李建立，吳紅海，于 洋，薛 改，侯艷寧*

(1.河北省人民醫(yī)院 麻醉科，河北 石家莊050051;2.中國(guó)人民解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院 藥劑科，河北 石家莊050082)

發(fā)育期大鼠反復(fù)使用氯胺酮可導(dǎo)致大腦神經(jīng)細(xì)胞的大量凋亡，影響幼鼠成年后的學(xué)習(xí)記憶功能[1-2]。因此研究氯胺酮對(duì)發(fā)育期大腦的影響具有重要的臨床意義。本研究觀察氯胺酮對(duì)發(fā)育期皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的影響并探討可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物:清潔級(jí)新生24 h 內(nèi)SD大鼠(河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):1306107)。

1.1.2 主要試劑與藥品:氯胺酮注射液(福建古田藥業(yè)有限公司)，DMEM、Neurobasal-A、胎牛血清和B27 (Gibco 公司)，阿糖胞苷(浙江海正藥業(yè))，MTT、Hoechst 33258 熒光染料和胰蛋白酶(Solarbio 公司)，多聚賴(lài)氨酸(Sigma-Aldrich 公司)，TUNEL(羅氏公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng):參照文獻(xiàn)[3]行大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的原代培養(yǎng)，體外培養(yǎng)7 d的神經(jīng)元用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與藥物處理:體外培養(yǎng)7 d的皮質(zhì)神經(jīng)元加入不同濃度的氯胺酮處理培養(yǎng)24 h，或100 μmol/L的氯胺酮處理皮質(zhì)神經(jīng)元6、12、24 和48 h，不加氯胺酮的對(duì)照組或100 μmol/L 氯胺酮培養(yǎng)24 h，觀察氯胺酮對(duì)發(fā)育期皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷作用。

1.2.3 觀察指標(biāo):MTT法檢測(cè)皮質(zhì)神經(jīng)元存活率，Hoechst33258 染色和TUNEL法檢測(cè)皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡，Western blot 法測(cè)定pGSK3β 蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度氯胺酮對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元存活率的影響:神經(jīng)元存活率隨氯胺酮濃度的增加逐漸下降，其中100 和1 000 μmol/L的氯胺酮使神經(jīng)元存活率明顯下降，分別為對(duì)照組的58.2%(P＜0.01)和31.4%(P＜0.01)(圖1)。

圖1 不同濃度氯胺酮對(duì)原代培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元存活率的影響Fig1 Effect of different concentrations of ketamine on viability of primary cultured cortical neurons(±s，n=6)

2.2 氯胺酮不同作用時(shí)間對(duì)原代培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元存活率的影響:皮質(zhì)神經(jīng)元隨氯胺酮處理時(shí)間延長(zhǎng)存活率逐漸降低，其中處理12 h 神經(jīng)元存活率為對(duì)照組的84.1%(P＜0.05)，處理24 h為57.6% (P＜0.01)，處理48 h 為43.6%(P＜0.01)(圖2)。

圖2 氯胺酮不同作用時(shí)間對(duì)原代培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元存活率的影響Fig2 Effect of different incubation time with ketamine on viability of primary cultured cortical neurons(±s，n=6)

2.3 TUNEL法檢測(cè)氯胺酮對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的影響:氯胺酮組TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元為46.3%±5.2%，顯著高于對(duì)照組9.2%±1.3%(P＜0.01)(圖3)。

圖3 氯胺酮對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的影響Fig3 Effect of ketamine on neuroapoptosis of primary cultured cortical neurons using TUNEL assay(±s，n=5，×400)

2.4 Hoechst33258 核熒光染色法觀察氯胺酮對(duì)原代培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的影響:氯胺酮組皮質(zhì)神經(jīng)元染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化，細(xì)胞核甚至裂解為碎塊，有大量凋亡細(xì)胞呈亮藍(lán)色(45.8%±3.4%)，顯著高于對(duì)照組(7.8%±2.2%)(P＜0.01)(圖4)。

2.5 氯胺酮對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元pGSK-3β水平的影響:氯胺酮組皮質(zhì)神經(jīng)元pGSK-3β水平為0.71±0.05，顯著低于對(duì)照組1.12±0.03(P＜0.01)(圖5)。

圖4 Hoechst33258 染色檢測(cè)氯胺酮對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的影響Fig4 Effect of ketamine on neuroapoptosis of primary cultured cortical neurons using Hoechst33258 dying(±s，n=5，×400)

圖5 氯胺酮對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元pGSK-3β水平的影響Fig5 Effect of ketamine on the expression of pGSK-3β(±s，n=3)

3 討論

本研究采用多種方法研究氯胺酮對(duì)原代培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷作用。MTT 結(jié)果表明氯胺酮對(duì)存活率的影響具有劑量依賴(lài)性，1 μmol/L 氯胺酮在本實(shí)驗(yàn)條件下未見(jiàn)對(duì)神經(jīng)元存活率產(chǎn)生影響，10 μmol/L 氯胺酮可抑制神經(jīng)元的存活率(大約20%)，100 及1 000 μmol/L 氯胺酮可顯著抑制神經(jīng)元存活率。以往研究顯示10 μmol/L 氯胺酮可顯著抑制神經(jīng)元的存活率(大約50%)[4]。此差異的產(chǎn)生可能與細(xì)胞培養(yǎng)方法、神經(jīng)元發(fā)育階段的差別有關(guān)。但對(duì)于較高濃度的氯胺酮對(duì)神經(jīng)元的存活率影響更為明顯，大多數(shù)研究結(jié)果是一致的[3-4]。另外本研究發(fā)現(xiàn)氯胺酮對(duì)神經(jīng)元存活率的影響具有時(shí)間依賴(lài)性，隨氯胺酮處理時(shí)間的延長(zhǎng)，存活率逐漸下降，氯胺酮處理神經(jīng)元24、48 h 會(huì)引起神經(jīng)元存活率的顯著下降。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Hoechst33258 染色和TUNEL 兩種方法進(jìn)一步證實(shí)了氯胺酮可誘導(dǎo)皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡。

關(guān)于氯胺酮導(dǎo)致發(fā)育期皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的機(jī)制，目前還不是非常明確，可能與氯胺酮導(dǎo)致NMDAR1的代償性上調(diào)有關(guān)[4]。GSK3β 作為一種蛋白激酶在大腦中的表達(dá)尤為豐富，在神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)細(xì)胞信號(hào)通路傳導(dǎo)中發(fā)揮著十分重要的作用。氯胺酮誘導(dǎo)發(fā)育期大鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡與pGSK3β蛋白水平下降有關(guān)[5]。本研究也發(fā)現(xiàn)氯胺酮在誘導(dǎo)原代培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡時(shí)伴隨神經(jīng)元pGSK3β 蛋白水平的下降，因此推理氯胺酮誘導(dǎo)皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡可能與pGSK3β蛋白水平的下降有關(guān)。

綜上所述，氯胺酮可劑量與時(shí)間依賴(lài)性誘導(dǎo)原代培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元的凋亡，其機(jī)制可能與氯胺酮引起皮質(zhì)神經(jīng)元pGSK3β 蛋白水平的下降有關(guān)。

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[3]Li J，Wu H，Xue G，et al.17β-oestradiol protects primary cultured rat cortical neurons from ketamine-induced apoptosis by activating PI3K/Akt/Bcl-2 signaling[J].Basic Clin Pharmacol Toxicol，2013，113:411-418.

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