張東濤 黃偉哲 陳喜珊

·實驗研究·

丹參水提物對乳鼠心肌細胞缺氧-復氧損傷的保護作用

張東濤 黃偉哲 陳喜珊

本文研究丹參水提物對乳鼠心肌細胞缺氧-復氧損傷的保護作用。以乳鼠心室肌進行心肌細胞培養(yǎng)并建立缺氧-復氧損傷模型， 檢測不同濃度丹參水提物預處理后細胞的存活率， 乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶（AST）的泄漏量及Akt的磷酸化水平。丹參水提物對缺氧-復氧損傷的心肌細胞具有明顯的保護作用， 這可能與它激活PI3K/Akt信號通路有關(guān)。

缺氧-復氧；心肌細胞；丹參水提物

丹參是著名的傳統(tǒng)中藥， 具有抗氧化、改善微循環(huán)防止血栓形成等多種功能， 近年來又發(fā)現(xiàn)丹參可促進骨愈合［1］、預防股骨頭壞死［2］、有效降低絕經(jīng)期婦女骨質(zhì)疏松血中骨吸收生物指標［3］。但是丹參水提物對缺氧-復氧乳大鼠心肌細胞是否有保護作用研究不多， 本研究旨在采用缺氧-復氧乳大鼠心肌細胞損傷模型， 探討丹參水提物對缺氧-復氧心肌細胞保護作用及可能的作用機制， 為其在臨床上防治心肌缺血、缺氧性疾病提供科學的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 丹參水提物在試驗室自制。

1.2 乳鼠心肌細胞培養(yǎng) 取出生1～3 d的 SD大鼠心肌組織，按文獻［4］進行分次水浴攪拌消化， 差速貼壁法純化心肌細胞， 以1×106/cm2的細胞密度接種于35 mm2培養(yǎng)皿。

1.3 心肌細胞缺氧-復氧模型的建立和分組 不含血清的DMEM低糖培養(yǎng)基， 純氮1 L/min流量充分飽和30 min， 用上述培養(yǎng)基置換正常培養(yǎng)基， 將細胞放入密封袋充入高純度氮氣， 密封放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)為缺氧；用含15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液置換培養(yǎng)基， 置于95%O2+5%CO2， 培養(yǎng)箱常氧培養(yǎng)為復氧。

細胞分為五組：正常組；缺氧-復氧模型組；丹參水提物組［分別在培養(yǎng)基中加入丹參水提物（0.2或0.4 g/L）， 其余操作同缺氧-復氧模型組］；LY294002組［在培養(yǎng)基中加入LY294002（30 μmol/L）， 其余操作同缺氧-復氧模型組］。

1.4 LDH、CK和AST活力測定 LDH、CK和AST活力用試劑盒測定。

1.5 Akt和p-Akt蛋白表達采用Biorad 法取總蛋白20 μg進行電泳分離蛋白。蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜， 3%BSA 液 4℃封閉過夜， 分別加入Akt和p-Akt單克隆抗體（1∶150稀釋），4℃孵育過夜， 辣根過氧化物酶山羊抗兔 lgG 二抗孵育1 h，DAB 顯色照相。用 image J 軟件分析條帶的積分光密度值，相對蛋白含量用積分光密度值表示。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差（ x-±s）表示， 實施t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示， 實施χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 與正常組比較， 模型組中心肌細胞的存活率顯著較低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與缺氧-復氧模型組比較， 丹參水提物（0.2或0.4 g/L）組心肌細胞的存活率顯著較高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；同樣的， 與模型對照組比較，LY294002（30 μmol/L）能夠減弱丹參水提物提高心肌細胞的存活的效果， 差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）， 見表1。

2.2 與正常組比較， 模型組中心肌細胞中的LDH、CK和AST活力顯著增加， 差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與缺氧-復氧模型組比較， 丹參水提物（0.2或0.4 g/L）組心肌細胞中的LDH、CK和AST活力顯著降低， 差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；同樣的， 與模型對照組比較， LY294002（30 μmol/L）預處理能夠減弱丹參水提物對心肌細胞中的LDH、CK和AST活力降低的效果， 差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）， 見表2。

2.3 與正常組比較， 模型組心肌細胞中的p-Akt蛋白表達水平顯著較低， 差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與缺氧-復氧模型組比較， 丹參水提物（0.2或0.4 g/L）預處理均能顯著增加心肌細胞中的p-Akt蛋白表達水平， 差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與丹參水提物（0.4 g/L）+缺氧-復氧組比較，LY294002（30 μmol/L）能夠降低丹參水提物對p-Akt蛋白的激活效果， 差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表3。

表1 丹參水提物對心肌細胞的存活率的影響（ x-±s， %）

表2 丹參水提物對LDH、CK和AST活力的影響（ x-±s）

表3 丹參水提物對AI和p-Akt水平的影響（ x-±s）

3 討論

目前缺血性心臟病的治療方法主要是進行心肌再灌注，以改善心肌的血流量， 對缺血心肌的早期再灌注治療是有益和必不可少的， 可以減輕缺血損傷， 挽救心肌細胞， 縮小梗死面積［4，5］。因此， 在復氧期給予抗凋亡干預可能有助于減少復氧所誘導的細胞損傷。

利用培養(yǎng)原代心肌細胞， 建立缺氧-復氧模型， 以心肌細胞培養(yǎng)基中LDH、CK、AST漏出量作為心肌細胞損傷的指標。LDH、CK、AST是心肌細胞胞內(nèi)酶， 漏出量的多少能反映細胞膜的受損程度［6］。實驗結(jié)果提示， 缺氧-復氧可以引起心肌細胞中LDH、CK、AST水平明顯增加， 導致心肌細胞存活率下降， 丹參水提物（0.2或0.4 g/L）和LY294002（30 μmol/L）預處理均能顯著降低心肌細胞中的LDH、CK、AST水平， 提高心肌細胞存活率。

Akt磷酸化可以抑制心肌細胞的壞死和凋亡， 保護心肌細胞， 對缺血性心臟病的治療具有重要意義［7］， 本研究進一步考察了丹參水提物對缺氧復氧損傷所致的心肌細胞Akt磷酸化的影響， 結(jié)果表明丹參水提物可顯著增加心肌細胞缺氧復氧損傷所致的 p-Akt蛋白表達， 這一效果可因Akt抑制劑LY294002的加入來減弱。

綜上所述， 認為丹參水提物可以通過激活Akt的磷酸化，從而保護心肌缺血再灌注過程中心肌細胞的損傷。

［1］ 肇毅， 潘立群.丹參促進創(chuàng)傷修復機制的研究現(xiàn)狀.南京中醫(yī)藥大學學報， 2000， 16（4）:253-254.

［2］ 史風雷， 任麗霞， 孫升云， 等.復方丹參注射液預防激素股骨頭壞死的初步研究.中醫(yī)正骨， 2002， 14（4）:3-5.

［3］ 李隆敏， 周櫻， 邵幸署， 等.丹參酮防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松.中國骨質(zhì)疏松雜志， 1996， 2（1）:78-80.

［4］ Jen-HweyChiu， Ya-Fang Cheng， Jir-YouWang， et al.Remotepharmacological preconditioning on median nerve territory increases Hsp32 expression and attenuates ischemia-reperfusion injury in rat heart.Life Sciences， 2012， 90（17-18）:629-639.

［5］ Jianbo Gao， Yi Kang， Jianshi Lou.The Optimal Strategy of Noninvasive Limb Ischemic Preconditioning for Protecting Heart Against Ischemia-Reperfusion Injury in Rats.Journal of Surgical Research， 2012， 174（2）:47-54.

［6］ Jing Guo， Shou-Bao Wang， Tian-Yi Yuan， et al.Coptisine protects rat heart against myocardial ischemia/reperfusion injury by suppressing myocardial apoptosis and inflammation.Atherosclerosis，2013， 231（2）:384-391.

［7］ Krisztina Kovacs， Ambrus Toth， Peter Deres， et al.Critical role of PI3-kinase/Akt activation in the PARP inhibitor induced heart function recovery during ischemia-reperfusion.Biochemical Pharmacology，2006， 71（4）:441-452.

Protective effect by Salvia Miltiorrhiza aqueous extract for hypoxia-reoxygenation damage in myocardial cells of suckling mice

ZHANG Dong-tao, HUANG Wei-zhe, CHEN Xi-shan.
Department of Cardiovascular Medicine, The First Affiliated Hospital of Medical College of Shantou University, Shantou 515041, China

To study the protective effect by Salvia Miltiorrhiza aqueous extract for hypoxia-reoxygenation damage in myocardial cells of suckling mice.The hypoxia-reoxygenation damage model was made from myocardial cells culture of suckling mice.Detection was taken on cells survival rate， leakage rates of lactate dehydrogenase （LDH）， creatine kinase （CK）， aspartate transaminase （AST）， and phosphorylation level of Akt of cells in different concentrations of Salvia Miltiorrhiza aqueous extract.Salvia Miltiorrhiza aqueous extract provides obviously protective effect for myocardial cells with hypoxia-reoxygenation damage， and that may be related with its activation of PI3K/Akt signal path.

Hypoxia-reoxygenation; Myocardial cells; Salvia miltiorrhiza aqueous extract

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.07.207

2014-11-05］

515041 汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科（張東濤）， 心胸外科（黃偉哲）；汕頭大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院心血管外科（陳喜珊）