍵(基團(tuán))的組成［13］。

2 結(jié)果與分析

2.1 DEAE-52纖維素離子交換層析法分級純化巖藻聚糖硫酸酯粗品

采用纖維素陰離子交換柱層析法對馬尾藻巖藻聚糖粗品進(jìn)行分級純化，依次用蒸餾水、1、2、3 mol/L的NaCl溶液洗脫，洗脫曲線見圖1。從圖1中可以看出，蒸餾水和3個濃度的洗脫液處均形成一個糖峰，分別命名為 F0、F1、F2和 F3。F0為中性多糖，是未被纖維素交換的成分，硫酸基含量較少;而F1、F2和F3為酸性多糖，根據(jù)硫酸基的含量不同而被不同濃度的洗脫液洗脫下來。從峰面積可以看出，各組分總糖含量有較大差異，其中1 mol/L NaCl溶液的洗脫面積最大，隨著洗脫液濃度的升高，洗脫出的組分總糖含量逐漸減少。

由于F0所含硫酸基較少，F(xiàn)3總糖含量較低，故本文只對F1和F2進(jìn)行收集和分析。

圖1 馬尾藻巖藻聚糖粗品經(jīng)DEAE-52柱層析的梯度洗脫曲線Fig.1 The gradient elution curve of crude fucoidan on DEAE-52 column chromalography

2.2 不同分子質(zhì)量巖藻聚糖硫酸酯的制備及其分子質(zhì)量測定

2.2.1 不同分子質(zhì)量巖藻聚糖的制備

在酸降解過程中，反應(yīng)溫度、酸濃度和反應(yīng)時間是影響多糖水解速度和分子質(zhì)量大小的重要因素，本試驗(yàn)研究了不同的反應(yīng)溫度(40、60、80℃)、不同的H2SO4濃度(0.01、0.05、0.10 mol/L)和不同反應(yīng)時間(2、4、8 h)對巖藻聚糖硫酸酯的降解作用，降解后的凝膠色譜圖2～圖4所示。從圖2～圖4中可以看出，最早出現(xiàn)的峰可能是由于分子質(zhì)量過大而超出柱分離范圍的巖藻聚糖硫酸酯，但隨著溫度、酸濃度的升高和反應(yīng)時間的延長，第1個峰的峰面積比例不斷縮小，這說明大分子的物質(zhì)在不斷的降解，因此小分子質(zhì)量巖藻聚糖不斷增多。另外，在高溫及較高酸度的情況下，降解反應(yīng)速度較快，不易控制，而且重復(fù)率可能較低，故本實(shí)驗(yàn)研究在0.05 mol/L H2SO4、60℃條件下，馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯降解4 h和8 h的情況。

如圖4所示，在60℃、酸濃度為0.05 mol/L、降解4 h時，巖藻聚糖的保留時間為45.02 min，通過公式計(jì)算其平均分子質(zhì)量基本降至15.2 kDa左右;當(dāng)降解8 h時，保留時間為51.92 min，平均分子質(zhì)量基本降至7.7 kDa左右。本文根據(jù)以上條件分別降解經(jīng)DEAE-52分級得到的F1和F2，降解后過Sephacryl S-200HR柱，并按時間收集、濃縮、透析和凍干。將F1降解4 h和8 h得到巖藻聚糖命名為MMWF1和LMWF1，將F2降解4h和8h得到的巖藻聚糖命名為MMWF2和LMWF2。

圖2 溫度對馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯酸水解的影響Fig.2 Effect of temperature on fucoidan from S.wightii acid hydrolysis(反應(yīng)時間1 h、酸濃度0.05 mol/L，3條曲線的反應(yīng)溫度分別為40、60、80℃)

圖3 酸濃度對馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯酸水解的影響Fig.3 Effect of temperature on fucoidan from S.wightii acid hydrolysis(反應(yīng)溫度60℃、反應(yīng)時間1 h，3條曲線的酸濃度分別為0.01、0.05、0.10 mol/L)

圖4 反應(yīng)時間對馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯酸水解的影響Fig.4 Effect of reaction time on fucoidan from S.wightii acid hydrolysis(酸濃度0.05 mol/L，反應(yīng)溫度60℃，4條曲線的反應(yīng)時間分別為0、2、4、8 h)

2.2.2 巖藻聚糖硫酸酯酸降解組分分子質(zhì)量的測定

利用Sephacryl S-200高效凝膠色譜結(jié)合示差光檢測器的方法，得出Dextran2000及標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖系列標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖5所示。以Ve/Vo為橫坐標(biāo)、分子質(zhì)量的對數(shù)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程lgMw= －1.131 6 Ve/Vo+6.106 5，R2=0.994 7，表明保留時間與分子質(zhì)量對數(shù)之間存在良好的線性關(guān)系。

圖5 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 The standard curve of molecular weight of polysaccharide

用同樣方法分別測定 MMWF1、LMWF1、MMWF2、LMWF2所得的洗脫體積Ve，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算出不同組分的相對平均分子質(zhì)量，結(jié)果如表1所示。

表1 馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯不同組分的分子量Table 1 The molecular of different component fucoidan from S.wightii

2.3 不同分子質(zhì)量巖藻聚糖硫酸酯化學(xué)組成分析

表2 不同分子量馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯的化學(xué)組成 %Table 2 The chemical composition of different molecular weight fucoidan from S.wightii %

由表2可知，由于DEAE-52的分級作用，F(xiàn)2的硫酸基含量比F1的高出8.04%，總糖、巖藻糖和糖醛酸含量差異不大。通過分析降解前后各多糖組分化學(xué)組成的結(jié)果表明，降解后多糖組分總糖、巖藻糖和硫酸基含量的下降較為明顯。這是因?yàn)镠2SO4能夠斷裂巖藻聚糖硫酸酯中的糖苷鍵，將巖藻聚糖切割成為低分子的片段，與此同時巖藻聚糖硫酸酯中的硫酸基發(fā)生部分脫落，且隨著水解時間的增加，硫酸基脫落程度也增加，這與吳永沛等人利用酸水解制備低分子量巖藻聚糖所得結(jié)果相符［14］。

將7種單糖標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行衍生化及GC分析后，記錄每種單糖衍生物的出峰時間，然后進(jìn)行混標(biāo)分析，結(jié)果如圖6所示。圖6中從左到右，鼠李糖(Rha)、巖藻糖(Fuc)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)和半乳糖(Gal)的出峰時間依次為:14.486、14.753、14.997、15.585、25.991、26.594和26.810 min。

不同分子質(zhì)量的馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯經(jīng)衍生化及GC分析后，分別得到 MMWF1、MMWF2、LMWF1和LMWF1的氣相色譜圖，如圖7所示。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)單糖的氣相色譜圖Fig.6 Gas chromatogram of standard monosaccharid

圖7 不同分子量馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯氣相色譜圖Fig.7 Gas chromatogram of different molecular weight fucoidan from S.wightii

表3 不同分子質(zhì)量馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯的單糖組成 %Table 3 The monosaccharide composition percentage of different molecular weight fucoidan from S.wightii%

由表3及圖7可知，馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯各組分均由鼠李糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖構(gòu)成，但百分含量各不相同。MMWF1的半乳糖含量最高，MMWF2的巖藻糖含量最高，LMWF1和LMWF2的甘露糖含量最高?？赡苁怯捎谔擎湹臄嗔?，使單糖的組成百分比發(fā)生了變化。

2.4 紅外分析

采用紅外光譜儀在4 000～500 cm－1區(qū)間對不同分子質(zhì)量的樣品進(jìn)行紅外掃描，檢測不同分子質(zhì)量的巖藻聚糖組分中多糖特征鍵(基團(tuán))的組成，結(jié)果如圖8～圖11所示。

通過比較以上紅外光譜圖發(fā)現(xiàn)，4組分均含共有的多糖特征峰:3 432～3 482 cm－1處有強(qiáng)吸收峰，這是多糖分子間或分子內(nèi)氫鍵 O—H的伸縮振動;2 942－2 950 cm－1為甲基的C—H伸縮振動信號，可能是巖藻糖甲基的吸收振動峰;1 613～1 634 cm－1為C═O的伸縮振動，說明結(jié)構(gòu)中均含有一定量的糖醛酸;1 417～1 422 cm－1處的吸收峰為—OH的變形振動，表明多糖為多聚糖;1 250～1 259 cm－1處吸收峰是S═O的伸縮振動，800～860 cm－1處是C—O—S的伸縮振動峰，表明是硫酸基取代的多糖。

圖8 MMWF1的紅外光譜圖Fig.8 Infrared spectra of MMWF1

圖9 MMWF2的紅外光譜圖Fig.9 Infrared spectra of MMWF2

圖11 LMWF2的紅外光譜圖Fig.11 Infrared spectra of LMWF2

MMWF2在1 420 cm－1附近的 C—O—S伸縮振動峰明顯強(qiáng)于其他3個組分，LMWF2次之，與化學(xué)分析的結(jié)果一致。C—O—S伸縮振動的位置與硫酸基在多糖上的連接位置有關(guān)，連接在C2或C3位處于平伏鍵位置的硫酸基在820 cm－1處有吸收，連接在C4位處于直立鍵位置的硫酸基在845 cm－1處有吸收。MMWF1和MMWF2的 C—O—S伸縮振動峰在820 cm－1附近，LMWF1和 LMWF2的伸縮振動峰在836 cm－1附近，這說明MMWF1和MMWF2的硫酸根是連接在C2或C3位的，而LMWF1和LMWF2可能有C4位的硫酸基取代［15－16］。

3 討論

本文采用DEAE-52纖維素離子交換層析法、酸降解法、Sephacryl S-200凝膠法制備得到不同分子質(zhì)量馬尾藻巖藻聚糖，并對其化學(xué)組成進(jìn)行了詳細(xì)分析。據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)報道，大部分褐藻中的巖藻聚糖硫酸酯均由多種糖殘基構(gòu)成，富士川龍郎等［17］先后從21種褐藻中提取巖藻聚糖硫酸酯，其中巖藻糖含量(12.9% ～46.2%)、硫酸基含量(14.3% ～38.1%)和糖醛酸含量(0.62% ～20.2%)均不相同。Nishide等［18］對21種日本產(chǎn)褐藻的巖藻聚糖硫酸酯的單糖及糖醛酸組分進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其單糖組分以L-巖藻糖為主，均含有木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖和鼠李糖，少數(shù)含有阿拉伯糖。

本研究經(jīng)酸降解后獲得的圍氏馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯其化學(xué)組成與大部分褐藻相似，含有巖藻糖、半乳糖、甘露糖等其他組分，但均不含阿拉伯糖。其中MMWF1以巖藻糖、半乳糖及葡萄糖為主;MMWF2以巖藻糖和半乳糖為主;LMWF1與LMWF2以巖藻糖和甘露糖為主，這可能與糖苷鍵的不同或糖鏈斷裂有關(guān)。另外，四組分均含有多糖的特征吸收峰和硫酸基吸收峰，其平均分子質(zhì)量分別為16.32、15.49、7.65和7.21 kD，但各組分總糖、硫酸基、巖藻糖等含量均有所降低，這可能與酸降解的脫硫作用及糖鏈斷裂有關(guān)。張秀坤［19］的研究表明，采用酸降解方法獲得的低分子質(zhì)量巖藻聚糖硫酸酯仍具有良好的抗氧化和降血脂活性，本研究可為進(jìn)一步研究多糖的構(gòu)效關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。

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