高 梅，曹 沖，馬 會，朱春花

(山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東省化學(xué)藥物重點實驗室，山東濟(jì)南 250101）

豚鼠主動全身過敏試驗兩種陽性物質(zhì)選擇的探討

高 梅，曹 沖，馬 會，朱春花

(山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東省化學(xué)藥物重點實驗室，山東濟(jì)南 250101）

目的比較兩種陽性物質(zhì)人血白蛋白、卵白蛋白對豚鼠主動全身過敏作用，為過敏性試驗提供較好的陽性對照。方法 將豚鼠隨機(jī)分為14組，以人血白蛋白、卵白蛋白(2、10、100 mg/只）、0.9％氯化鈉注射液等受試物為對照，研究不同致敏劑量、激發(fā)劑量、激發(fā)時間等條件下，豚鼠全身主動過敏的反應(yīng)情況。結(jié)果 在2～100 mg/只劑量范圍內(nèi)，人血白蛋白、卵白蛋白豚鼠主動全身過敏反應(yīng)的發(fā)生率為100％。在2～10 mg/只劑量范圍內(nèi)，過敏癥狀發(fā)生程度隨致敏劑量、激發(fā)劑量的增加而增加，相同劑量的卵白蛋白較人血白蛋白反應(yīng)程度更強(qiáng)。結(jié)論

豚鼠主動全身過敏試驗，陽性對照推薦使用卵白蛋白，劑量為2 mg/只。

主動全身過敏試驗；人血白蛋白；卵白蛋白；過敏反應(yīng)；豚鼠

《化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》［1］規(guī)定，通常局部給藥發(fā)揮全身作用的藥物(如注射劑和透皮吸收劑等）需考察I型過敏反應(yīng)，如進(jìn)行主動全身過敏試驗(ASA），ASA通常選用體重為300～400 g的豚鼠，劑量設(shè)計中應(yīng)設(shè)立陰性和陽性對照。陰性對照組應(yīng)給予同體積的溶媒，陽性對照組給予牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏陽性物質(zhì)。我們選用已知致敏陽性物質(zhì)人血白蛋白、卵白蛋白為研究對象，比較不同致敏劑量、激發(fā)劑量、激發(fā)時間等可變因素下，兩種蛋白對豚鼠主動全身過敏試驗結(jié)果的影響，以便得出在I型致敏試驗中致敏效果更好的陽性對照。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器：注射用人血白蛋白，規(guī)格10 g，50 mL/瓶，蛋白質(zhì)濃度20％，批號20121032，有效期36個月，廣州雙林生物制藥有限公司生產(chǎn)；卵白蛋白，批號 326A052，分裝批次 20120816，有效期2015.08，Sigma公司生產(chǎn)，北京索萊寶有限公司分裝；0.9％氯化鈉注射液，批號121002103，辰欣藥業(yè)股份有限公司；電子秤，型號ACS-JJ型，梅特勒-托利多常州測量技術(shù)有限公司生產(chǎn)；電子分析天平，型號AUW-120D型，島津有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 實驗動物：Hartley豚鼠，SPF級，體重300 g～400 g，雌雄各半，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京）2012-0001。實驗在本中心屏障環(huán)境動物實驗設(shè)施進(jìn)行，實驗動物使用許可證號：SYXK(魯）2012 0004。并按實驗動物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 方法［1，2］

1.2.1 試驗藥液配制：100 mg/mL人血白蛋白：吸取濃度為20％的注射用人血白蛋白5 mL，加0.9％氯化鈉注射液稀釋至10 mL；10 mg/mL人血白蛋白：吸取濃度為100 mg/mL的注射用人血白蛋白1 mL，加0.9％氯化鈉注射液稀釋至10 mL；2 mg/mL人血白蛋白：吸取濃度為10 mg/mL的注射用人血白蛋白2 mL，加0.9％氯化鈉注射液稀釋至10 mL；100 mg/mL卵白蛋白：稱取卵白蛋白 1.0 g，加0.9％氯化鈉注射液溶解稀釋至10 mL；10 mg/mL卵白蛋白：吸取濃度為100 mg/mL的卵白蛋白1 mL，加0.9％氯化鈉注射液稀釋至10 mL；2 mg/mL卵白蛋白：吸取濃度為10 mg/mL的卵血白蛋白2 mL，加0.9％氯化鈉注射液稀釋至10 mL；陰性對照組：0.9％氯化鈉注射液。

1.2.2 分組：56只豚鼠隨機(jī)分為14組，每組4只，雌雄各半。1～14組分別為100 mg/只人血白蛋白組(第14天激發(fā)）、100 mg/只人血白蛋白組(第21天激發(fā)）、10 mg/只人血白蛋白組(第14天激發(fā)）、10 mg/只人血白蛋白組(第21天激發(fā)）、2 mg/只人血白蛋白組(第14天激發(fā)）、2 mg/只人血白蛋白組(第21天激發(fā)）、100 mg/只卵白蛋白組(第14天激發(fā)）、100 mg/只卵白蛋白組(第21天激發(fā)）、10 mg/只卵白蛋白組(第14天激發(fā)）、10 mg/只卵白蛋白組(第21天激發(fā)）、2 mg/只卵白蛋白組(第14天激發(fā)）、2 mg/只卵白蛋白組(第21天激發(fā)）、0.9％氯化鈉注射液陰性對照組(第14天激發(fā)）、0.9％氯化鈉注射液陰性對照組(第21天激發(fā)）。按不同實驗因素進(jìn)行試驗分組情況見表1。

1.2.3 致敏：分別在動物實驗的第1、3、5天進(jìn)行腹腔注射致敏，0.5 mL/只，共注射3次。

1.2.4 激發(fā)：各組末次致敏后第14天、第21天一次靜脈注射相應(yīng)藥液用于激發(fā)，1.0 mL/只。

1.2.5 結(jié)果判斷：激發(fā)觀察：激發(fā)后立刻至30 min按表2的癥狀詳細(xì)觀察每只動物的反應(yīng)，癥狀出現(xiàn)及消失的時間。

表1 按不同實驗因素進(jìn)行試驗分組Tab.1 ExPerimental grouPs divided according to the exPerimental factors

表2 全身過敏反應(yīng)評價標(biāo)準(zhǔn)［3］Tab.2 Evaluation criteria of the active systemic anaPhylaxis test

2 結(jié)果

2.1 不同劑量的人血白蛋白致豚鼠過敏反應(yīng)結(jié)果（第14天激發(fā)）

I組：100 mg/只人血白蛋白組末次致敏后第14天激發(fā)，激發(fā)后立即出現(xiàn)跳躍、痙攣、潮式呼吸、排尿等表現(xiàn)并于1 min內(nèi)全部死亡，過敏反應(yīng)為極強(qiáng)陽性，過敏率為100％。

III組：10 mg/只人血白蛋白組末次致敏后第14天激發(fā)，激發(fā)后10 s～30 s內(nèi)動物出現(xiàn)搔鼻、咳嗽、躁動、步態(tài)不穩(wěn)、跳躍、呼吸急促、呼吸困難、喘息、旋轉(zhuǎn)、潮式呼吸、痙攣、排尿等表現(xiàn)，1只動物于3 min內(nèi)死亡，余下3只動物約15 min開始恢復(fù)自主活動，約30 min恢復(fù)活動無明顯異常，過敏反應(yīng)為極強(qiáng)陽性，過敏率為100％。

V組：2 mg/只人血白蛋白組末次致敏后第14天激發(fā)，激發(fā)后15 s～60 s內(nèi)動物出現(xiàn)躁動、搔鼻、呼吸急促、呼吸困難、跳躍、俯臥不動等表現(xiàn)，約10 min開始恢復(fù)自主活動，約25 min恢復(fù)活動無明顯異常，過敏反應(yīng)為強(qiáng)陽性，過敏率為100％(表3）。

2.2 不同劑量的人血白蛋白致豚鼠過敏反應(yīng)結(jié)果（第21天激發(fā)）

II組：100 mg/只人血白蛋白組末次致敏后第21天激發(fā)，激發(fā)后立即出現(xiàn)痙攣、潮式呼吸、排尿等表現(xiàn)并于1 min內(nèi)全部死亡，過敏反應(yīng)為極強(qiáng)陽性，過敏率為100％。

IV組：10 mg/只人血白蛋白組末次致敏后第21天激發(fā)，激發(fā)后15 s～30 s內(nèi)動物出現(xiàn)搔鼻、咳嗽、躁動、步態(tài)不穩(wěn)、跳躍、呼吸急促、呼吸困難、喘息、旋轉(zhuǎn)、潮式呼吸、痙攣、排尿等表現(xiàn)并于3 min內(nèi)全部死亡，過敏反應(yīng)為極強(qiáng)陽性，過敏率為100％。

VI組：2 mg/只人血白蛋白組末次致敏后第21天激發(fā)，激發(fā)后15 s～60 s內(nèi)動物出現(xiàn)躁動、搔鼻、呼吸急促、呼吸困難、步態(tài)不穩(wěn)、跳躍、排尿、俯臥不動等表現(xiàn)，一只動物于5 min內(nèi)死亡，余下三只動物約15 min開始恢復(fù)自主活動，約30 min恢復(fù)活動無明顯異常，過敏反應(yīng)為極強(qiáng)陽性，過敏率為100％ (表4）。

表3 不同劑量人血白蛋白致豚鼠過敏反應(yīng)結(jié)果(第14天激發(fā)）Tab.3 Results of allergic reaction induced with different doses of human albumin in the guinea Pigs(14 days to challenge）

表4 不同劑量人血白蛋白致豚鼠過敏反應(yīng)結(jié)果(第21天激發(fā)）Tab.4 Results of allergic reaction induced with different doses of human albumin in the guinea Pigs(21 days to challenge）

2.3 不同劑量的卵白蛋白致豚鼠過敏反應(yīng)結(jié)果（第14天激發(fā)）

VII組：100 mg/只卵白蛋白組末次致敏后第14天激發(fā)，藥液未注射完畢動物即死亡，過敏反應(yīng)為極強(qiáng)陽性，過敏率為100％。

IX組：10 mg/只卵白蛋白組末次致敏后第14天激發(fā)，激發(fā)后5 s～20 s內(nèi)動物出現(xiàn)搔鼻、跳躍、呼吸急促、呼吸困難、潮式呼吸、痙攣、排尿等表現(xiàn)并于2 min內(nèi)全部死亡，過敏反應(yīng)為極強(qiáng)陽性，過敏率為100％。

XI組：2 mg/只卵白蛋白組末次致敏后第14天激發(fā)，激發(fā)后5 s～20 s內(nèi)動物出現(xiàn)搔鼻、咳嗽、躁動、步態(tài)不穩(wěn)、跳躍、呼吸急促、呼吸困難、喘息、旋轉(zhuǎn)、潮式呼吸、痙攣、排尿等表現(xiàn)并于3 min內(nèi)全部死亡，過敏反應(yīng)為極強(qiáng)陽性，過敏率為100％(表5）。

2.4 不同劑量的卵白蛋白致豚鼠過敏反應(yīng)結(jié)果（第21天激發(fā)）

VIII組：100 mg/只卵白蛋白組末次致敏后第21天激發(fā)，藥液未注射完畢動物即死亡，過敏反應(yīng)為極強(qiáng)陽性，過敏率為100％。

X組：10 mg/只卵白蛋白組末次致敏后第21天激發(fā)，激發(fā)后5 s～20 s內(nèi)動物出現(xiàn)跳躍、呼吸急促、呼吸困難、潮式呼吸、痙攣、排尿等表現(xiàn)并于1 min內(nèi)全部死亡，過敏反應(yīng)為極強(qiáng)陽性，過敏率為100％。

XII組：2 mg/只卵白蛋白組末次致敏后第21天激發(fā)，激發(fā)后5～20 s內(nèi)動物出現(xiàn)搔鼻、咳嗽、躁動、步態(tài)不穩(wěn)、跳躍、呼吸急促、呼吸困難、喘息、旋轉(zhuǎn)、潮式呼吸、痙攣、排尿等表現(xiàn)并于3 min內(nèi)全部死亡，過敏反應(yīng)為極強(qiáng)陽性，過敏率為100％(表6）。

2.5 0.9％氯化鈉注射液致豚鼠過敏反應(yīng)結(jié)果（第14、21天激發(fā)）

XIII、XIV組：0.9％注射液陰性對照組末次致敏后第14天、21天激發(fā)，激發(fā)后均未見明顯異常反應(yīng)，過敏反應(yīng)為陰性，過敏率為0％。實驗結(jié)果見表7。

表5 不同劑量卵白蛋白致豚鼠過敏反應(yīng)結(jié)果(第14天激發(fā)）Tab.5 Results of allergic reaction induced with different doses of ovalbumin in the guinea Pig(14 days to challenge）

表6 不同劑量卵白蛋白致豚鼠過敏反應(yīng)結(jié)果(第21天激發(fā)）Tab.6 Results of allergic reaction induced with different doses of ovalbumin in the guinea Pigs(21 days to challenge）

表7 0.9％氯化鈉注射液致豚鼠過敏反應(yīng)結(jié)果(第14、21天激發(fā)）Tab.7 Results of allergic reaction induced with 0.9％sodium chloride Injection in the guinea Pig(14 days and 21 days to challenge）

3 討論

3.1 不同致敏、激發(fā)劑量對豚鼠主動全身過敏反應(yīng)的影響

人血白蛋白、卵白蛋白在(2～100）mg/只劑量范圍內(nèi)，豚鼠主動全身過敏反應(yīng)的發(fā)生率為100％，過敏癥狀發(fā)生的嚴(yán)重程度隨致敏劑量、激發(fā)劑量的增加而增加。人血白蛋白、卵白蛋白劑量為100 mg/只時對豚鼠進(jìn)行致敏與激發(fā)，動物產(chǎn)生過敏的反應(yīng)率為100％，但是激發(fā)時由于動物過敏反應(yīng)極為強(qiáng)烈、迅速，激發(fā)藥液剛注射完畢或注射過程中動物即死亡，無法有效的觀察到動物過敏反應(yīng)過程，在(2～10）mg/只劑量范圍內(nèi)對豚鼠進(jìn)行致敏與激發(fā)，動物產(chǎn)生過敏的反應(yīng)率為100％，而產(chǎn)生過敏反應(yīng)強(qiáng)度大大降低，可有效觀察過敏反應(yīng)。人血白蛋白發(fā)生豚鼠過敏反應(yīng)的嚴(yán)重程度為100 mg/只＞10 mg/只＞2 mg/只，在(2～100）mg/只劑量范圍內(nèi)，人血白蛋白過敏反應(yīng)的發(fā)生率并沒有隨著劑量的增大而發(fā)生變化，但是豚鼠過敏反應(yīng)癥狀的嚴(yán)重程度卻存在明顯的差別。卵白蛋白發(fā)生豚鼠過敏反應(yīng)的嚴(yán)重程度為100 mg/只≥10 mg/只＞2 mg/只，卵白蛋白10、100 mg/只發(fā)生反應(yīng)的嚴(yán)重程度并無明顯區(qū)別，這說明致敏劑量大到一定劑量時，增加劑量并不會顯著影響陽性反應(yīng)程度。由此可見，過敏反應(yīng)發(fā)生與否，或表現(xiàn)出來的陽性反應(yīng)癥狀輕重是與劑量密切關(guān)系的，劑量過小，雖然在一定范圍內(nèi)也能發(fā)現(xiàn)過敏反應(yīng)，但很可能由于過敏反應(yīng)輕微，難以觀察而被忽視。劑量過大，容易致動物快速死亡，無法有效全面的觀察到陽性癥狀的發(fā)生過程［3］。

3.2 激發(fā)時間對豚鼠主動全身過敏反應(yīng)的影響

人血白蛋白在(10～100）mg/只、卵白蛋白在(2～100）mg/只劑量范圍內(nèi)，第14天、第21天激發(fā)時出現(xiàn)的陽性反應(yīng)率與反應(yīng)強(qiáng)度并無明顯區(qū)別，人血白蛋白在2 mg/只劑量時，致敏21天激發(fā)比致敏14天激發(fā)出現(xiàn)的陽性率要高些，強(qiáng)度要大些。陳怡然［4］研究發(fā)現(xiàn)，以0.1％人血白蛋白作為陽性對照，第14天激發(fā)時，反應(yīng)級數(shù)為+++，第21天激發(fā)時，反應(yīng)級數(shù)為++++。陳丹等［5］研究發(fā)現(xiàn)，以10％人血白蛋白作為陽性對照，第14天激發(fā)時，反應(yīng)級數(shù)為++++。說明在劑量較大時，豚鼠發(fā)生過敏反應(yīng)的強(qiáng)度與激發(fā)的時間之間關(guān)系不明顯，在劑量較小時，豚鼠發(fā)生過敏反應(yīng)的強(qiáng)度與激發(fā)的時間有較大關(guān)系，這可能是因為時間長動物體內(nèi)產(chǎn)生的抗體更多的緣故。當(dāng)然，究竟最后一次致敏后多少天激發(fā)才是最佳，這還值得進(jìn)一步研究。

3.3 相同劑量下人血白蛋白、卵白蛋白對豚鼠主動全身過敏反應(yīng)的影響

人血白蛋白、卵白蛋白在(2～100）mg/只劑量范圍內(nèi)，相同劑量下的卵白蛋白比人血白蛋白致豚鼠過敏反應(yīng)程度更強(qiáng)。豚鼠主動全身過敏試驗中常用的陽性對照物，文獻(xiàn)報道較多的為卵白蛋白、人血白蛋白、牛血清白蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，以人血白蛋白做陽性對照時，使用濃度在0.1％ ～10％［4，5］，以卵白蛋白做陽性對照時，使用濃度為5 mg/只［6］，以牛血清白蛋白做為陽性對照時，推薦使用劑量為50 mg/kg［3］。通過比較發(fā)現(xiàn)，以三種蛋白作為陽性對照時，在一定范圍內(nèi)，均能得到較好的陽性效果，但是同時也要考慮癥狀發(fā)生過程、經(jīng)濟(jì)等原因。從經(jīng)濟(jì)因素考慮，三種蛋白相同規(guī)格的市場報價為人血白蛋白＞牛血清白蛋白＞卵白蛋白，從癥狀發(fā)生過程考慮，卵白蛋白使用劑量為2 mg/只時，便能觀察到全面的陽性反應(yīng)癥狀。

綜上，豚鼠全身主動過敏反應(yīng)與致敏劑量、激發(fā)劑量、激發(fā)時間等都有較大關(guān)系［7］，通過比較0.9％氯化鈉注射液對照組和不同劑量人血白蛋白組、卵白蛋白組(2、10、100 mg/只）豚鼠全身過敏反應(yīng)發(fā)生的情況，我們發(fā)現(xiàn)，在本試驗條件下，在一定劑量范圍內(nèi)，相同劑量的卵白蛋白較人血白蛋白反應(yīng)程度更強(qiáng)，卵白蛋白使用劑量為2 mg/只時，便能觀察到全面的陽性反應(yīng)癥狀，而且卵白蛋白比人血白蛋白更經(jīng)濟(jì)實惠。因此，我們推薦豚鼠主動全身過敏反應(yīng)中陽性物質(zhì)選擇卵白蛋白，劑量推薦2 mg/只。

［1］《化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》課題研究組.化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則［S］.國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，2005：13 -27.

［2］袁伯俊，廖明陽，李波.藥物毒理學(xué)實驗方法與技術(shù)［M］.北京：北京化學(xué)工業(yè)出版社，2007：247-261.

［3］翁謝川，樊星，王青秀，等.藥物安全性評價中豚鼠全身過敏試驗方法的研究［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2012，22(5）：51 -55.

［4］陳怡然.注射用齊多夫定對豚鼠的全身過敏性試驗［J］.中國藥師，2006，9(6）：535-536.

［5］陳丹，石佑恩，胡媛，等.日本血吸蟲雙價DNA疫苗肌肉刺激和全身過敏試驗［J］.中國血吸蟲病防治雜志，2008，20(2）：85-88.

［6］陳華英，李秀芳，金若敏，等.大鼠主動全身過敏試驗方法的探討［J］.中成藥，2012，34(7）：1209-1215.

［7］張德波，楊幼琪，馮誠，等.過敏反應(yīng)與致敏劑量和致敏時間的關(guān)系研究［J］.中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2007，8(3）：18-20.

Exploration on the selection of positive materials in active systemic anaphylaxis in guinea pigs

GAO Mei，CAO Chong，MA Hui，ZHU Chun-hua
(Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences，Shandong Provincial Key Laboratory of Chemical Drugs，Jinan 250101，China）

Objective The aim of this study was to Provide a better Positive control for allergic test by comParing the allergic effect of two kinds of Positive materials，human albumin and ovalbumin，on active systemic anaPhylaxis in guinea Pig.Methods Guinea Pigs were randomly divided into 14 grouPs，and were given human albumin，ovalbumin (2，10，100 mg/animal），or 0.9％sodium chloride injection as test substances，to assess the symPtoms and incidence of systemic allergic resPonses induced by different sensitizing substances in different challenge doses and different challenge intervals.Results In the range of 2 to 100 mg/animal，the guinea Pigs showed a 100％incidence rate of Positive allergic reaction to human albumin and ovalbumin，the severity of anaPhylactic symPtoms was increasing along with the increase of sensitizing doses and challenge doses，and the allergic reaction was more strong induced by the same dose of ovalbumin than human albumin.Conclusions Our findings indicate that in the active systemic anaPhylaxis test in guinea Pigs，we recommend ovalbumin as the Positive control in a dose of 2 mg/animal.

Active systemic anaPhylaxis；Human albumin；Ovalbumin；Allergic reaction；Guinea Pigs

R-33 < class="emphasis_bold">【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

A

1671-7856（2015）09-0051-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.009.010

高梅(1983-），女，主管藥師，研究方向：藥物安全性評價。E-mail：gaomei729@163.com。

2015-08-01