袁紅霞，邱振宇，周 盾

(遼寧醫(yī)學(xué)院1.護(hù)理學(xué)院;2.附屬第一醫(yī)院 感染科;3.附屬第一醫(yī)院 高壓氧科，遼寧 錦州121001)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性炎性反應(yīng)疾病，迄今病因及機(jī)制仍不清楚。成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)具有類(lèi)腫瘤細(xì)胞特性，在RA 發(fā)病中備受關(guān)注。二甲基鞘氨醇(N，N-dimethyl-D-erythro-sphingosine，DMS))是鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1，SPHK1)的特異性抑制劑，能有效抑制SPHK1 活性，參與RA的發(fā)病[1]。本研究觀察DMS 對(duì)人RA-FLS增殖及分泌IL-6和IL-8的影響及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料:DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶(Hyclone 公司);WST-1 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒和結(jié)晶紫(碧云天生物技術(shù)研究所);抗SPHK1 多克隆抗體(Abgent 公司);白介素-6和白介素-8 ELISA 試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人RA-FLS 培養(yǎng)及活性檢測(cè):人RA-FLS(Cell Applications 公司)用含10% 胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液于37℃、5% CO2條件培養(yǎng)，接種于96 孔(約2 000個(gè)/孔)，對(duì)照組不加DMS，實(shí)驗(yàn)組分別加5、10、15 和20 μmol/L DMS，24、48 和72 h后按WST-1 試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖活性。

1.2.2 結(jié)晶紫染色:各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用4%多聚甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色10 min，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.2.3 Western blot檢測(cè)SPHK1蛋白的表達(dá):按說(shuō)明書(shū)檢測(cè)對(duì)照組及DMS(10 μmol/L)組SPHK1蛋白。

1.2.4 ELISA 檢測(cè)IL-6和IL-8的分泌:按說(shuō)明書(shū)檢測(cè)DMS(10 μmol/L)組RA-FLS 上清液中不同時(shí)間點(diǎn)(24、48 和72 h)IL-6和IL-8的分泌水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用Graphpad Prism 5.0 進(jìn)行作圖和分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組之間計(jì)量資料的比較采用t 檢驗(yàn)，多組之間計(jì)量資料的比較采用Oneway ANVOVA法。

2 結(jié)果

2.1 DMS 呈時(shí)間劑量依賴性抑制人RA-FLS的增殖(表1)。

表1 DMS 抑制人RA-FLS增殖Table1 DMS inhibits RA-FLS proliferation(±s，A value，n=6)

表1 DMS 抑制人RA-FLS增殖Table1 DMS inhibits RA-FLS proliferation(±s，A value，n=6)

＊P＜0.05 compared with control group.

group time/hours 24 48 72 control 1.65±0.28 1.72±0.12 1.67±0.05 DMS 5 μmol/L 1.50±0.16 1.45±0.09* 1.31±0.04*DMS 10 μmol/L 1.17±0.18* 1.02±0.18* 0.39±0.01*DMS 15 μmol/L 1.01±0.15* 0.63±0.08* 0.40±0.01*DMS 20 μmol/L 0.71±0.18* 0.47±0.05* 0.37±0.01*

2.2 DMS 影響人RA-FLS的形態(tài):5、10、15 和20 μmol/L DMS 作用48 h后，細(xì)胞由長(zhǎng)梭形變成不規(guī)則形，細(xì)胞密度明顯降低，個(gè)別核出現(xiàn)固縮，胞質(zhì)中有空泡(圖1)。

2.3 DMS(10 μmol/L)抑制SPHK1蛋白表達(dá):48 h后，DMS組SPHK1蛋白水平為0.41±0.19，明顯低于對(duì)照組的1.01±0.19(n=3)(P＜0.05)(圖2)。

2.4 DMS(10 μmol/L)抑制IL-6和IL-8 分泌:與24 h 相比，72 h IL-6和IL-8 分泌減少，(P＜0.05);與48 h 比較，72 h時(shí)IL-8 分泌減少(P＜0.05)(表2)。

圖1 DMS 對(duì)人RA-FLS 形態(tài)的影響Fig1 Morphological alteration of RA-FLS following treatment with DMS(×200)

圖2 DMS 抑制SPHK1蛋白表達(dá)Fig2 DMS inhibits SPHK1 expression

表2 DMS 抑制IL-6和IL-8 分泌Table2 DMS inhibits the secretion of IL-6/8(±s，pg/mL，n=3)

表2 DMS 抑制IL-6和IL-8 分泌Table2 DMS inhibits the secretion of IL-6/8(±s，pg/mL，n=3)

*P＜0.05 compared with 24 hours;#P＜0.05 compared with 48 hours.

time/hours IL-6 IL-8 24 68.65±4.91 92.07±2.44 48 53.41±4.99 83.45±4.88 72 52.24±1.67* 61.04±2.44*#

3 討論

RA-FLS 異常過(guò)度增殖，分泌促炎性因子和蛋白激酶，參與RA的炎性反應(yīng)，促進(jìn)骨和軟骨破壞。本研究證實(shí)DMS抑制RA-FLS增殖并明顯抑制SPHK1蛋白的表達(dá)。提示DMS 在RA 中通過(guò)抑制SPHK1的表達(dá)而具有抗細(xì)胞增殖的潛能。

RA 致病過(guò)程中炎性因子IL-6和IL-8 等分泌增加。本研究發(fā)現(xiàn)，DMS 減少I(mǎi)L-6和IL-8的分泌，表明SPHK1 可能通過(guò)調(diào)控炎性反應(yīng)參與RA 發(fā)病。體外研究發(fā)現(xiàn)，在膠原誘導(dǎo)的鼠關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中，應(yīng)用DMS 能顯著減輕關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)和骨質(zhì)破壞[2]。應(yīng)用SPHK1 活化后的下游代謝產(chǎn)物1-磷酸鞘氨醇可誘導(dǎo)RA-FLS 分泌IL-6和IL-8，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能失調(diào)[3]，上述研究結(jié)果與本研究報(bào)道一致，說(shuō)明調(diào)控SPHK1的表達(dá)，可能是延緩RA 關(guān)節(jié)進(jìn)展和骨破壞的新靶點(diǎn)。SPHK1 調(diào)控RA-FLS增殖及IL-6和IL-8 分泌可能涉及多種信號(hào)通路，值得進(jìn)一步探討。

[1]Lai WQ，Chia FLA，Leung BP.Sphingosine kinase and sphingosine-1-phosphate receptors:novel therapeutic targets of rheumatoid arthritis?[J].Future Med Chem，2012，4:727-733.

[2]Lai WQ，Irwan AW，Goh HH，et al.Anti-inflammatory effects of sphingosine kinase modulation in inflammatory arthritis[J].J Immunol，2008，181:8010-8017.

[3]Zhao C，F(xiàn)ernandes MJ，Turgeon M，et al.Specific and overlapping sphingosine-1-phosphate receptor functions in human synoviocytes:impact of TNF-α[J].J Lipid Res，2008.49:2323-2337.