張麗娟， 高曉明

(蘇州大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究院， 江蘇 蘇州 215123)

鈣網(wǎng)蛋白片段cDNA克隆、蛋白表達(dá)及免疫學(xué)活性研究*

張麗娟， 高曉明*

(蘇州大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究院， 江蘇 蘇州 215123)

目的： 研究鈣網(wǎng)蛋白(CRT)發(fā)揮免疫生物學(xué)活性的主要功能區(qū)域。方法： 采用PCR法從CRT基因cDNA全長中擴(kuò)增第150-230位編碼氨基酸所對應(yīng)的核苷酸序列片段，利用分子生物學(xué)方法構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒，采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行原核表達(dá)；通過親和純化得到目的蛋白，分析目的蛋白特性；并通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)對蛋白的免疫學(xué)活性進(jìn)行分析。結(jié)果： 成功構(gòu)建了表達(dá)CRT150-230片段(rCRT/150-230)的原核表達(dá)質(zhì)粒，并從細(xì)菌裂解液上清中純化得到目的蛋白，蛋白單體通過分子間二硫鍵形成二聚體，天然狀態(tài)下形成多聚體；體外研究表明rCRT/150-230促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞的分裂，活化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮(NO)，誘導(dǎo)人外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α；體內(nèi)研究表明，rCRT/150-230刺激小鼠產(chǎn)生高滴度抗體，該特異性抗體能識別rCRT/150-230與rCRT。結(jié)論： rCRT/150-230蛋白具有與rCRT相似的免疫活性，因此推測該蛋白片段是全長CRT發(fā)揮免疫學(xué)活性的區(qū)域。

免疫學(xué)； 鈣網(wǎng)蛋白； 蛋白片段； 生物學(xué)活性

鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CRT)是一個(gè)維持機(jī)體Ca2+穩(wěn)態(tài)的鈣連蛋白，CRT存在于多種生物體中，包括脊椎動物、無脊椎動物乃至高等植物[1-3]。CRT的分子量為46 kDa，由N-domain、P-domain和C-domain[4-6]3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。CRT屬于多功能蛋白，參與了細(xì)胞中多種生物學(xué)過程，如分子伴侶、Ca2+平衡、細(xì)胞黏附、基因表達(dá)、凋亡細(xì)胞清除、抗腫瘤免疫應(yīng)答等。由于CRT特殊的結(jié)構(gòu)組成，研究人員對其中一些結(jié)構(gòu)域或片段進(jìn)行了功能研究[7-10]，但關(guān)于CRT免疫學(xué)活性的研究并未見報(bào)道。本課題組其他研究人員已經(jīng)證明了CRT中存在一段高保守性片段39-272片段，在CRT中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[11]。為了找到CRT發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能更為核心的區(qū)域，本研究利用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)從CRT基因cDNA全長中擴(kuò)增出從150-230位編碼氨基酸所對應(yīng)的核苷酸序列片段(CRT/150-230)，并對該蛋白的免疫生物學(xué)活性進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 菌株E.coliDH5α與E.coliBL21(DE3)來源于天根生化公司，質(zhì)粒pGEM-T來源于Promega，質(zhì)粒pET28a、pET28a-CRT為本室保存。

1.1.2 細(xì)胞 脾細(xì)胞取自6～8周齡的雌性BALB/c小鼠，體重約18～20 g；腹腔巨噬細(xì)胞來源于硫代乙醇酸鈉(3%)處理3 d后的雌性C57BL/6小鼠，每只注射體積2 mL， 6～8周齡，體重18～20 g。實(shí)驗(yàn)動物均由上海斯萊克動物有限公司提供。

1.1.3 酶與主要試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、T4 DNA聚合酶來源于Promega公司，質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA回收試劑盒來源于AXYGEN公司，Ni-NTA凝膠購自Novagen公司，PCR引物來源于Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 以pET28a-CRT質(zhì)粒為模板，以P1(5′CGGATCCTACAAGGGCAAGAATGTGCTGAT3′)、P2(5′CCCAAGCTTCTAATCTGTGGGGTCATCGATCTTG3′)為引物通過PCR擴(kuò)增CRT片段150～230序列，將片段連接至pGEM-T Vector，轉(zhuǎn)化至克隆菌DH5α中，從正確的克隆菌中抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切，將酶切出的目的片段連接至pET28a質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化至克隆菌DH5α中，鑒定正確后，抽提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌BL21中。

1.2.2 rCRT/150-230蛋白表達(dá) 將攜帶目的基因序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)中，從卡那霉素(Kana,100 mg/L)瓊脂糖平板上篩選陽性克隆，挑取平板上單克隆接種于Kana培養(yǎng)基LB中，37 ℃培養(yǎng)6～8 h，轉(zhuǎn)接一次新鮮的LB，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，以終濃度0.1 mmol/L的IPTG為誘導(dǎo)條件，培養(yǎng)5 h即可。

1.2.3 蛋白親和純化 擴(kuò)增培養(yǎng)重組表達(dá)菌，收集菌體并將其懸浮于1×緩沖液(5 mmol/L咪唑緩沖液)中，冰水中超聲破碎(工作時(shí)間與間歇時(shí)間各3 s，功率為200 W，每次時(shí)間為20 min，共3次)，離心收集裂解液上清，純化前用0.000 45 mm 濾膜過濾，并與Ni-NTA柱室溫顛倒孵育2 h，重新裝柱，用1×binding buffer將雜蛋白沖洗凈，用300 mmol/L咪唑緩沖液將目的蛋白洗脫出來。

1.2.4 脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 引頸處死BALB/c，于超凈臺取脾并研磨成單細(xì)胞懸液，ACK裂解紅細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液(10%胎牛血清)將單細(xì)胞懸液調(diào)為5×106cell/mL細(xì)胞數(shù)加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)孔中加入一定濃度的蛋白樣品，對照孔加入等體積的培養(yǎng)基， 37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)，48 h后無菌加入0.02 mL 噻唑藍(lán)(濃度為5 mg/mL)，反應(yīng)4 h后離心棄上清，加入0.15 mL DMSO，振蕩10 min，檢測OD 492 nm吸光度值。

1.2.5 腹腔巨噬細(xì)胞活化實(shí)驗(yàn) 取C57BL/6小鼠，每只小鼠腹腔注射2 ml 3%硫代乙醇酸鈉，第3 天將小鼠引頸處死，無菌PBS灌洗小鼠腹腔，提取腹腔巨噬細(xì)胞(一般情況下不需使用ACK裂解紅細(xì)胞)，用培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)至1.5×106/mL，置于96孔培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)組中加入一定濃度的蛋白樣品，對照組加入等體積的培養(yǎng)基，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取上清液，測定其NO含量。

1.2.6 人外周血單個(gè)核細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn) 取正常人外周血，用淋巴細(xì)胞分離液無菌分離出單個(gè)核細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)為5×106/mL加入96孔培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)組為一定濃度的蛋白樣品，對照組為等體積的培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h后取細(xì)胞培養(yǎng)上清，測定其TNF-α含量。

2 結(jié)果

2.1 rCRT/150-230原核表達(dá)載體構(gòu)建

以pET28a-CRT質(zhì)粒為模版，PCR法擴(kuò)增rCRT/150-230 CDNA(圖1A)，將該片段與pGEM-T Vector連接并測序成功后，經(jīng)BamHI和HindⅢ 雙酶切鑒定(圖1B)，將酶切產(chǎn)物連接至pET28a，并轉(zhuǎn)化至克隆菌DH5α中，挑取單克隆進(jìn)行菌體PCR鑒定，得到大小與預(yù)期一致片段(圖1C)，提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21中，經(jīng)菌體PCR鑒定，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

注：A為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，B為雙酶切鑒定結(jié)果(1為酶切質(zhì)粒，2為未酶切質(zhì)粒)，C為菌體PCR鑒定(1為rCRT/150-230菌PCR，2為空白對照)

2.2 rCRT/150-230蛋白表達(dá)及純化

將構(gòu)建好的原核重組表達(dá)菌株，于37 ℃，0.1 mmol/L IPTG條件下進(jìn)行大量擴(kuò)增及誘導(dǎo)表達(dá)，從細(xì)菌裂解液上清中檢測到目的蛋白(圖2A)，采用親和層析法，提取目的蛋白(圖2B)。

注：A為蛋白表達(dá)(1為未誘導(dǎo)菌液，2為誘導(dǎo)菌液上清，3為誘導(dǎo)菌液包涵體)，B為蛋白純化(1為裂解上清液，2為流穿液，3為洗滌液，4為洗脫液)

2.3 rCRT / 150-230理化特性分析

對rCRT / 150-230及實(shí)驗(yàn)室原有的原核表達(dá)的CRT片段蛋白(rCRT/39-272，rCRT/120-250)進(jìn)行理化特性分析，結(jié)果表明，CRT片段150-230蛋白純度不低于90%。 Native-PAGE及SDS-PAGE跑膠結(jié)果顯示，在自然狀態(tài)下rCRT/150-230以多聚體的形式存在(圖3A)，在沒有還原劑2-ME存在的條件下，rCRT/150-230以二聚體形式存在(圖3B)。標(biāo)簽蛋白部分并無半胱氨酸存在，排除重組蛋白rCRT/150-230兩端的標(biāo)簽蛋白對蛋白理化性質(zhì)的影響，說明蛋白存在分子間二硫鍵。

注：A為非變性膠鑒定(1為rCRT，2為rCRT/120-250，3為rCRT/150-230，4為rEGFP)， B為SDS-PAGE膠鑒定(1為rCRT/39-272，2為rCRT/120-250， 3為rCRT/150-230，4為 rEGFP)

2.4 rCRT/150-230免疫學(xué)活性

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)鑒定目的蛋白的免疫學(xué)活性，結(jié)果表明，rCRT/150-230可有效促進(jìn)脾細(xì)胞增殖(圖4A)，還能夠刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌NO(圖 4B)，并且能夠刺激正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)分泌TNF-α(圖4C)，并且刺激效果與全長CRT無顯著差異。rCRT/150-230、rCRT組與rEGFP及空白對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 rCRT/150-230免疫原性

通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)鑒定原核蛋白的免疫原性。結(jié)果顯示，rCRT/150-230可使小鼠體內(nèi)產(chǎn)生高滴度的抗rCRT/150-230特異性抗體(圖 5A)，并且該抗體能夠識別rCRT蛋白(圖 5B)，說明該蛋白具有良好的免疫原性。

注：A為小鼠脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，B為小鼠腹腔巨噬細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)，C為人外周血單個(gè)核細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)；與對照組比較，(1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001

注：A為rCRT/150-230免疫血清抗體效價(jià)測定，B為rCRT/150-230血清抗體識別rCRT

3 討論

CRT最早是從肌漿網(wǎng)中分離得到的一種Ca2+結(jié)合蛋白，在維持Ca2+穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。隨著研究不斷深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CRT是一個(gè)多功能保守蛋白，廣泛存在于生物體中，不僅存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)揮作用，在細(xì)胞膜及胞外都參與了生物學(xué)過程，膜型CRT在清除機(jī)體內(nèi)凋亡的細(xì)胞及抵御腫瘤的免疫過程都發(fā)揮了重要作用[12-13]； 胞外也檢測到可溶性CRT，尤其在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者的血清和關(guān)節(jié)液中檢測到了可溶性CRT的存在，而健康人中未檢測到CRT[11]。Tarr等[14]研究發(fā)現(xiàn)，RA患者的血清及關(guān)節(jié)液中可溶性CRT與疾病活動度指標(biāo)相關(guān)，提示了可溶性CRT在臨床應(yīng)用中可作為一個(gè)新的診斷指標(biāo)或藥物靶標(biāo)。由于CRT具有與熱休克蛋白相似的免疫學(xué)活性[15]，被認(rèn)為是廣義熱休克蛋白家族的一員，參與機(jī)體的固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。本研究前期結(jié)果證實(shí)了可溶性CRT的免疫學(xué)活性，并且將CRT發(fā)揮免疫學(xué)活性的功能片段確定為39-272[11], 在實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)之上，本研究對CRT的功能片段進(jìn)行更精確的研究。

本研究通過分子生物學(xué)方法，經(jīng)PCR擴(kuò)增出CRT片段150-230，成功構(gòu)建rCRT/150-230原核表達(dá)質(zhì)粒。結(jié)果表明，rCRT/150-230在原核表達(dá)菌中大部分以可溶性形式存在，不易降解，便于純化。根據(jù)rCRT/150-230的氨基酸組成，分子內(nèi)存在一個(gè)半胱氨酸，理論上可形成分子間二硫鍵，在維持二硫鍵自然存在的情況下，該蛋白是以二倍體的形式存在，與預(yù)期相符。對純化得到的蛋白進(jìn)行體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)檢測其免疫生物學(xué)活性，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示150-230片段蛋白促進(jìn)了脾細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO、誘導(dǎo)人外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子TNF-α。rCRT/150-230，這些生物學(xué)特性與Hong等[11]報(bào)道的rCRT/39-272的生物學(xué)活性相似。Huang等[16]研究表明，CRT的生物學(xué)活性受到蛋白寡聚化或多聚化程度的影響，多聚體形式的rCRT比單體形式的rCRT有更強(qiáng)的生物學(xué)活性，而自然狀態(tài)下，Native-PAGE則顯示rCRT/150-230是以多聚體的形式存在，其表現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫生物學(xué)活性。本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，150-230片段蛋白誘導(dǎo)小鼠發(fā)生體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生高滴度的抗150-230片段蛋白與全長CRT抗體，即蛋白150-230片段具有很強(qiáng)的免疫刺激效果，與全長CRT相當(dāng)。

本研究結(jié)果表明rCRT/150-230區(qū)域是CRT的主要免疫學(xué)活性區(qū)域，能否找到CRT更小的功能區(qū)域還有待進(jìn)一步研究。

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(2015-04-18收稿，2015-05-26修回)

中文編輯： 劉 平； 英文編輯： 趙 毅

A Study of cDNA Cloning, Protein Expression and Immunological Activity of Calreticulin Fragment

ZHANG Lijuan， GAO Xiaoming

(InstituteofBiologyandMedicineSciences,SoochowUniversity,Suzhou215123,Jiangsu,China)

Objective: To investigate the major functional areas of calreticulin (CRT) that exerts immunobiological activity. Methods: Amplified a 150-230 fragment of rCRT and constructed a prokaryotic expression vector by molecular biology method. Then adopted E.Coli to express the protein which was purified by affinity purification. The biochemical property of rCRT/150-230 was tested. Analyzing the immunobiological activity of this proteininvitroandinvivo. Results: rCRT/150-230 protein was purified from the bacterial lysate supernatant, and it had good solubility and existed as polymer in nature. rCRT/150-230 could effectively stimulate the proliferation of mice spleen cells, and activate the secretion of NO of mice macrophage, and stimulate human peripheral blood mononuclear cells to secrete TNF-α, and has strong immunogenicity that induces the process of humoral immune response in mice. Conclusion: rCRT/150-230 appears similarity immunobiologic functions with rCRT, it could be inferred that it might be the major functional area of rCRT.

immunology； calreticulin； protein fragment； biological activity

時(shí)間：2015-08-07

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150807.2241.014.html

R34-33

A

1000-2707(2015)09-0954-05

*通信作者 E-mail:xmgao@suda.edu.cn