任佳羽，楊貴方，胡松巖，劉 歡，王 艷，蒲小君，黃 高，王文佳

(貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽 550025）

越婢加半夏湯降低過敏性哮喘小鼠的血清IgE和升高肺組織中SOD的活力

任佳羽，楊貴方，胡松巖，劉 歡，王 艷，蒲小君，黃 高，王文佳

(貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽 550025）

目的通過觀察不同階段各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中免疫球蛋白(IgE）及肺組織中超氧化物歧化酶(SOD）活力與抑制率的變化，探討越婢加半夏湯對過敏性哮喘小鼠的作用機(jī)制。方法 隨機(jī)將健康昆明種小白鼠分為正常對照組、哮喘模型組、地塞米松干預(yù)組和中藥制劑組。采用卵白蛋白(OVA）、氫氧化鋁凝膠混懸液腹腔注射致敏和霧化激發(fā)的方法建立小鼠哮喘模型，造模成功后，中藥制劑組給予越婢加半夏溶液1 mL/100 g。地塞米松組給予腹腔注射地塞米松1 mg/kg。正常對照組和哮喘模型組小鼠分次給予生理鹽水灌胃治療。給藥30 d后處死，檢測各組小鼠血清IgE水平和肺組織SOD活力，并進(jìn)行HE染色觀察肺組織的病理學(xué)變化。結(jié)果 中藥制劑組小鼠與哮喘模型組小鼠相比，前者外周血清中IgE含量下降(P＜0.05），IgE在2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）；前者肺組織勻漿中SOD活力與抑制率升高，SOD活力與抑制率在2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。結(jié)論 降低過敏性哮喘小鼠血清中IgE含量及升高小鼠肺組織SOD活力與抑制率水平，提高肺組織抗氧化能力，可能為越婢加半夏湯治療過敏性哮喘的作用機(jī)制之一。

過敏性哮喘；越婢加半夏湯；IgE；SOD；肺；小鼠

支氣管哮喘是一種以IgE介導(dǎo)的，多種炎癥細(xì)胞(肥大細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞為主）、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子參與形成的氣道慢性炎癥，由變應(yīng)原引發(fā)的過敏性哮喘的疾病，在易感者中此種炎癥可引起反復(fù)發(fā)作的喘息，氣促、胸悶和(或）咳嗽等癥狀，多在夜間和(或）凌晨發(fā)生，氣道對多種刺激因子反應(yīng)性增高。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療哮喘的主要手段是激素及一些西藥治療，如糖皮質(zhì)激素吸入激素，它是控制哮喘長期穩(wěn)定的最基本的治療，是哮喘的第一線藥物治療。但是研究發(fā)現(xiàn)，長期使用激素治療哮喘并不能從根本上治療哮喘而且會(huì)出現(xiàn)某些全身或局部副作用，造成許多患者肥胖、水腫、骨質(zhì)疏松、形成對激素的依賴甚至腎上腺功能衰竭，導(dǎo)致病情日趨加重。因此，尋找新的方法并且從多角度研究治療哮喘已經(jīng)成為全球哮喘治療的“風(fēng)向標(biāo)”。而我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)治療哮喘歷史悠久且療效顯著，本實(shí)驗(yàn)所選方越婢加半夏湯出自《金匱要略》，其宣肺瀉熱，降逆平喘的作用對哮喘的有積極的治療作用，在相關(guān)臨床已有證實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)研究越婢加半夏湯對過敏性哮喘小鼠的治療作用，通過檢測治療前后各組小鼠血清中IgE及肺組織勻漿中SOD活力與抑制率的改變，并觀察肺組織的病理改變，判斷其治療效果，進(jìn)而探討越婢加半夏湯對過敏性哮喘小鼠的作用機(jī)制，為越婢加半夏湯的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

健康昆明小鼠，雌雄各半，40只，體重(20～25）g，(由貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號：SCXK(黔）2012-0001）。

1.2 試劑與主要儀器

IgE檢測ELISA試劑盒(由南京建成生物工程研究所提供蘇ICP備12006455號）；SOD檢測試劑盒(由南京建成生物工程研究所提供，貨號：A001-3）；卵蛋白(北京索萊寶生物科技公司產(chǎn)品）；氫氧化鋁凝膠(北京索萊寶生物科技公司產(chǎn)品）；PLUS新型 -86超低溫冰箱(Thermo Scientific Revco）；WH-2000醫(yī)用超聲霧化器(粵華）；酶標(biāo)儀(美國Multisken Go）；自制霧化透明塑料盒1個(gè)(22×20 ×15）cm。

1.3 藥物制備

麻黃10 g，石膏30 g，生姜6 g，甘草6 g，大棗12 g，半夏15 g(貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院提供）。醋酸地塞米松(5 mg/支，1 mL/支）。

以上諸味，取礦泉水600 mL，先煮麻黃，去上沫。內(nèi)諸藥，大棗后下，用武火煮至水沸，然后改用文火保持微沸狀態(tài)。15 min后用紗布過濾，過濾后藥渣再加入500 mL水，以同樣方法煎煮濃縮。取煎液備存。

1.4 模型的建立

造模參考文獻(xiàn)［1］，并結(jié)合實(shí)際情況改進(jìn)。隨機(jī)將健康昆明種小白鼠40只分為正常對照組、哮喘模型組、地塞米松干預(yù)組和中藥制劑組。哮喘模型組、中藥制劑組、地塞米松干預(yù)組小鼠于第1、6、12天在小白鼠雙上肢內(nèi)側(cè)、雙下肢大腿外側(cè)及腹腔注射1 mL混懸液(含10 mg卵清蛋白OVA及30 mg氫氧化鋁凝膠）。分次腹腔內(nèi)注射混懸液0.5 mL［含2 MgAl(OH）2乳化的10 mg OVA］以致敏。正常對照組以等量生理鹽水代替致敏液進(jìn)行雙上肢內(nèi)側(cè)、雙下肢大腿外側(cè)、腹腔注射。

哮喘模型組、中藥制劑組和地塞米松組小鼠分別接受3次連續(xù)的氣道過敏源激發(fā)。即在第13、14、15天將小鼠放在自制的透明塑料盒內(nèi)，用霧化器以5％OVA溶液(5％OVA溶液溶解于100 mL蒸餾水內(nèi)）對鼠進(jìn)行霧化，氣道激發(fā)時(shí)間每天1次，每次40 min，連續(xù)3 d。

觀察動(dòng)物反應(yīng)，以呼吸急促、口唇紫紺、煩躁不安、然后伏俯不動(dòng)、腹肌抽搐、四肢癱軟、二便失禁為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 給藥方法

1.5.1 給藥：中藥制劑組給予越婢加半夏溶液1 mL/100 g。地塞米松組：激發(fā)后給予地塞米松腹腔注射(1 mg/kg），中藥制劑組和地塞米松組小鼠自致敏后1 d起，至最后一次激發(fā)當(dāng)天，每天1次，灌胃給藥治療，共治療30 d。正常對照組和哮喘模型組小鼠分次給予生理鹽水灌胃治療。

1.5.2 觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況：各組小鼠飲食、皮毛、活動(dòng)變化、精神狀態(tài)等。

1.6 標(biāo)本制備及檢測

1.6.1 肺組織病理切片制備：造模成功30 d后，隨機(jī)抽取各組小鼠做肺組織病理切片，新鮮左肺組織固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精 -伊紅(HE）染色，光鏡下觀察肺組織病理改變。

1.6.2 血清IgE的測定：治療組于末次激發(fā)后24 h，摘除眼球取血后，常溫放置(10～15）min。4℃靜置(10～15）h，4℃離心，3 000 r/min，吸取上清液，放入EPPendorf管中待測。采用ELISA雙抗體夾心法測定血清中IgE水平。具體步驟參照試劑盒說明書。同時(shí)迅速取新鮮肺組織-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3 肺組織勻漿上清液中SOD活力與抑制率的測定：解凍-80℃肺臟，用冰冷的生理鹽水洗去血污，吸干，稱重后，剪碎組織，搗碎，離心取上清。按照小鼠SOD試劑盒說明進(jìn)行操作，分別測定并計(jì)算各組小鼠肺組織中SOD活力與抑制率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠行為學(xué)的觀察

于霧化激發(fā)第1天約激發(fā)后，哮喘模型組小鼠出現(xiàn)抓鼻，激發(fā)第2天出現(xiàn)煩躁不安，好動(dòng)，頻繁抓口鼻和四肢，弓背直立，霧化第3天出現(xiàn)煩躁，呼吸加深加快，前肢縮抬，二便失禁等陽性反應(yīng)。正常對照組無以上表現(xiàn)。

2.2 各組小鼠肺組織病理改變

光鏡下可見哮喘模型組小鼠氣道周圍大量炎性細(xì)胞浸潤，嗜酸性粒細(xì)胞增多和管腔內(nèi)可見大量粘液栓，肺泡間隔及支氣管壁明顯增厚，肺泡壁破壞等表現(xiàn)；中藥制劑組小鼠與哮喘模型組小鼠相比，氣道周圍炎性細(xì)胞浸潤程度明顯減輕，肺泡間隔病變明顯改善；地塞米松組小鼠與哮喘組小鼠相比，氣道周圍僅有少量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隔增厚不明顯(圖1～4，見文后彩插1）。

2.3 小鼠血清IgE含量檢測結(jié)果

各組小鼠血清IgE水平見表1。與正常對照組相比，哮喘模型組血清總IgE水平明顯升高，相比較差異有顯著性(P＜0.05），中藥制劑組及地塞米松組血清中總IgE水平較哮喘模型組明顯降低，相比差異有顯著性(P＜0.05），中藥制劑組與地塞米松組相比，2組間血清總IgE水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05），說明越婢加半夏湯能顯著降低哮喘小鼠血清IgE(表1）。

表1 血清IgE(Pg/mL，％）含量比較(±s）(n=10）Tab.1 ComParison of the serum IgE level in the four grouPs(Pg/mL，％）(±s）(n=10）

表1 血清IgE(Pg/mL，％）含量比較(±s）(n=10）Tab.1 ComParison of the serum IgE level in the four grouPs(Pg/mL，％）(±s）(n=10）

#與正常對照組相比P＜0.05；*與模型對照組比較P＜0.05.Note.#ComPared with the normal control grouP，P＜0.05；*ComPared with the model control grouP，P＜0.05.

組別GrouPs血清IgE(Pg/mL，％）Serum IgE(Pg/mL，％）正常對照組Normal control grouP 16.47±1.57*哮喘造模組Asthma model grouP 23.79±5.17#地塞米松組Dexamethasone grouP 19.69±2.64#*中藥制劑組Chinese medicine PreParation grouP 19.60±1.31#*

2.4 小鼠肺組織中超氧化物歧化酶（SOD）活力與抑制率檢測結(jié)果

各組小鼠肺組織SOD活力與抑制率水平見表2。與正常對照組相比，哮喘模型組肺組織中SOD活力與抑制率明顯降低，差異相比較有顯著性(P＜0.05）；中藥制劑組與地塞米松組小鼠肺組織中SOD活力與抑制率水平均明顯高于哮喘組(P＜0.05）；2組間SOD活力水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05），說明越婢加半夏湯能顯著升高哮喘小鼠肺組織SOD活力與抑制率水平(表2）。

表2 肺組織中SOD(％）活力與抑制率水平比較(n=10）Tab.2 ComParison of SOD(％）activity and inhibition rate in the mouse lung tissues(n=10）

3 討論

支氣管哮喘是一種以免疫球蛋白E介導(dǎo)的，多種炎癥細(xì)胞(肥大細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞為主）、炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子參與形成的氣道慢性炎癥，常存在氣道高反應(yīng)性［2］。大量研究表明，免疫球蛋白E(IgE）是介導(dǎo)I型超敏反應(yīng)的重要介質(zhì)，當(dāng)機(jī)體接觸過敏原時(shí)，IgE交聯(lián)導(dǎo)致肥大細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞脫顆粒釋放白三烯、組胺等炎癥介質(zhì)引起以嗜酸粒細(xì)胞侵潤浸潤為主的局部炎癥反應(yīng)［3］，而這種炎癥反應(yīng)是哮喘生理學(xué)和臨床表現(xiàn)的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此IgE可作為評價(jià)哮喘治療藥物對哮喘病情治療效果的一項(xiàng)重要檢測指標(biāo)。

研究表明，支氣管哮喘由于呼吸道感染后，防御體系中的白細(xì)胞在吞噬細(xì)菌等病原性微生物時(shí)可產(chǎn)生微量的超陰離子(O-2），剩余的O-2被人體的SOD分解，但當(dāng)炎癥部位的SOD大量消耗時(shí)，其活性會(huì)有不同程度的減弱，導(dǎo)致O-2堆積，造成病理性損傷，可見超氧化物岐化酶(SOD）是一種抗氧化劑，是O-2的清除劑，只在O-2產(chǎn)生過多、SOD活性降低時(shí)才會(huì)致病［4］。

本研究發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示越婢加半夏湯用于治療小鼠過敏性哮喘，能顯著降低哮喘小鼠血清中IgE水平、減輕氣道炎癥，從而對過敏性哮喘起到治療作用；與哮喘組小鼠相比，越婢加半夏湯組小鼠肺組織中SOD活性與抑制率水平升高，肺組織中SOD活力與抑制率水平在2組之間差異具有顯著性(P＜0.05）。由此可見，越婢加半夏湯可升高小鼠肺組織SOD活力與抑制率水平，提高小鼠肺組織抗氧化能力，維持氧自由基生成與清除的動(dòng)態(tài)平衡，從而對過敏性哮喘起到治療作用。

綜上所述，越婢加半夏湯能顯著降低哮喘小鼠血清中IgE水平、減輕氣道炎癥，減輕支氣管壁及周圍間質(zhì)充血水腫；升高小鼠肺組織SOD活力與抑制率水平，提高小鼠抗氧化能力，維持氧自由基生成與清除的動(dòng)態(tài)平衡。越婢加半夏湯有“宣肺瀉熱，降逆平喘”之功，在治療上以“宣降”為大法，驅(qū)邪兼以扶正，其中的散、消、溫、涼、補(bǔ)諸法均以助其功能恢復(fù)為目的。在哮喘發(fā)病過程中減輕哮喘發(fā)病癥狀，改善哮喘氣道炎癥作用明顯，從而對過敏性哮喘起到治療作用。

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［2］王超，李淑蘭.尾加壓素II在支氣管哮喘中病理生理作用的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2009，15(3）：423-425.

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Yuebi Banxia decoction inhibits serum IgE and increases SOD activity in lung tissue in the mouse model of allergic asthma

REN Jia-yu，YANG Gui-fang，HU Song-yan，LIU Huan，WANG Yan，PU Xiaojun，HUANG Gao，WANG Wen-jia
(Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，China）

Objective To investigate the effect and mechanism of a Chinese traditional PrescriPtion，Yuebi Banxia decoction，on allergic asthma in mice by observing the changes of serum immunoglobulin E(IgE）and lung tissue suPeroxide dismutase(SOD）activity in the mouse model of allergic asthma.Methods Forty healthy Kunming mice were randomly divided into normal control grouP，asthma model grouP，dexamethasone intervention grouP and Chinese medicine PreParation grouP.The mouse model of asthma was generated by Peritoneal injection of ovalbumin(OVA）and susPension of aluminium hydroxide.The mice of traditional Chinese medicine grouP

Yuebi Banxia decoction in a dose of 1 mL/100 g，daily for 30 days.The mice of dexamethasone grouP were given intraPeritoneal injection of dexamethasone 1 mg/kg.The normal control grouP and asthma model grouP were given gastric gavage of Physiological saline.After 30 days administration，the serum levels of IgE and SOD activity of lung tissue were determined，and the Pathological changes of lung tissue were observed using HE staining.Results The mice of traditional Chinese medicinePreParation grouP showed significantly decreased serum IgE level，and significantly increased SOD activity than those of the asthma model grouP mice(P＜0.05 for both）.Conclusions Reduced serum IgE and increased SOD activity in the lung tissue of mice with allergic asthma，imProving the antioxidant ability of lung tissue，may be involved in the anti-allergic asthma mechanism of the Chinese traditional PrescriPtion Yuebi Banxia decoction.

Allergic asthma；Yuebi Banxia decoction，IgE，SOD；Lung；Mice

R-33 < class="emphasis_bold">【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

A

1671-7856（2015）09-0018-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.009.004

2013年貴州省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(編號：201310662008）。

任佳羽(1992-），女，研究方向：中醫(yī)學(xué)。E-mail：359884676@qq.com。

王文佳(1981-），女，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合研究。E-mail：595713949@qq.com。

2015-08-08