劉 靜，何嘉玲，暴 國(guó)，李 楠，王天奇，張長(zhǎng)勇，孫德明

（1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；2.國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081）

應(yīng)用TALEN技術(shù)敲除gata4基因建立斑馬魚先天性心臟病模型

劉 靜1，2，何嘉玲2，暴 國(guó)2，李 楠2，王天奇2，張長(zhǎng)勇2，孫德明2

（1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；2.國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081）

目的人工構(gòu)建TALEN靶向敲除載體敲除gata4基因，建立斑馬魚先天性心臟病動(dòng)物模型。方法

采用單元組裝法構(gòu)建靶向敲除gata4基因的載體，將其體外轉(zhuǎn)錄成TALEN mRNAs，通過顯微注射的方式注入單細(xì)胞期受精卵中，胚胎檢測(cè)TALEN的敲除效率，再通過剪尾、酶切、測(cè)序篩選發(fā)生基因突變的斑馬魚及突變的類型。結(jié)果 酶切、測(cè)序結(jié)果證實(shí)成功構(gòu)建出正確的gata4靶向敲除載體，注入斑馬魚受精卵中，發(fā)生基因敲除的效率為35.18％，通過剪尾、PCR、酶切檢測(cè)成功地篩選出了發(fā)生基因突變的斑馬魚，測(cè)序結(jié)果顯示出不同種類的gata4基因突變。結(jié)論 成功構(gòu)建gata4基因敲除的斑馬魚動(dòng)物模型，為進(jìn)一步研究人類gata4基因突變引起先天性心臟病的發(fā)病機(jī)制提供了良好的動(dòng)物模型。

TALEN；gata4基因；斑馬魚；模型，動(dòng)物；先天性心臟病

先天性心臟?。╟ongenital heart disease，CHD）是由于胚胎發(fā)育過程中心臟、血管發(fā)育異常而導(dǎo)致心臟、血管在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能和代謝方面發(fā)生異常的一大類疾病，是人類極為普遍和具有破壞性的出生缺陷，發(fā)病率約占活產(chǎn)嬰兒的0.8％［1］，嚴(yán)重危害胎兒、新生兒、嬰幼兒及兒童健康。目前認(rèn)為該病的病因包括環(huán)境和遺傳兩個(gè)主要因素，約120種單基因被鑒定與先天性心臟病的發(fā)生有關(guān)。作為一種多因素疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。因此通過反向遺傳學(xué)手段，建立先天性心臟病的基因敲除動(dòng)物模型，探索該病的致病機(jī)制具有重要意義。斑馬魚的基因組與人類基因組相似度達(dá)87％，結(jié)構(gòu)上具有與人類相似的心房、心室、心臟瓣膜結(jié)構(gòu)以及心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)［2，3］，且斑馬魚體積小、易于飼養(yǎng)、胚胎透明易于觀察、體外受精、產(chǎn)卵能力強(qiáng)、有利于進(jìn)行遺傳操作，是構(gòu)建先天性心臟病的理想動(dòng)物模型。

基因敲除技術(shù)的傳統(tǒng)方法是基于胚胎干細(xì)胞技術(shù)和同源重組技術(shù)，但是這種方法效率極低、過程繁瑣，且對(duì)于像斑馬魚這種無法建立胚胎干細(xì)胞系的 物 種 無 法 實(shí) 施［4］。TALEN（transcription activator-like effector nuclease）技術(shù)是類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶介導(dǎo)的靶向修飾技術(shù)，通過組裝蛋白模塊識(shí)別靶序列，每?jī)蓚€(gè)氨基酸即可識(shí)別一個(gè)堿基，實(shí)現(xiàn)了對(duì)基因組的任意編輯，是先進(jìn)的基因編輯技術(shù)。目前缺乏TALEN技術(shù)用于斑馬魚研究先天性心臟病的相關(guān)基因的功能。

鋅指轉(zhuǎn)錄因子4（gata4）是gata轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，具有與特定DNA結(jié)合的鋅指結(jié)構(gòu)域，在進(jìn)化過程中高度保守，同時(shí)在心臟發(fā)育過程中起重要作用。研究表明，gata4與其他的轉(zhuǎn)錄因子一起調(diào)控心肌中一些特異基因的表達(dá)，對(duì)心肌細(xì)胞的形成以及心前細(xì)胞的遷移和分化、心瓣膜及間隔發(fā)育等具有重要作用。gata4基因突變會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物和人出現(xiàn)心臟發(fā)育異常，形態(tài)學(xué)上以瓣膜缺損為主要表現(xiàn)［5］。目前尚無較好的動(dòng)物模型適用于機(jī)制研究，因此本研究采用TALEN技術(shù)對(duì)斑馬魚的gata4基因進(jìn)行敲除，建立斑馬魚先天性心臟病動(dòng)物模型，為先天性心臟病的遺傳基礎(chǔ)研究提供重要的動(dòng)物模型。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)選取AB系野生型斑馬魚，為實(shí)驗(yàn)室常用的近交系品種［6］。

1.2 質(zhì)粒

TALE基本單元模塊載體質(zhì)粒及pCS2-Fok I表達(dá)載體質(zhì)粒：均為氨芐青霉素（Amp）抗性，而表達(dá)載體質(zhì)粒需成對(duì)使用（pCS2-PEAS系列和 pCS2-PERR系列配對(duì)），由本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒由北京大學(xué)生命科學(xué)院細(xì)胞增殖與分化實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并饋贈(zèng)［7］。

1.3 引物

實(shí)驗(yàn)過程中需要使用的引物見表1，包括擴(kuò)增gata4基因和構(gòu)建和檢測(cè)TALEN載體時(shí)所需的引物。引物由北京諾塞基因組研究中心有限公司合成。

1.4 主要試劑

Takara限制性內(nèi)切酶：Spe I、Nhe I、Hind III、Sac II、Hae II。

試劑盒：質(zhì)粒小提試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、DNA連接試劑盒、T載體試劑盒、SP6 mMESSAGE mMACHINE Kit、2×Taq Master Mix（不含染料）、堿性磷酸酶（CIAP）、50 mM NaOH、1 M Tris-HCl（pH 8.0）、70％乙醇、超純水（雙蒸水，18 MΩ）

2 方法

2.1 斑馬魚飼養(yǎng)與繁殖

野生型斑馬魚飼養(yǎng)于自動(dòng)水循環(huán)系統(tǒng)中，溫度穩(wěn)定在28.5±0.5℃，pH 7.2～7.5，每日固定光照時(shí)間14 h［8］，喂食新鮮孵化的豐年蝦。剛剛孵化的斑馬魚不需喂食，第5天后開始喂食草履蟲，兩周后開始喂食豐年蝦，3個(gè)月左右可性成熟。繁殖時(shí)，交配前一晚放入配魚缸內(nèi)，雌魚與雄魚之間用擋板隔開；第二天早上，將中間的擋板抽出，可觀察到追尾現(xiàn)象，大約30 min后可以開始收集斑馬魚受精卵。

2.2 TALEN敲除載體的構(gòu)建

2.2.1 斑馬魚gata4基因的提取與靶點(diǎn)選擇：采用簡(jiǎn)易DNA提取法提取斑馬魚魚尾或胚胎的基因組DNA。過程如下：將魚尾或胚胎（20條魚尾或20個(gè)胚胎）吸到PCR管中，每管加入20 μL 50 mM NaOH溶液；使用PCR儀加熱裂解，程序：95℃ 10 min，4℃10 min，取出后 vortex振蕩均勻，重復(fù)一次；加入2 μL體積1M Tris（pH 8.0）混勻即為提取的基因組DNA。

斑馬魚gata4基因定位于第20號(hào)染色體上，結(jié)構(gòu)基因由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成。根據(jù)TALEN靶點(diǎn)選擇的原則［7］和文獻(xiàn)的報(bào)道［1，5］，本研究針對(duì)gata4基因的第一外顯子設(shè)計(jì)了一對(duì)靶點(diǎn)，如圖1所示，提取魚尾DNA后測(cè)序確認(rèn)靶點(diǎn)的唯一性。測(cè)序均由北京諾塞基因組研究中心有限公司完成。

表1 實(shí)驗(yàn)過程中需要使用的引物Tab.1 Primers used in this experiment

圖1 基因敲除靶點(diǎn)圖Note.A.Genomic organization of gata4 gene；B.The sequences for our designed TALENs；Left：Left binding sequence；Right：Right binding sequence.Fig.1 The recognition sequences of the target genes

2.2.2 TALEN表達(dá)載體的構(gòu)建：根據(jù)設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)，按照“單元組裝法”構(gòu)建TALEN質(zhì)粒［7］。將TALE基本單元模塊載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞TOP菌種中；大量搖活含有質(zhì)粒的大腸桿菌后，采用天根的質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒；將質(zhì)粒經(jīng)酶切后（Spe I、Nhe I、Hind III）進(jìn)行回收、轉(zhuǎn)化、連接反應(yīng)，通過菌液PCR篩選出連接成功的質(zhì)粒后，進(jìn)入下一輪反應(yīng)；經(jīng)過幾輪酶切、切膠回收及連接反應(yīng)，直至完成所需要的兩側(cè)半位點(diǎn)的TALE重復(fù)序列，其中每輪的連接后都需要進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)；再將TALE重復(fù)序列與pCS2載體連接，構(gòu)建出最終的pCS2-TALEN表達(dá)載體質(zhì)粒，酶切檢測(cè)片段連接情況后，采用SP6測(cè)序確認(rèn)。

2.2.3 TALENs質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄：先用Sac II將獲得的TALENs質(zhì)粒線性化，電泳確定線性化完全后，采用快速DNA回收試劑盒直接回收線性化DNA；采用SP6體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行TALENs體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；將體外轉(zhuǎn)錄后得到的mRNA采用氯化鋰沉淀的方式回收，利用NanoDrop檢測(cè)mRNA濃度和質(zhì)量，凍于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 構(gòu)建斑馬魚先天性心臟病動(dòng)物模型

2.3.1 TALEN體內(nèi)活性檢測(cè)：注射前，按照200 pg/nL、300 pg/nL、400 pg/nL的不同濃度將左、右半位點(diǎn)的一對(duì)mRNA混合，加入酚紅指示劑和雙蒸水配制成4 μL體系后注入斑馬魚單細(xì)胞受精卵中［8］；不同濃度mRNAs作為實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)濃度注射100枚胚胎，同時(shí)將含有相同濃度的酚紅指示劑和雙蒸水配制成的4 μL體系作為對(duì)照組，將未注射的胚胎作為空白組，對(duì)照組和空白組各20枚胚胎，得到F0胚胎；24 h后顯微鏡下取出表型正常的胚胎，5個(gè)胚胎為一組，共取8組胚胎，總共40個(gè)胚胎，提取其基因組DNA。以G4-F和G4-R引物擴(kuò)增胚胎gata4基因，并使用Hae II酶切檢測(cè)PCR產(chǎn)物。如果未注射胚胎的PCR產(chǎn)物能夠全部被切開，注射胚胎的PCR產(chǎn)物中有完整的、未切開的PCR條帶，則說明靶點(diǎn)可能發(fā)生了突變。將未切開的條帶回收，連入T載體，測(cè)序鑒定靶點(diǎn)的突變情況。未切開條帶占所有條帶的熒光亮度的百分比可大致反映TALEN的突變效率。

2.3.2 斑馬魚TALEN突變體篩選：將注射后的斑馬魚飼養(yǎng)至3個(gè)月后，逐條進(jìn)行剪尾檢測(cè)突變情況，酶切、測(cè)序分析其發(fā)生敲除的基因型的變化。

3 結(jié)果與分析

3.1 gata4基因擴(kuò)增與敲除靶點(diǎn)比對(duì)

以提取的斑馬魚魚尾DNA為模板，G4-F和G4-R為引物，PCR法擴(kuò)增gata4基因后，進(jìn)行1.2％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2（A）所示，b和c泳道中可見擴(kuò)增出明亮且較特異的條帶，分子量約為550 bp，為擴(kuò)增出的gata4基因。圖中稍微存在一點(diǎn)非特異性條帶，在后續(xù)的測(cè)序中可以通過回收去除非特異性條帶。將PCR產(chǎn)物送測(cè)序，結(jié)果如圖2（B）所示，從測(cè)序圖上可以看出，測(cè)序底峰低，說明樣品條帶單一、結(jié)果真實(shí)可信；再將此測(cè)序結(jié)果與網(wǎng)站上的gata4參考序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果如圖2（C）所示，黑色方框內(nèi)顯示的是設(shè)計(jì)敲除靶點(diǎn)的左、右半位點(diǎn)，敲除靶點(diǎn)單一且不存在SNP位點(diǎn)，符合敲除靶點(diǎn)的要求。

3.2 TALEN載體構(gòu)建與鑒定

根據(jù)設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)，需要構(gòu)建出兩個(gè)TALEN表達(dá)載體。先要分別構(gòu)建出識(shí)別左、右半位點(diǎn)的TALE重復(fù)序列載體，再與pCS2載體連接，形成最終的表達(dá)載體。TALE重復(fù)序列載體需要通過菌液PCR鑒定和測(cè)序確認(rèn)。菌液PCR采用M13-47、RV-M引物。左半位點(diǎn)的TALE重復(fù)序列為16單元體，產(chǎn)物分子量約為1800 bp，右半位點(diǎn)的TALE重復(fù)序列為18單元體，產(chǎn)物分子量約為2000 bp，見圖3（A）。測(cè)序結(jié)果顯示載體 TALE重復(fù)序列連接正確。TALEN終表達(dá)載體需要通過菌液PCR和酶切檢測(cè)TALE重復(fù)序列的連入情況。菌液PCR的上游引物：左半位點(diǎn)為C-For，右半位點(diǎn)為T-For，下游引物為63 dn，進(jìn)行菌液PCR后觀察條帶擴(kuò)增情況。連接方向正確能擴(kuò)增出條帶，否則無法擴(kuò)增出條帶。電泳結(jié)果如圖3（C）所示，1和2為左半位點(diǎn)連接正確的菌落，擴(kuò)增出四個(gè)條帶；3、4、7為右半位點(diǎn)連接正確的菌落，擴(kuò)增出兩個(gè)條帶。酶切（Nhe I、Kpn I）檢測(cè)結(jié)果如圖3（B）所示，酶切產(chǎn)物為2 kb、5 kb兩條帶，說明TALE重復(fù)序列連接正確。測(cè)序結(jié)果顯示左、右半位點(diǎn)的TALEN終表達(dá)載體構(gòu)建完成。

圖2 靶點(diǎn)確認(rèn)與比對(duì)圖Note.（A）The PCR-amplified gata4；M：DNA marker，1-2：PCR amplification products；3：Control（B）gata4 sequenced diagram；（C）.The PCR amplification products compared with reference sequencesFig.2 Confirmation and comparison of the target genes

圖3 TALE重復(fù)片段及終載體鑒定圖Note.（A）Identification of TALEs by colony PCR；1：Right binding site；2：Left binding site；（B）Identification of TALENs by restriction enzyme；1-5：The constructed TALEN vectors；M：DNA marker；（C）Identification of the TALEN vectors constructed by colony PCR；1-4，7：Positive results；5，6，8-12：Negative results；M：DNA markerFig.3 Identification of TALEs and TALENs

3.3 構(gòu)建斑馬魚先天性心臟病動(dòng)物模型

3.3.1 TALEN體內(nèi)活性檢測(cè)：酶切檢測(cè)TALEN突變效率的結(jié)果如圖4所示，對(duì)照組胚胎的PCR產(chǎn)物能夠完全被切開，產(chǎn)生兩條帶；2為mRNAs注射劑量為200 pg/nL組，PCR產(chǎn)物能完全被切開產(chǎn)生兩條帶；4、5為mRNAs注射劑量為300 pg/nL、400 pg/nL組，存在分子量與gata4基因PCR擴(kuò)增片段大小相似的未切開條帶，說明靶點(diǎn)可能發(fā)生了突變。通過軟件分析電泳條帶的灰度可以大致反映TALEN的突變效率，結(jié)果如表2。從表中結(jié)果可以看出，TALEN的敲除效率隨著注射mRNAs的濃度升高而增加。

表2 不同TALEN mRNA注射濃度酶切檢測(cè)的效率Tab.2 The efficiency of TALENs by different injection concentrations

圖4 酶切檢測(cè)PCR產(chǎn)物電泳圖Note.M：DNA marker；1：Control；2，4，5：Injection groups；3：PCR productsFig.4 Identification of PCR products by enzyme digestion

圖5 TALEN體內(nèi)活性檢測(cè)Note.A.Our designed TALEN sequences；B.The sequenced diagram of wild-type（WT）；C.The sequenced diagram of 8 bp deletionFig.5 Identification of the in vivo activity of TALENs

將未切開條帶回收，連入T載體，測(cè)序檢測(cè)靶點(diǎn)突變情況。測(cè)序結(jié)果如圖5所示，A為本實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)的敲除靶點(diǎn)，B為野生型gata4基因測(cè)序圖，C為注射mRNAs后兩個(gè)靶點(diǎn)之間基因敲除8 bp的測(cè)序圖，圖中黑色箭頭指示的是發(fā)生基因突變的位點(diǎn)。通過與野生型測(cè)序圖比較可以看出TALEN對(duì)靶點(diǎn)的基因修飾情況。

3.3.2 斑馬魚 TALEN突變體篩選：斑馬魚TALEN突變體篩選采用酶切法?？偣布羧0斑馬魚成魚尾鰭54條，提取基因組DNA進(jìn)行酶切檢測(cè)，結(jié)果顯示其中有19條斑馬魚發(fā)生了基因敲除，敲除效率約為 35.18％。圖 6為酶切檢測(cè)gata4基因的電泳圖，圖中只顯示出了部分斑馬魚的酶切結(jié)果。將酶切檢測(cè)中的未切開條帶回收，連入T載體，測(cè)序分析發(fā)生敲除斑馬魚的基因型變化，測(cè)序結(jié)果見圖7。

圖6 酶切檢測(cè)成魚中g(shù)ata4位點(diǎn)的基因型Note.M：DNA marker；1：Control；2-6：The different DNA by enzyme digestion；7：The undigested PCR productsFig.6 Identification of different genotypes of gata4 loci in the adult zebrafish by enzyme digestion

圖7 gata4基因敲除斑馬魚測(cè)序結(jié)果Fig.7 The sequencing results of gata4 knockout zebrafish

4 討論

類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）介導(dǎo)的靶向修飾技術(shù)是目前廣泛使用的基因敲除技術(shù)，其已經(jīng)成功應(yīng)用于斑馬魚［9］、大鼠［10］、豬［11］等多個(gè)物種的研究中。轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子（TALE）最初是在植物致病菌黃單胞桿菌屬（Xanthomonas）中發(fā)現(xiàn)的，其本質(zhì)是一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，主要有兩個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域：特異性識(shí)別核酸的靶點(diǎn)識(shí)別域和切斷DNA序列的核酸酶功能結(jié)構(gòu)域。［12-14］。TAL蛋白的核酸結(jié)合域的氨基酸序列能夠特異性地識(shí)別和結(jié)合靶位點(diǎn)的核酸序列，利用TAL的序列模塊，組裝成特異結(jié)合任意DNA序列的模塊化蛋白，通過與核酸酶Fok I連接，構(gòu)建針對(duì)任意特定核酸靶序列的重組核酸酶TALEN，達(dá)到在任意位點(diǎn)打斷DNA的目的。TALEN中Fok I核酸內(nèi)切酶形成二聚體時(shí)才發(fā)揮活性，對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行切割［15］。細(xì)胞DNA損傷后會(huì)啟動(dòng)兩種修復(fù)機(jī)制過程，其中一種是非同源末端連接修復(fù)機(jī)制（non-homologous end joining，NHEJ），另一種是同源重組修復(fù)機(jī)制（homologydirected repair，HDR）［16］。當(dāng)沒有外源的同源序列加入，細(xì)胞就會(huì)啟動(dòng)NHEJ修復(fù)機(jī)制，往往就會(huì)引起突變，從而達(dá)到基因敲除的目的。本研究中將TALEN mRNAs注射到斑馬魚受精卵中后，細(xì)胞就采用NHEJ方式修復(fù)損傷的DNA，這種修復(fù)是隨機(jī)的，所以要對(duì)斑馬魚的突變進(jìn)行篩選。通過分子克隆途徑人工構(gòu)建TALE重復(fù)序列的方法主要包括四類：基于Goldern Gate（GG）克隆的方法、基于連續(xù)克隆組裝的方法、基于固相合成的高通量方法、基于長(zhǎng)末端的LIC組裝方法等［17］。本研究中構(gòu)建敲除載體采用的是單元組裝法，是北京大學(xué)細(xì)胞增殖與分化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建立的一種合成TALE重復(fù)單元的方法［9］，這種方法簡(jiǎn)單、技術(shù)難度低、精確度高、保真性好、成本較低、便于操作。但是，與最新的CRISPER/Cas9技術(shù)相比，構(gòu)建載體的過程繁瑣、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。今后構(gòu)建其他基因敲除動(dòng)物模型時(shí)，可以考慮使用CRISPER/Cas9技術(shù)。

有研究表明，先天性心臟病的發(fā)生與gata4基因突變有關(guān)［18］。目前尚無較好的動(dòng)物模型用于先天性心臟病的機(jī)制研究。相比于其他動(dòng)物，斑馬魚有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：斑馬魚發(fā)育早期可以不完全依賴于有功能的心血管系統(tǒng)，甚至在最為嚴(yán)重的心血管系統(tǒng)缺失情況下，仍能通過對(duì)氧的被動(dòng)運(yùn)輸能短時(shí)間存活［19］，這一特點(diǎn)為研究者獲得發(fā)育早期胚胎突變體，觀察心臟發(fā)育相關(guān)基因缺陷型胚胎，研究心血管發(fā)育嚴(yán)重缺陷的活體提供可能；斑馬魚胚胎透明，可以動(dòng)態(tài)地觀察到整個(gè)心臟發(fā)育過程及血液循環(huán)情況，使得斑馬魚成為先天性心臟病研究的理想動(dòng)物模型。

本研究發(fā)現(xiàn)，基因敲除的效率隨著 TALEN mRNAs的注射濃度的增加而升高。當(dāng) TALEN mRNAs的注射濃度為200 pg/nL時(shí)，胚胎基因組電泳圖中并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的未切開條帶，推測(cè)原因可能是mRNAs的濃度太低，細(xì)胞內(nèi)存在大量降解外源mRNA的核酸酶，注射的TALEN mRNAs進(jìn)入細(xì)胞后還沒有來得及發(fā)揮識(shí)別、切斷基因組DNA的作用就被細(xì)胞內(nèi)的RNA核酶降解了；當(dāng)注射濃度為300 pg/nL時(shí)，胚胎基因組鑒定發(fā)現(xiàn)明顯的未切開條帶并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析后，證實(shí)了TALEN mRNAs確實(shí)發(fā)揮了作用，改變了gata4基因的序列，發(fā)生基因敲除的效率為32.65％；當(dāng)注射濃度為400 pg/nL時(shí)，24 dpf后發(fā)現(xiàn)注射后的胚胎大部分死亡，少數(shù)存活的胚胎出現(xiàn)發(fā)育畸形、甚至不能脫膜孵化成幼魚，孵化率較低，推測(cè)原因可能是注射mRNAs的濃度越高，發(fā)揮敲除作用的效率越高，對(duì)細(xì)胞的毒性就越高，使胚胎無法存活。所以在注射時(shí)應(yīng)該提高TALEN突變效率的同時(shí)兼顧胚胎的存活率。篩選斑馬魚TALEN突變體時(shí)，總共剪取54條注射過的斑馬魚，其中 gata4基因發(fā)生改變的斑馬魚有19條，敲除效率為 35.18％，這與注射后胚胎檢測(cè)TALEN的效率大致相同。對(duì)發(fā)生基因敲除的斑馬魚gata4基因進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)TALEN敲除后產(chǎn)生了不同的基因型，說明細(xì)胞DNA損傷后采用的是隨機(jī)的NHEJ修復(fù)，這符合文獻(xiàn)中的報(bào)道［16］。胚胎及魚尾基因組 PCR、酶切、測(cè)序分析均證明了TALEN在斑馬魚體內(nèi)發(fā)揮了作用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)斑馬魚gata4基因結(jié)構(gòu)的改變。這說明本研究中針對(duì)gata4基因第一外顯子構(gòu)建的TALEN敲除載體是可行的且構(gòu)建出了gata4基因敲除的斑馬魚動(dòng)物模型。本研究只是初步構(gòu)建出了針對(duì)gata4基因第一外顯子的靶向敲除載體，并確認(rèn)了其在體內(nèi)的活性及造成的基因敲除效果，并篩選出了19條含有突變的斑馬魚，但是還需要大量的外交、內(nèi)交來篩選含有靶點(diǎn)突變的純合子斑馬魚、對(duì)不同突變基因型的斑馬魚進(jìn)行表型分析、gata4基因標(biāo)志物檢測(cè)、病理切片檢查等。本研究中構(gòu)建出的gata4基因敲除斑馬魚模型可以用于先天性心臟病的發(fā)病機(jī)制研究、進(jìn)一步為疾病的治療奠定基礎(chǔ)。

［1］Pierpont ME，Craig T，Basson D，et al.Genetic basis for congenitalheartdefects：Currentknowledge.A scientific statement from the American HeartAssociation Congenital Cardiac Defects Committee，Council on Cardiovascular Disease in the Young：Endorsed by the American Academy of Pediatrics［J］.Circulation，2007，115（23）：3015-3038.

［2］Beis D，Bartman T，Jin SW，et al.Genetic and cellular analyses of zebrafish atrioventricular cushion and valve development［J］.Development.2005，132（18）：4193-4204.

［3］Chi NC，Shaw RM，Junqblut B，et al.Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system［J］.Plos Biol，2008，6（5）：1006-1019.

［4］Pierpont ME，Basson CT，Benson DW，et al.Genetic basis for congenital heart defects：current knowledge［J］.Pediatrics，2007.120（2）：447.

［5］Sarkozy A，Conti E，Neri C，et al.Spectrum of atrial septal defects associated with mutations of NKX2.5 and GATA4 transcription factors［J］.J Med Genet，2005，42（2）：16.

［6］孫德明，王天奇，朱曉紅，等.實(shí)驗(yàn)用魚遺傳控制及標(biāo)準(zhǔn)化［J］.遺傳，2012，34（9）：1202-1207.

［7］沈延，黃鵬，張博.TALEN構(gòu)建與斑馬魚基因組定點(diǎn)突變的實(shí)驗(yàn)方法與流程［J］.遺傳，2013，3（54）：553-544.

［8］楊紅波，梁巍，劉新星，等.應(yīng)用雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)斑馬魚microRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)［J］.遺傳，2012，34（9）：1181 -1192.

［9］Huang P，Xiao A，Zhou MG，et al.Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs［J］.Nat Biotechnol，2011，29（8）：699-700.

［10］Tesson L，Usal C，Ménoret S，et al.Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs［J］.Nat Biotechnol，2011，29（8）：695-696.

［11］Xin JG，Yang HQ，F(xiàn)an NN，et al.Highly efficient generation of GGTA1 biallelic knockout inbred mini-pigs with TALENs［J］.PloS ONE，2013，8（12）：e84250.

［12］Kay S，Hahn S，Marois E，et al.A bacterial effector acts as a plant transcription factor and induces a cell size regulator［J］.Science，2007，318（5850）：648-651.

［13］Romer P，Hahn S，Jordan T，et al.Plant pathogen recognition mediated by promoter activation of the pepper Bs3 resistance gene［J］.Science，2007，318（5850）：645-648.

［14］Kay S，Bonas U.How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant［J］.Curr Opin Microbiol，2009，12（1）：37 -43.

［15］肖安，胡瑩瑩，王唯曄，等.人工鋅指核酸酶介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)［J］.遺傳，2011，33（7）：665-683.

［16］Urnov FD，Rebar EJ，Holmes MC，et al.Genome editing with engineered zinc finger nucleases［J］.Nat Rev Genet，2010，11（19）：636-646.

［17］沈延，肖安，黃鵬，等.類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)［J］.遺傳，2013，35（4）：395-407.

［18］陳恒余，鄧青春，李夢(mèng)婷，等.先天性心臟病與GATA4基因的關(guān)系［J］.中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2013，21（6）：6-8.

［19］Stainier DY.Zebrafish genetics and vertebrate heart formation［J］.Nat Rev Genet，2001，2（1）：39-48.

Knockout gata4 gene and establish ment of a zebrafish model of congenital heart disease by TALEN

LIU Jing1，2，HE Jia-ling2，BAO Guo2，LI Nan2，WANG Tian-qi2，ZHANG Chang-yong2，SUN De-ming2
（1.Graduate School of Peking Union Medical College，Beijing 100730，China；2.National Research Institute for Family Planning，Beijing 100081，China）

Objective To establish a gata4 gene knockout zebrafish model of congenital heart disease，and construct transcription activator-like effector nuclease（TALEN）vectors targeting gata4 gene.Method We construct TALEN vectors targeting zabrafish gata4 gene using unit assembly method and the in vitro-transcribed TALEN mRNAs were microinjected into one-cell stage zebrafish embryos.The efficiency of TALEN was identified by injected embryos，and mutations of zebrafish were screened and confirmed the different types through PCR and enzyme digestion.Results We successfully constructed correct targeting vectors by enzyme digestion and sequencing，and the gene knockout efficiency was 35.18％.We screened the mutant zebrafish and confirmed different types of gata4 gene mutations.Conclusions A gata4 knockout zebrafish model is successfully established，it can provide a good animal model for further research of congenital heart diseases.

TALEN；gata4 gene；Zebrafish；Model，animal；Congenital heart disease

孫德明（1958-），男，研究員，博士，研究方向：比較生殖醫(yī)學(xué)。Email：sundemingnet@163.com。

R33

A

1671-7856（2015）04-0001-07

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.004.001

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)資金項(xiàng)目-優(yōu)秀青年科技人才創(chuàng)業(yè)基金項(xiàng)目（編號(hào)：2012GJSSJKC02）；國(guó)家十二五科技支撐計(jì)劃計(jì)劃生育技術(shù)安全性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物培育關(guān)鍵性共享技術(shù)研究項(xiàng)目（編號(hào)：2012BA131B06）。

劉靜（1988-），女，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物學(xué)。Email：864913436@qq.com。

2015-02-15