張萬山，李 蔓，高 倩，王 辰，魏守剛

(1．首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院兒少衛(wèi)生與婦幼保健學(xué)系，北京 100069; 2．首都醫(yī)科大學(xué)，環(huán)境毒理學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069）

肥胖對(duì)小鼠肝臟鐵代謝調(diào)控分子hepcidin、lipocalin－2和ferroportin－1表達(dá)的影響

張萬山1，2，李 蔓1，2，高 倩1，2，王 辰1，2，魏守剛1，2

(1．首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院兒少衛(wèi)生與婦幼保健學(xué)系，北京 100069; 2．首都醫(yī)科大學(xué)，環(huán)境毒理學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069）

目的通過建立高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖動(dòng)物模型，觀察肥胖對(duì)小鼠肝臟中鐵代謝相關(guān)調(diào)控分子鐵調(diào)素(hepcidin）、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白－2(lipocalin－2，LCN2）和膜鐵輸出蛋白－1(ferroportin－1，F(xiàn)PN1）mRNA及蛋白表達(dá)的變化，初步探討肥胖影響肝臟鐵代謝相關(guān)分子表達(dá)調(diào)控的機(jī)制。方法將4～6周齡C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和膳食誘導(dǎo)的肥胖模型組，每組10只，對(duì)照組給予正常飼料喂養(yǎng)，肥胖組給予高脂飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)飼喂周期為15周。建模成功后取小鼠肝臟，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)小鼠肝臟中鐵代謝相關(guān)調(diào)控分子hepcidin、LCN2和FPN1 mRNA的表達(dá)，并應(yīng)用Western Blot法檢測(cè)小鼠肝臟LCN2和FPN1蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組小鼠比較，肥胖模型組小鼠肝臟hepcidin mRNA表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05），而LCN2和FPN1 mRNA及蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05）。結(jié)論肥胖可以顯著上調(diào)小鼠肝臟hepcidin的表達(dá)，而對(duì)肝臟鐵代謝相關(guān)調(diào)控分子LCN2和FPN1的表達(dá)并無顯著影響。故還不能夠認(rèn)為肥胖可以影響肝臟鐵代謝調(diào)控分子lipocalin－2和ferroportin－1的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞攝取及釋放鐵的能力發(fā)生障礙，使得機(jī)體對(duì)鐵的需求不能滿足要求，出現(xiàn)鐵代謝功能紊亂，導(dǎo)致肥胖性鐵缺乏的發(fā)生，而是通過上調(diào)肝臟hepcidin表達(dá)直接或間接影響其他鐵代謝相關(guān)調(diào)控分子或者存在更為復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，這仍需我們進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究及探索。這也為進(jìn)一步研究肥胖對(duì)肝臟鐵代謝相關(guān)調(diào)控分子表達(dá)的影響及引起鐵缺乏的機(jī)制提供了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

肥胖;鐵代謝;鐵調(diào)素;脂質(zhì)運(yùn)載蛋白－2;膜鐵輸出蛋白－1

隨著現(xiàn)代居住條件的改善、交通的發(fā)展、加之學(xué)習(xí)負(fù)擔(dān)的加重，學(xué)生進(jìn)行戶外活動(dòng)、體育鍛煉、做家務(wù)等身體活動(dòng)的時(shí)間越來越少，這就導(dǎo)致機(jī)體攝入的總能量與身體活動(dòng)消耗的總能量不平衡，使得我國兒童青少年超重和肥胖流行日趨嚴(yán)重，已經(jīng)成為影響我國兒童青少年身心健康的重要問題［1］。鐵是人體內(nèi)含量最豐富的必需微量元素，是維持生命的主要物質(zhì)之一，具有重要生理功能，兒童缺鐵除導(dǎo)致貧血外，還使運(yùn)動(dòng)能力低下、體溫調(diào)節(jié)不全、智力發(fā)育障礙、免疫力下降等。肥胖和鐵缺乏是我國乃至全球兒童面臨的兩大公共衛(wèi)生問題，許多研究提示肥胖存在著鐵代謝的異常，早在1960年代，就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)青少年血清鐵水平的下降與肥胖密切相關(guān)［2－3］，而近年來的許多研究發(fā)現(xiàn)，肥胖患者比正常體重人群更易發(fā)生鐵缺乏、缺鐵性貧血從而加重對(duì)健康的危害［4］，并且肥胖與鐵缺乏集于一身，會(huì)使兒童受到雙重健康危害［5］，例如運(yùn)動(dòng)能力下降和認(rèn)知功能受損程度遠(yuǎn)大于任何一種因素單獨(dú)存在時(shí)［6－8］。因此防治肥胖性鐵缺乏、缺鐵性貧血成為當(dāng)前急需解決的課題。

在機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中，hepcidin、lipocalin－2和ferroportin－1起著調(diào)節(jié)機(jī)體鐵代謝平衡的作用。hepcidin主要在肝細(xì)胞中合成，之后分泌至血液將體內(nèi)鐵需要的信號(hào)傳至小腸，參與機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)控［9］。ferroportin－1在脾和肝臟的巨噬細(xì)胞等都有表達(dá)，是重要的跨膜鐵輸出分子，參與機(jī)體的鐵吸收和巨噬細(xì)胞對(duì)鐵的再循環(huán)等過程［10］。lipocalin－2廣泛分布于人體各種組織，包括肺，肝臟的脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，lipocalin－2可結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)小分子鐵化合物到細(xì)胞膜，從而激活或抑制鐵應(yīng)答基因［11］。

目前有研究證實(shí)肥胖可以使小鼠十二指腸鐵代謝相關(guān)調(diào)控分子二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(divalent metal transporter 1，DMT1）和FPN1表達(dá)下降，進(jìn)而腸上皮細(xì)胞吸收和釋放鐵的能力減弱，造成機(jī)體不能滿足對(duì)鐵的需求，導(dǎo)致肥胖性鐵缺乏的發(fā)生［12］，然而有關(guān)肥胖對(duì)肝臟鐵代謝相關(guān)調(diào)控分子表達(dá)影響的機(jī)制研究較少，相關(guān)鐵代謝分子相互作用方式尚不清楚。因此本實(shí)驗(yàn)旨在通過構(gòu)建高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖動(dòng)物模型，觀察肥胖對(duì)肝臟鐵代謝相關(guān)調(diào)控分子hepcidin、LCN2和FPN1表達(dá)的影響，初步探討維持機(jī)體鐵代謝穩(wěn)態(tài)的分子調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步研究及有效預(yù)防和治療肥胖性鐵代謝障礙提供理論機(jī)制基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組及處理

健康野生型C57BL/6J小鼠4～6周齡20只(雌性），體重10～14 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(軍）2012－0004】。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(京）2010－0022】無特定病原體(specific－pathogen free，SPF）級(jí)動(dòng)物房。隨機(jī)分為兩組：高脂膳食組、普通膳食組，每組10只。普通膳食組飼以SPF級(jí)普通飼料，高脂膳食組飼以SPF級(jí)高脂飼料(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部生產(chǎn)）。高脂飼料配方為：豬油10%、基礎(chǔ)飼料79%、蛋黃粉10%、膽固醇1%。兩組小鼠均自由飲水，飼養(yǎng)期15周，每周稱量體重一次，比較兩組動(dòng)物體重差異并計(jì)算模型組動(dòng)物肥胖度，最終建立肥胖動(dòng)物模型。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，并經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)認(rèn)可。

建模成功后，用10%水合氯醛400 mg/kg體重腹腔注射麻醉小鼠并固定于固定板上，腹部采用75%酒精及碘伏消毒，行縱行切口開腹暴露腹腔，迅速取肝臟組織，使用生理鹽水沖洗后轉(zhuǎn)移至凍存管內(nèi)放入液氮中，隨后轉(zhuǎn)入－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RT-PCR法檢測(cè)小鼠肝臟hepcidin、LCN2和FPN1 mRNA表達(dá)量

取凍存組織80±5 g，用超純RNA提取試劑盒(CWbio．Co．Ltd，Cat#CW0581）提取總 RNA。取5μL RNA用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以檢測(cè)RNA的完整性。用DNaseⅠ試劑盒(CWbio．Co．Ltd，Cat# CW2090）對(duì)RNA中殘留的基因組DNA進(jìn)行消化處理。處理后的總RNA樣本用HiFi－MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒(CWbio．Co．Ltd，Cat#CW0744）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，嚴(yán)格按照使用說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

應(yīng)用 ABI 7500型熒光定量 PCR儀(美國Applied Biosystems公司），按照Ultra SYBR Mixture PCR試劑盒(With ROX）(CWbio．Co．Ltd，Cat# CW0956）進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL：2× UltraSYBR Mixture 10 μL，上游引物0．4 μL(濃度10μM/mL），下游引物0．4 μL(濃度10 μM/mL），cDNA 2μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min，(95℃15 s，60℃ 60 s）×45個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本同時(shí)做3個(gè)重復(fù)。β－actin上游引物序列為 5'－GCC TTC CTT CTT GGG TAT－3'，下游引物序列為5'－GGC ATA GAG GTC TTT ACG G－3'，hepcidin上游引物序列為5'－TGC CTG TCT CCT GCT TCT CCT CC－3'，下游引物序列為5'－TCG CAA TGT CTG CCC TGC TTT C－3'，lipocalin－2上游引物序列為5'－CAC GGA CTA CAA CCA GTT CG－3'，下游引物序列為5'－TGA TGT TGT CGT CCT TGA GG－3'，ferroportin－1上游引物序列為5'－CCC TTC CGC ACT TTC CGA AT－3'，下游引物序列為5'－GAG AAT AGA CCA GTC CGA ACA AGG C－3'。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2－△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析，即△Ct=Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因;△△CT=△Ct實(shí)驗(yàn)組－ △Ct基準(zhǔn)組。

1.3 Western Blot法檢測(cè)小鼠肝臟LCN2和FPN1蛋白表達(dá)量

應(yīng)用RIPA試劑提取小鼠肝臟組織蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，并用RIPA試劑調(diào)整蛋白濃度為4 mg/mL，煮沸變性5 min。根據(jù)目的蛋白的分子量，配制12%的分離膠，待檢測(cè)蛋白樣品上樣量為20 μg/孔，300 mA恒流，轉(zhuǎn)移至0．45 μm孔徑NC膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間1 h，轉(zhuǎn)膜完成后麗春紅染色試劑對(duì)膜進(jìn)行染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果。將膜完全浸沒3%BSATBST中室溫輕搖30 min進(jìn)行封閉，然后加入兔抗LCN2、FPN1多克隆抗體(英國 Abcam公司，1∶2000）室溫孵育10 min，放4℃過夜。第二天取出膜使用TBST洗膜5次(3 min/次）后加入1∶5000辣根過氧化物酶(HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L）抗體(北京天德悅生物科技有限公司）室溫輕搖40 min，洗膜6次(3 min/次），使用ECL加到膜上后反應(yīng)3～5 min，膠片曝光，顯影 2 min，定影。以GAPDH鼠單抗作為內(nèi)參，重復(fù)試驗(yàn)3次。膠片曝光結(jié)果掃描輸入計(jì)算機(jī)后，用Totallab quant凝膠定量分析軟件進(jìn)行處理，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的積分光密度(integral optical density，IOD）比值表示相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 肥胖動(dòng)物模型的構(gòu)建

肥胖動(dòng)物模型組與對(duì)照組小鼠，分別飼喂高脂飼料及普通飼料，每周稱量體重，自第三周起肥胖模型組小鼠體重較對(duì)照組小鼠體重出現(xiàn)明顯增長，具有顯著性差異，且隨著干預(yù)時(shí)間延長，兩組的體重差異逐漸增大，至干預(yù)第15周，肥胖模型組和對(duì)照組小鼠平均體重分別為34．08±1．28 g和24．50 ±0．85 g(圖1）。依據(jù)肥胖度計(jì)算公式計(jì)算肥胖模型組每只小鼠的肥胖度：肥胖度(%）=(模型組實(shí)際體重 －對(duì)照組平均體重）/對(duì)照組平均體重 × 100%，結(jié)果肥胖模型組全部小鼠體重均高于對(duì)照組小鼠平均體重的20%，且最輕體重小鼠肥胖度為27．65%，故可以判定肥胖動(dòng)物模型建立成功。

2.2 RT-PCR相對(duì)定量結(jié)果分析

通過超純RNA提取試劑盒提取小鼠肝臟組織樣本中總RNA后，利用分光光度計(jì)檢測(cè)提取RAN的純度，結(jié)果表明各樣本的OD值A(chǔ)260/280均處于1．9～2．1之間，說明RNA純度較高。分別取5 μL各樣本 RNA用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以檢測(cè)RNA的完整性，可見28s rRNA、18s rRNA和5s rRNA三條條帶，無明顯拖帶，且28S條帶相比18S的條帶亮度高2倍，說明RNA完整性好，沒有被降解(圖2）。

圖1 肥胖模型組與對(duì)照組小鼠各周平均體重Fig．1 Body weight in different weeks of different groups

圖2 肝臟樣本RNA凝膠電泳圖Note：1，2，3：control group;4，5，6：model group．Fig．2 The gel electrophoresis figure of the liver RNA

應(yīng)用ABI 7500型熒光定量PCR儀，分別對(duì)內(nèi)參基因引物和目的基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)在60℃～95℃進(jìn)行融解曲線分析，儀器自動(dòng)繪制出對(duì)應(yīng)的內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線和目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2）均達(dá)到0．99，說明線性相光度很高，且擴(kuò)增效率均在90%以上，溶解曲線呈單峰，即各基因均為特異性擴(kuò)增。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR原始檢測(cè)結(jié)果，按照2－△△ct相對(duì)定量計(jì)算公式，計(jì)算出各樣品的目的基因相對(duì)定量結(jié)果。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析可知，與對(duì)照組比較，肥胖模型組小鼠 hepcidin mRNA的相對(duì)表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05），而LCN2和FPN1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0．05）(圖3）

2.3 Western Blot相對(duì)定量結(jié)果分析

小鼠肝臟樣本進(jìn)行目的蛋白的Western Blot檢測(cè)，所得膠片掃描結(jié)果見圖4。利用分析軟件進(jìn)行

每個(gè)條帶的灰度值分析，然后利用目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參蛋白的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果即為樣本目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，由圖5可知模型組小鼠與對(duì)照組小鼠目的蛋白LCN2和FPN1的相對(duì)表達(dá)量差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05）。

圖3 兩組小鼠肝臟LCN2、FPN1和hepcidin mRNA相對(duì)表達(dá)量Note：*compared with control group P＜0．05，#compared with control group P＞0．05．Fig．3 The mRNA relative expression of LCN2，F(xiàn)PN1 and hepcidin in liver of two group mice

圖4 Western Blot膠片掃描條帶Fig．4 The film scanning strip of western blot

圖5 兩組小鼠肝臟LCN2和FPN1蛋白的相對(duì)表達(dá)量Note：#compared with control group P ＞0．05．Fig．5 The protein relative expression of LCN2 and FPN1 in liver of the two groups mice

3 討論

肥胖是指進(jìn)食熱量多于身體消耗量并以脂肪形式儲(chǔ)存于體內(nèi)，當(dāng)體脂增加使體質(zhì)量超過標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量20%或BMI＞24 kg/m者稱為肥胖癥。肥胖癥是多種慢性非傳染性疾病的危險(xiǎn)因子，如高血壓、糖尿病、冠心病、腦血管疾病、慢性腎臟病等，同時(shí)也給社會(huì)帶來了巨大的疾病負(fù)擔(dān)。因此，防治肥胖癥具有十分重要的意義。肥胖動(dòng)物模型是研究肥胖及其相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制的主要工具，其中與人類肥胖最為接近的高脂飲食誘導(dǎo)營養(yǎng)性肥胖動(dòng)物模型的應(yīng)用最為廣泛［13］，而在國內(nèi)外很多相關(guān)研究中，由于C57BL/6J小鼠對(duì)高脂飲食又較為敏感，故常被采用。因此，本實(shí)驗(yàn)采用C57BL/6J小鼠作為研究對(duì)象建立高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖動(dòng)物模型，以高脂組體質(zhì)量超過對(duì)照組平均體質(zhì)量20%，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義為標(biāo)準(zhǔn)，判斷肥胖動(dòng)物模型是否構(gòu)建成功。

在機(jī)體整體鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中，體內(nèi)鐵的代謝平衡主要依靠腸道對(duì)鐵吸收的調(diào)節(jié)，而在分子水平，機(jī)體內(nèi)鐵的平衡則主要依賴于多種鐵代謝調(diào)節(jié)分子調(diào)控的影響，如腸鐵吸收和釋放鐵主要依賴于十二指腸上皮細(xì)胞的鐵相關(guān)蛋白的介導(dǎo)，而其中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的分子為DMT1和FPN1，并有研究證實(shí)在肥胖狀態(tài)下DMT1和FPN1表達(dá)下降，使得腸上皮細(xì)胞吸收和釋放鐵的能力減弱，造成機(jī)體不能滿足對(duì)鐵的需求，導(dǎo)致肥胖性鐵缺乏的發(fā)生［12］。然而在肥胖狀態(tài)下，是否也存在對(duì)肝臟中鐵代謝相關(guān)調(diào)控分子hepcidin、LCN2和FPN1類似的調(diào)控機(jī)制和結(jié)果呢?目前國內(nèi)外有關(guān)肥胖對(duì)肝臟鐵代謝相關(guān)調(diào)控分子影響及相互作用機(jī)制的研究還不甚清楚。作為機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)因子，hepcidin、LCN2和FPN1起著調(diào)節(jié)機(jī)體鐵代謝平衡的作用。hepcidin是2000年發(fā)現(xiàn)的一種在肝臟合成并富含半胱氨酸的抗菌多肽，之后分泌至血液，將體內(nèi)鐵需要的信號(hào)傳至小腸，參與機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)控，其表達(dá)受機(jī)體信號(hào)因子以及炎癥、低氧等疾病狀態(tài)的影響［14］，hepcidin是主要的鐵調(diào)節(jié)激素，炎癥性貧血的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑、鐵代謝和固有免疫之間聯(lián)系的橋梁，在機(jī)體鐵代謝平衡的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。Pigeon等［15］在尋找與小鼠肝鐵負(fù)荷增多相關(guān)基因時(shí)，明確鐵調(diào)素是機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控中一種重要的調(diào)節(jié)因子。FPN1(2000年發(fā)現(xiàn)）在成熟的十二指腸絨毛上皮細(xì)胞基底面、脾和肝的巨噬細(xì)胞等都有表達(dá)，是一種重要跨膜的鐵輸出蛋白，是鐵離子釋放的唯一出口，負(fù)責(zé)將細(xì)胞內(nèi)的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，有研究表明，hepcidin表達(dá)增加時(shí)，可結(jié)合FPN1，促使其在溶酶體內(nèi)內(nèi)化和降解，從而有效阻止細(xì)胞內(nèi)鐵的排出;相反，hepcidin表達(dá)減少時(shí)，以允許大部分鐵通過FPN1流出，來維持細(xì)胞外正常的鐵濃度［16］。LCN2主要是由脂肪組織分泌的脂肪細(xì)胞因子之一，廣泛分布于人體各種組織，包括肺、肝臟、胸腺、腎臟、小腸、脂肪細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞，有研究發(fā)現(xiàn)肝臟以及脂肪組織可能是肥胖狀態(tài)下循環(huán)中過多的LCN2的主要來源，LCN2具有鐵代謝相關(guān)運(yùn)鐵蛋白功能，可結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)小分子鐵化合物到細(xì)胞膜，從而激活或抑制鐵應(yīng)答基因，體外研究也證明，LCN2能增強(qiáng)細(xì)胞鐵吸收能力［17］。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖動(dòng)物模型，觀察肥胖對(duì)肝臟鐵代謝相關(guān)調(diào)控分子hepcidin、LCN2和FPN1表達(dá)的影響，初步探討維持機(jī)體鐵代謝穩(wěn)態(tài)的分子調(diào)控機(jī)制。本次實(shí)驗(yàn)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR結(jié)果表明，肥胖模型組小鼠肝臟hepcidin表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，而hepcidin作為一種肝臟分泌的負(fù)性鐵調(diào)節(jié)因子，Nicolas等［18］發(fā)現(xiàn)USF2基因敲除的小鼠，其下游的hepcidin基因不表達(dá)，造成肝臟和胰臟鐵大量積累，并與遺傳血色病(hereditary haemochromatosis，HH）、HFE、β2－M缺陷小鼠相似 (Fleming 2001，Ahmad 2002）;然而hepcidin轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟，由于過早、過多的表達(dá)hepcidin，導(dǎo)致了鐵的嚴(yán)重缺乏而造成貧血。且近期的一項(xiàng)研究也證實(shí)肥胖會(huì)下調(diào)機(jī)體十二指腸DMT1和FPN1的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致鐵吸收不良［12］，因此可以證明肥胖可以顯著上調(diào)肝臟hepcidin的表達(dá)，進(jìn)而造成機(jī)體鐵代謝功能紊亂，造成鐵缺乏的發(fā)生。而肝臟鐵代謝相關(guān)調(diào)控分子LCN和FPN1的表達(dá)水平在模型組與對(duì)照組間并無顯著性差異，表明肝細(xì)胞攝取及釋放鐵的能力并無明顯變化，故還不能夠認(rèn)為肥胖可以影響肝臟鐵代謝調(diào)控分子LCN2和FPN1的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞攝取及釋放鐵的能力發(fā)生障礙，使得機(jī)體對(duì)鐵的需求不能滿足要求，出現(xiàn)鐵代謝功能紊亂，導(dǎo)致肥胖性鐵缺乏的發(fā)生，而可能是通過上調(diào)肝臟hepcidin表達(dá)直接或間接影響其他鐵代謝相關(guān)調(diào)控分子或者存在更為復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，這仍需我們進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究及探索。這也為進(jìn)一步研究肥胖對(duì)肝臟鐵代謝相關(guān)調(diào)控分子表達(dá)的影響及引起鐵缺乏的機(jī)制提供了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

［1］馬軍，蔡賜河，王海?。?985－2010年中國學(xué)生超重與肥胖流行趨勢(shì)［J］．中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2012，46(9）：776－780．

［2］Wenzel B J，Stults H B，Mayer J．Hypoferraemia in obese adolescents［J］．The Lancet，1962，280(7251）：327－328．

［3］SELTZER C C，MAYER J．Serum Iron and Iron－Binding Capacity in Adolescents II．Comparison of Obese and Nonobese Subjects［J］．The American Journal of Clinical Nutrition，1963，13(6）：354－361．

［4］Nead K G，Halterman J S，Kaczorowski J M，et al．Overweight children and adolescents：a risk group for iron deficiency［J］．Pediatrics，2004，114(1）：104－108．

［5］Manios Y，Moschonis G，Chrousos G P，et al．The double burden of obesity and iron deficiency on children and adolescents in Greece：the Healthy Growth Study［J］．Journal of Human Nutrition＆Dietetics，2013，26(5）：470–478．

［6］Cepeda－Lopez A C，Osendarp S J M，Melse－Boonstra A，et al．Sharply higher rates of iron deficiency in obese Mexican women and children are predicted by obesity－related inflammation rather than by differences in dietary iron intake［J］．The American journal of clinical nutrition，2011，93(5）：975－983．

［7］Saloojee H，Pettifor J M．Iron deficiency and impaired child development：the relation may be causal，but it may not be a priority for intervention［J］．BMJ：British Medical Journal，2001，323(7326）：1377．

［8］Farr S A，Yamada K A，Butterfield D A，et al．Obesity and hypertriglyceridemia produce cognitive impairment［J］．Endocrinology，2008，149(5）：2628－2636．

［9］付麗娟，段相林，錢忠明，等．鐵代謝與鐵調(diào)素 hepcidin［J］．生理科學(xué)進(jìn)展，2005，36(3）：233－236．

［10］李靜，錢忠明，常彥忠，等．膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ferroportin 1的研究進(jìn)展［J］．生理科學(xué)進(jìn)展，2005，35(4）：349－351．

［11］Wu G，Li H，Zhou M，et al．Mechanism and clinical evidence of lipocalin－2 and adipocyte fatty acid－binding protein linking obesity and atherosclerosis［J］．Diabetes/metabolism Research＆Reviews，2013，30(6）：447－456．

［12］高倩，李蔓，張萬山，等．肥胖對(duì)小鼠十二指腸 DMT1和FPN1表達(dá)的影響［J］．中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2014，24(9）：18－22．

［13］湯錦花，嚴(yán)海東．營養(yǎng)性肥胖大鼠模型的建立及評(píng)價(jià)［J］．同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2010，31(1）：32－34．

［14］Rochette L，Gudjoncik A，Guenancia C，et al．The ironregulatory hormone hepcidin：A possible therapeutic target［J］．Pharmacology＆Therapeutics，2014：35－52．

［15］Pigeon C，Ilyin G，Courselaud B，et al．A new mouse liverspecificgene， encoding a protein homologous to human antimicrobial peptide hepcidin，is overexpressed during iron overload［J］．Journal of biological chemistry，2001，276(11）： 7811－7819．

［16］王書敏，于鵬，段相林，等．膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1，鐵調(diào)素的靶分子［J］．生物物理學(xué)報(bào)，2006，22(1）：12－18．

［17］Wang Y，Lam K S L，Kraegen E W，et al．Lipocalin－2 is an inflammatory marker closely associated with obesity，insulin resistance， and hyperglycemia in humans［J］． Clinical chemistry，2007，53(1）：34－41．

［18］G N，M B，I D，et al．Lack of hepcidin gene expression and severe tissue iron overload in upstream stimulatory factor 2( USF2） knockout mice［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences，2001，98(15）：8780－8785．

Effects of obesity on the expression of hepcidin，lipocalin-2 and ferroportin-1 related with iron metabolism of mice’s liver

ZHANG Wan－shan1，2，LI Man1，2，GAO Qian1，2，WANG Chen1，2，WEI Shou－gang1，2
(1．Department of Maternal，Child and Adolescent Health，School of Public Health，Capital Medical University，Beijing 100069，China; 2．Beijing Key Laboratory of Environmental Toxicology，Capital Medical University，Beijing 100069，China）

Objective We established the animal models of obesity induced by high－fat diet，in order to study the mRNA and protein expression of regulation molecules related with iron metabolism about hepcidin，lipocalin－2(LCN2），ferroportin－1(FPN1）in obese mice’s liver and the molecular regulation mechanism．Methods C57BL/6J(4～6 weeks）mice were randomly divided into control group and obesity model group，each group of ten．The obesity group were fed with a high－fat diet and the control group were given the normal diet for lasting 15 weeks．After we successfully established the obesity animal model，the expression level of hepcidin，LCN2 and FPN1 mRNA in the liver were measured by Real－time fluorescent quantitative PCR method and the protein expression level of LCN2 and FPN1 were measured by Western－Blot．Results Compared with the control group，the expression level of hepcidin mRNA in the liver was increased in obesity group(P＜0．05），however，the expression level of LCN2，F(xiàn)PN1 was no significant difference(P＞0．05）．Conclusion Obesity can increase the expression of hepcidin mRNA，however，there was no significantly effect on the expression of LCN2，F(xiàn)PN1．So，we can’t think that obesity can affect the expression of LCN2 and FPN1，lead to the ability of cells uptake and release iron abnormal，then appear iron metabolism disorders．As a result，leading to iron deficiency．Maybe obesity can affect other regulatory molecules related with iron metabolism through up－regulation the expression of Hepcidin or the more complex regulatory mechanisms．We still need further experimental research and exploration．This research also provides the basis of theoretical and experimental for the further study the effects of obesity on the expression of regulation molecules related with iron metabolism in obesity mice’s liver and the mechanism of iron deficiency．

Obesity;Iron metabolism;Hepcidin;Ferroportin－1;Lipocalin－2

R－332

A

1671－7856(2015）07－0001－06

10．3969．j．issn．1671．7856．2015．007．001

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81373020）;北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(7112014）。

張萬山(1987－），男，碩士，主要從事肥胖與鐵缺乏及肝臟鐵代謝相關(guān)調(diào)控分子影響機(jī)制的研究，E－mail：wanshan0822@ 163．com。

魏守剛(1965－），男，教授，主要從事兒童期慢性病預(yù)防控制，E－mail：shangwei@ccmu．edu．cn。

2015－07－02