戴德淑 劉 翔 楊 陽 周 璇 駱曉梅 袁 飛 蔡 青 趙 勇 王增慧李向陽 顏 超 湯仁仙 任紅旗

甘西鼠尾草為唇形科(Lamiaceae)鼠尾草屬(Salvia)植物，又名大紫丹參、甘肅丹參等，為多年生草本植物，根莖入藥，味微苦，性微寒，具有活血、散瘀、鎮(zhèn)靜止痛的功效［1－2］。采用大孔吸附樹脂分離純化制備的甘西鼠尾草總酚酸提取物(SPE)，主要含有迷迭香酸和丹酚酸B等水溶性酚酸類成分［3］，能夠降低血清病性腎小球腎炎模型大鼠的蛋白尿(CN 2007 10048139.3)、降低正常大鼠的全血黏度［4－5］。然而，SPE 降低蛋白尿機(jī)制尚不清楚，其是否通過保護(hù)腎小球足細(xì)胞從而發(fā)揮降低蛋白尿的作用及其可能的藥理機(jī)制目前尚無這方面的研究。

嘌呤霉素氨基核苷(PAN)誘導(dǎo)的大鼠腎病模型，是模擬人腎小球足細(xì)胞損傷的最佳模型之一。SPE是否可直接作用于足細(xì)胞降低PAN腎病大鼠蛋白尿及其相關(guān)藥理機(jī)制目前尚無研究，本文采用經(jīng)典的PAN大鼠腎病模型，以他克莫司作為陽性對照［6］，驗(yàn)證 SPE是否能夠保護(hù)足細(xì)胞，從而降低PAN大鼠腎病模型的蛋白尿。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動物 清潔級SD大鼠，徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，體質(zhì)量150～180 g。領(lǐng)回適應(yīng)飼養(yǎng)1周，自由飲水、進(jìn)食，飼養(yǎng)溫度控制在24～26℃，12h交替照明，實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

主要試劑 PAN(Sigma)，他克莫司(安斯泰來)，DAB試劑盒(北京中杉金橋)，podocin抗體(Abcam)，nephrin抗體(武漢博士德生物)，羊抗兔－IgG(SantaCruz)，RNAisoPlus、SYBR Green(TaKaRa)，M－MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)，RIPA、PMSF、BCA試劑盒和BeyoECL Plus(碧云天生物)。

SPE由徐州醫(yī)學(xué)院附屬淮海醫(yī)院藥劑科中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，為甘西鼠尾草干燥根莖藥材按照固定工藝制備得到［3］(批號20090901－b15)，采用高效液相色譜法進(jìn)行含量測定(面積歸一化法)，加入1%羧甲基纖維素鈉(CMC－Na)水溶液配制成 5 mg/ml、10 mg/ml和20 mg/ml的溶液。

動物模型建立 大鼠隨機(jī)分為6組，正常組、模型對照組、陽性對照組、SPE低、中、高劑量組，各12只。正常組給予同等劑量生理鹽水一次性尾靜脈注射，余給予PAN 80 mg/kg尾靜脈一次性注射進(jìn)行。PAN注射后1d開始，每日固定時(shí)間，正常組、模型對照組以10 ml/kg灌胃給予1%CMC－Na溶液，陽性對照組以10 ml/kg灌胃給予他克莫司溶液，SPE低、中、高劑量組以 10 ml/kg分別灌胃給予 5 mg/ml、10 mg/ml、20 mg/ml SPE 溶液。

標(biāo)本留取 各組分別在第5、10、15、21天各處死大鼠3只。大鼠處死前1天，禁食不禁水，金屬代謝籠收集24h尿液，記錄尿量后去沉渣分裝，于－20℃冰箱保存。大鼠麻醉后取血分離血清，于－80℃冰箱保存;取一側(cè)腎臟，皮質(zhì)部分切成1 mm3大小用于電鏡切片，剩余組織用于組織切片染色;另一側(cè)腎臟迅速液氮冷凍，隨即轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱凍存，用于 Western Blot和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(RT－qPCR)分析。

血清白蛋白(Alb)、總膽固醇、三酰甘油、血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(SCr)采用西門子 ADVIA 2400全自動生化分析儀檢測，尿蛋白采用西門子BN ProSpec特定蛋白分析儀檢測。

實(shí)驗(yàn)方法和步驟

組織切片染色 2 μm石蠟切片，脫蠟水化后，行HE和PAS染色，脫水、透明、樹膠封片，顯微鏡下觀察。取4 μm石蠟切片，脫蠟水化后，抗原修復(fù)95℃ 20 min，3%過氧化氫室溫孵育15 min，PBS洗滌，山羊血清封閉 15 min，滴加一抗(podocin，1∶200;nephrin，1∶200)，37 ℃孵育 2h，PBS 洗滌，滴加二抗(1∶1 000)孵育30 min，PBS洗滌，滴加 DAB 顯色液，顯微鏡下控制顯色，蘇木素復(fù)染，碳酸鋰返藍(lán)，脫水、透明、封片，顯微鏡下每例標(biāo)本隨機(jī)選取10個(gè)視野，采用Image－Pro Plus(IPP)6.0圖像處理分析軟件［7］，比較各組平均光密度值(IOD)。

電鏡 1 mm3腎皮質(zhì)組織于4%戊二醛和1%鋨酸固定，乙醇、丙酮脫水后丙酮、樹脂置換和浸透，后包埋及切片染色，F(xiàn)EI Tecnai透射電子顯微鏡下觀察。

Western Blot免疫印跡測定 提取組織蛋白測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液煮沸，蛋白上樣每孔80 μg，電泳分離，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉室溫封閉，TBST 洗膜，一抗(nephrin 1 ∶300、podocin 1 ∶250、beta－actin 1 ∶1 000)4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜，二抗(1∶6 000)室溫孵育1h，TBST洗膜，BeyoECL Plus顯影。Image J軟件分析nephrin和podocin蛋白表達(dá)。

RT－qPCR 提取RNA，測定RNA濃度和純度，反轉(zhuǎn)錄 RNA，實(shí)時(shí)定量測定 nephrin、podocin的mRNA 表達(dá)水平。引物序列 β－actin:forward5＇－CGT－GGGCCGCCCTAGGCACCA－3＇，reverse5＇－TTGGCCT－TAGGGTTCAGGGGGG－3＇;nephrin:forward5＇－CCAG－AGTGGACGAACTATATTGGA－3＇，reverse5＇－GACC－AGTAACTGCCCGTTATCC－3＇;podocin:forward5＇－C－CTTTCCATGAGGTGGTAACCA－3＇，reverse5＇－GGAT－GGCTTTGGACACATGAG－3＇。反應(yīng)體系為 20 μl，60℃退火延伸30 s。分析基因相對表達(dá)量，以betaactin作為內(nèi)參照。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較時(shí)，若方差齊則采用單因素方差分析，若方差不齊則采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

SPE對尿蛋白的影響 各組大鼠尿蛋白定量在第5天時(shí)已明顯高于正常大鼠尿蛋白排泄量(P＜0.05)，第10天尿蛋白進(jìn)一步上升(P＜0.05)，第15天時(shí)逐漸下降，至第21天尿蛋白排泄量下降至正常。給予藥物干預(yù)后，大鼠尿蛋白排泄量降低，雖然陽性對照組與SPE高劑量組大鼠的尿蛋白排泄量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，但是尿蛋白降低的程度較為接近(表1)。x±s)

表1 PAN損傷足細(xì)胞不同時(shí)間各組大鼠24 h尿蛋白定量結(jié)果(mg/L，

血生化指標(biāo) 除正常組外，第5天時(shí)各組大鼠Alb下降，第10天時(shí)降至最低水平，至第21天時(shí)恢復(fù)至正常水平。陽性對照組和SPE高劑量組的Alb水平均高于模型對照組(第5、10天，P均＜0.05)(圖1)。各組間大鼠的血脂、BUN和SCr水平，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

HE和PAS染色 各組大鼠腎組織HE和PAS染色顯示，腎小球內(nèi)無系膜增生和炎性細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管叢無缺血、閉塞，無局灶節(jié)段黏連，無囊壁增厚，腎小球形態(tài)和腎小球基膜未見異常。

圖1 各組大鼠血清白蛋白水平動態(tài)改變

SPE對腎小球足細(xì)胞足突的影響 第5天時(shí)，除正常組外，余各組腎小球足細(xì)胞足突已開始部分融合;至第10天時(shí)，足突融合加重，模型對照組可見足突脫落，陽性對照組和SPE高劑量組病變程度較輕;第15天時(shí)，足突融合脫落程度較第10天時(shí)減輕，而SPE高劑量組和陽性對照組的足突形態(tài)接近正常;至第21天各組足突形態(tài)正常。從足突形態(tài)來看，陽性對照組的足突融合輕于SPE和模型對照組，SPE高劑量組病變程度較SPE中、低劑量組輕，而SPE各組的病變程度輕于模型對照組。以上說明SPE可保護(hù)足細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，且保護(hù)程度與藥物劑量有關(guān)。

SPE對足細(xì)胞裂孔膜蛋白表達(dá)和分布的影響免疫組化染色結(jié)果顯示，正常大鼠腎組織的podocin分布呈連續(xù)性線性。第5天時(shí)，各組大鼠的podocin表達(dá)仍呈連續(xù)性線性分布;第10天時(shí)，除陽性對照組和SPE中、高劑量組仍為連續(xù)性線性分布，模型對照組和SPE低劑量組的podocin蛋白出現(xiàn)不連續(xù)性分布;第15天時(shí)，podocin蛋白表達(dá)趨于線性分布;至第21天時(shí)，podocin蛋白表達(dá)分布恢復(fù)至連續(xù)性線狀(圖2)。

圖2 PAN損傷足細(xì)胞不同時(shí)間各組大鼠podocin免疫組化平均光密度值

IPP(6.0)軟件分析顯示，給予SPE、他克莫司干預(yù)治療后，大鼠的nephrin和podocin蛋白表達(dá)水平明顯高于模型對照組(圖2、3)。第5天時(shí)，模型對照組和SPE中劑量組的podocin蛋白較正常下降顯著(P＜0.05)，陽性對照組和SPE低、高劑量組下降不明顯;模型對照組、SPE組和陽性對照組大鼠Nephrin蛋白表達(dá)明顯低于正常大鼠(P＜0.05)。第10天時(shí)，蛋白表達(dá)下降更為明顯(P＜0.05)。第15天時(shí)，陽性對照組和SPE高劑量組的podocin蛋白表達(dá)開始上升，與正常組無明顯差異;nephrin蛋白表達(dá)已開始恢復(fù)，但與正常值之間仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。至第21天時(shí)，各組nephrin和podocin蛋白表達(dá)均達(dá)正常范圍。

圖3 PAN損傷足細(xì)胞不同時(shí)間各組大鼠nephrin蛋白免疫組化平均光密度值

Western Blot分析顯示(圖4)，陽性對照組和SPE組的蛋白表達(dá)均高于模型對照組。第5天時(shí)蛋白表達(dá)低于正常水平，以第10天為最低，但SPE高劑量組和陽性對照組高于模型對照組(P＜0.05)。而后蛋白表達(dá)水平開始上升，陽性對照組和SPE組的蛋白表達(dá)水平仍高于模型對照組，至第21天蛋白水平恢復(fù)正常。在第5、10、15天時(shí)，蛋白水平呈現(xiàn)出陽性對照組＞SPE高劑量組＞SPE中劑量組＞SPE低劑量組＞模型對照組的趨勢。

SPE對足細(xì)胞podocin和nephrin的mRNA表達(dá)的影響 RT－qPCR結(jié)果顯示(圖 5)，nephrin、podocin的mRNA表達(dá)量在第5天已經(jīng)下降(P＜0.05)，至第10天明顯下降至最低水平，而后開始上升，直至第21天恢復(fù)至正常水平。與模型對照組相比，經(jīng)過他克莫司和SPE干預(yù)治療后，在第5天和第10天時(shí)，nephrin和podocin的mRNA表達(dá)較模型對照組高(P＜0.05)。而陽性對照組與SPE高劑量組之間相比，各時(shí)間點(diǎn)無明顯差異。

討 論

蛋白尿是腎臟疾病最常見的臨床表現(xiàn)。腎小球足細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷與蛋白尿的形成密切相關(guān)，對維持裂孔膜的完整性有重要作用［8－9］。Nephrin 定位于足細(xì)胞裂孔隔膜區(qū)，通過多種方式參與調(diào)節(jié)足細(xì)胞肌動蛋白的功能;podocin與nephrin共同定位于脂筏區(qū)，參與維持濾過屏障［10－11］。Nephrin 和podocin對腎小球疾病發(fā)病機(jī)制的研究有重要意義，因此，我們選取nephrin、podocin蛋白來觀察其在本實(shí)驗(yàn)中的動態(tài)變化。

PAN注射后，通過蛋白尿定量分析、電鏡觀察腎小球足細(xì)胞足突病變、蛋白和mRNA水平分析nephrin和podocin表達(dá)等表明，我們成功建立了PAN大鼠腎病模型。與模型對照組相比，SPE與他克莫司均有降低PAN大鼠蛋白尿和保護(hù)裂孔膜蛋白的作用，以SPE高劑量組作用顯著。電鏡結(jié)果顯示，SPE組的足細(xì)胞足突融合較模型對照組減輕。免疫組化、Western Blot和RT－qPCR數(shù)據(jù)顯示，在第5、10和15天時(shí)，SPE組大鼠 nephrin和 podocin蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯高于模型對照組。除了降低蛋白尿的程度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，SPE以劑量依賴的方式與他克莫司在保護(hù)足細(xì)胞形態(tài)、裂孔膜蛋白方面具有相似的藥理作用。以上數(shù)據(jù)表明SPE有降低蛋白尿、保護(hù)足細(xì)胞的作用，且與藥物劑量有關(guān)。

圖4 甘西鼠尾草總酚酸提取物(SPE)對足細(xì)胞裂孔膜蛋白的作用

圖5 SPE對PAN大鼠腎臟nephrin和podocin mRNA的表達(dá)影響

前期實(shí)驗(yàn)表明SPE能降低血清病型腎小球腎炎模型的蛋白尿，本實(shí)驗(yàn)又證實(shí)了SPE能夠降低PAN大鼠腎病模型的蛋白尿、上調(diào) nephrin和podocin蛋白和mRNA表達(dá)水平、改善足突融合。PAN損傷足細(xì)胞，可能是直接損傷腎小球上皮細(xì)胞產(chǎn)生過量的ROS、脂質(zhì)過氧化物，使腎小球?yàn)V過膜的通透性改變，或是與腎小球細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞色素P450酶相互作用，產(chǎn)生H2O2［12－14］，又可能與炎癥因子、免疫反應(yīng)(TLR)等有關(guān)［15］，導(dǎo)致足細(xì)胞損傷，引起足突融合入脫落、nephrin和podocin再分布。由于SPE中迷迭香酸、丹酚酸B含量較高，目前尚無其對足細(xì)胞相關(guān)作用的研究報(bào)道，SPE降低蛋白尿的作用機(jī)理可能與迷迭香酸、丹酚酸B密切相關(guān)，如抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、干預(yù)凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。文獻(xiàn)報(bào)道，甘西鼠尾草能夠降低脂質(zhì)過氧化物的含量，顯著抑制羥自由基的產(chǎn)生［16］，我們推測SPE對足細(xì)胞的保護(hù)作用也可能通過上述的抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抑制細(xì)胞凋亡等有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，他克莫司具有抑制足細(xì)胞神經(jīng)鈣蛋白活性，保護(hù)和修復(fù)肌動蛋白結(jié)合蛋白Synaptopodin的作用［17－18］，是目前公認(rèn)的保護(hù)足細(xì)胞藥物。因而，我們研究采用他克莫司作為陽性對照以觀察SPE對足細(xì)胞的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)中，我們研究發(fā)現(xiàn)SPE具有降低蛋白尿、改善足突融合、保護(hù)裂孔膜蛋白的作用，這些作用效果與他克莫司相似。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了SPE能夠降低蛋白尿，并且具有保護(hù)足細(xì)胞的作用。至于SPE是通過何種單體成分發(fā)揮保護(hù)足細(xì)胞的作用，以及其保護(hù)足細(xì)胞的具體作用機(jī)制，目前我們正在從體外、體內(nèi)分別進(jìn)行這方面的相關(guān)研究，以期盡早明確SPE對足細(xì)胞保護(hù)的確切作用。

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