胡曉彥， 王季石， 吳乘龍， 劉 霞， 鐘 愉

(1.貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院 血液腫瘤科， 貴州 貴陽(yáng) 550002； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 血液科， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 微生物教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 4.貴陽(yáng)市中醫(yī)學(xué)院 組織胚胎學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550002； 5.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 病理教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

藥前酶基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)黑色素瘤靶向治療的研究*

胡曉彥1， 王季石2， 吳乘龍3， 劉 霞4， 鐘 愉5

(1.貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院 血液腫瘤科， 貴州 貴陽(yáng) 550002； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 血液科， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 微生物教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 4.貴陽(yáng)市中醫(yī)學(xué)院 組織胚胎學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550002； 5.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 病理教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

目的： 利用藥前酶基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)提高惡性黑色素瘤局部化療效果。方法： 從雄性大鼠股骨、脛骨骨髓中分離、培養(yǎng)大鼠BMSCs并鑒定；將細(xì)胞色素氧化酶P4502E1(CYP2E1)以含增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)的重組腺病毒為載體轉(zhuǎn)染BMSCs，用RT-PCR和熒光顯微鏡觀察綠色熒光的方法來(lái)檢測(cè)目的基因的表達(dá)；將人黑色素瘤細(xì)胞MV3注射到裸鼠背部皮下，建立裸鼠MV3移植瘤模型，將移植瘤模型分為4組，分別給予CYP2E1-BMSCs及達(dá)卡巴嗪，單用CYP2E1-BMSCs，單用達(dá)卡巴嗪以及生理鹽水治療，并檢測(cè)各組的體內(nèi)局部抗腫瘤效應(yīng)。結(jié)果： 成功分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，形態(tài)上均一，貼壁生長(zhǎng)，以長(zhǎng)梭形為主，體積小，核漿比大，呈明顯的同向性改變，漩渦狀盤(pán)旋排列；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)提示高表達(dá)CD29、CD71，低表達(dá)CD34、CD45；體外經(jīng)不同誘導(dǎo)體系培養(yǎng)后提示具有成骨、成脂、成軟骨潛能；鑒定后的BMSCs經(jīng)重組腺病毒轉(zhuǎn)染后，熒光顯微鏡可觀察到轉(zhuǎn)基因靶細(xì)胞EGFP表達(dá)，RT-PCR法從mRNA水平檢測(cè)到目的基因在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中表達(dá)；熒光顯微鏡觀察治療后裸鼠的腫瘤及各臟器的組織切片提示CYP2E1-BMSCs能聚集在腫瘤組織及轉(zhuǎn)移灶周?chē)?，CYP2E1-BMSCs聯(lián)合化療藥物組局部凋亡率明顯高于單純化療組及空白對(duì)照。結(jié)論： CYP2E1-BMSCs在體內(nèi)具有協(xié)同化療藥物抗腫瘤的作用，并有向腫瘤細(xì)胞聚集的特點(diǎn)。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 腺病毒科； 載體； 細(xì)胞色素P450 CYP2E1; 黑色素瘤

到目前為止,轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤一直缺乏有效的治療方案, 美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)僅批準(zhǔn)了烷化劑達(dá)卡巴嗪作為治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的藥物,但治療1年總生存率僅27%,中位生存期約5～11月[1]。因此多種治療方法的聯(lián)合應(yīng)用成為治療惡性黑色素瘤的新熱點(diǎn)[2-4]。本研究設(shè)計(jì)腺病毒載體構(gòu)建含人細(xì)胞色素氧化酶P4502E1(CYP2E1)cDNA的重組子轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)，利用間充質(zhì)干細(xì)胞向腫瘤部位聚集的特性，將達(dá)卡巴嗪的藥前酶即CYP2E1帶到腫瘤部位，CYP2E1氧化代謝達(dá)卡巴嗪，生成損傷DNA的代謝產(chǎn)物，以提高藥物在腫瘤局部的抗腫瘤作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 質(zhì)粒、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞株 含CYP2E1基因及增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)重組腺病毒顆粒(pAdCMV-2E1)由本課題組王季石教授提供。SD雄性大鼠,80～100 g,由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供；BALB/cA-nude雄性裸鼠，16～18 g，4～6周齡，在SPF(specific pathogen free)條件下裸鼠室內(nèi)飼養(yǎng)，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(免疫證明書(shū)號(hào)：中科動(dòng)檢 No.0003276)。MV3細(xì)胞購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.1.2 主要試劑 Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen原裝)，RT-PCR一步法試劑盒(Promega公司)，RT-PCR 引物(上海生工合成)，F(xiàn)ITC標(biāo)記小鼠抗CD34IgG(santa cruz)，F(xiàn)ITC標(biāo)記小鼠抗CD45IgG(Biolegend)，PE標(biāo)記小鼠抗CD29IgG(Biolegend)，PE標(biāo)記小鼠抗CD71IgG(Biolegend)，TransFastTMTransfection Reagent(promega)；注射用達(dá)卡巴嗪(南京制藥廠有限公司，0.1 g/瓶，工作液濃度4.5 mg/kg生理鹽水稀釋)，percoll 淋巴細(xì)胞分離液 (Sigma公司,美國(guó))，TUNEL 細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，熒光染料Hoechst33342,兔抗人S-100抗體(Dako公司)，鼠抗人HMB45抗體(Dako公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠BMSCs的分離及培養(yǎng) 4周齡健康雄性SD大鼠,頸椎脫臼法處死，無(wú)菌條件下分離大鼠四肢骨，剪去骨兩端,用低糖DMEM 培養(yǎng)基將骨髓沖出，并將沖洗下來(lái)的全骨髓細(xì)胞經(jīng)1.073 g/mL的percoll細(xì)胞分離液離心后，取單核細(xì)胞層收集于一次性塑料細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)的第1～6 d，每3 d換液,以后每2～3 d全量換液。第7～10 d，細(xì)胞鋪滿瓶底達(dá)到90%左右時(shí)1∶2比例傳代，傳代培養(yǎng)至第3代。

1.2.2 重組腺病毒pAdCMV-2E1感染大鼠BMSCs 將鑒定明確的BMSCs接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，接種細(xì)胞數(shù)為1×106細(xì)胞/瓶。48 h后待細(xì)胞鋪至瓶底60%左右，將培養(yǎng)液吸出，加入適量病毒液，感染強(qiáng)度(multiplicity of infection ,MOI)約為1 000蝕斑形成單位(plaque forming unit, pfu)/細(xì)胞的pAdCMV-2E1，置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每20 min“十”字搖晃一次，4 h后補(bǔ)加新L-DMEM完全培養(yǎng)基，于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 建立裸鼠皮下移植瘤模型 人黑色素瘤細(xì)胞株(MV3)在RPMI1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和鏈霉素)于37 ℃ 、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MV3細(xì)胞制成懸液濃度為8.17×107個(gè)/mL的細(xì)胞懸液300 μL于無(wú)菌條件下接種于裸鼠背部皮下。

1.2.4 CYP2E1-BMSCs體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng) 將移植瘤模型分為4組進(jìn)行試驗(yàn)。1組：將CYP2E1-BMSCs體外Hoechst33342熒光染色后，調(diào)整濃度為1×106/mL細(xì)胞懸液，以400 μL/只經(jīng)靜脈(尾靜脈，球后靜脈)注入試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，1周后經(jīng)靜脈(尾靜脈，球后靜脈)進(jìn)行化療藥物注射；2組：僅用CYP2E1-BMSCs經(jīng)靜脈注入試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)；3組：僅用達(dá)卡巴嗪經(jīng)靜脈注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)；4組：予生理鹽水經(jīng)靜脈注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)。1,2組所涉及CYP2E1-BMSCs細(xì)胞數(shù)量相同。按照達(dá)卡巴嗪標(biāo)準(zhǔn)治療1療程(10 d)，達(dá)卡巴嗪給藥劑量利用體重?fù)Q算法根據(jù)公式 B種動(dòng)物的劑量(mg/kg)=W×A種動(dòng)物的劑量(mg/kg)換算，其中W為折算系數(shù)，人和小鼠間的折算系數(shù)為9.01。其中人的靜脈注射劑量為2.5～6.0 mg/kg。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 BMSCs的鑒定 通過(guò)對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、表面標(biāo)志物鑒定(流式細(xì)胞術(shù))及多向分化能力檢測(cè)完成對(duì)分離培養(yǎng)的大鼠BMSCs的鑒定。多向分化能力檢測(cè)方法：分別予成骨誘導(dǎo)體系、脂肪誘導(dǎo)體系、成軟骨誘導(dǎo)體系培養(yǎng)14 d后，再分別用堿性磷酸酶染色、紅油0染色及蕃紅花于亮綠染色和n型膠原染色。

1.3.2 基因轉(zhuǎn)染后BMSCs中CYP2E1表達(dá)檢測(cè) 含目的基因重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h時(shí)用RT-PCR的方法和熒光顯微鏡觀察綠色熒光的方法來(lái)檢測(cè)目的基因的表達(dá)。

1.3.3 裸鼠皮下移植瘤模型的鑒定 人黑色素瘤細(xì)胞株(MV3)注射到裸鼠皮下后觀察注射部位腫瘤灶形成并測(cè)量。以注射局部腫塊直徑為(1.0±0.1)cm的裸鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1.3.4 抗腫瘤效應(yīng)檢測(cè) 將移植瘤模型分組進(jìn)行治療,在療程結(jié)束后，處死試驗(yàn)動(dòng)物，并取出背部腫瘤及心、腦、肺、肝、脾、腎等重要臟器。將試驗(yàn)動(dòng)物各臟器病理切片做S100蛋白和HMB45免疫組化染色以判斷移植腫瘤在小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移情況，并以熒光顯微鏡觀察了解CYP2E1-BMSCs向腫瘤聚集的特性。將試驗(yàn)動(dòng)物背部腫瘤病理切片，TUNEL 法檢測(cè)各組腫瘤細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果判定：DAB 顯色后光學(xué)顯微鏡下觀察，以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為凋亡細(xì)胞。每張切片隨機(jī)取 5 個(gè)視野(100×)，觀察并計(jì)數(shù) 500 個(gè)細(xì)胞，以 TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)作為 TUNEL 檢測(cè)的結(jié)果判定。計(jì)算凋亡指數(shù)(PI)來(lái)表示各組細(xì)胞的凋亡程度，PI=(凋亡細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 采用多個(gè)獨(dú)立樣本比較的秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs分離、培養(yǎng)及鑒定

采用密度梯度分離法獲得的 BMSCs 形態(tài)較為均一，呈大圓形單核； 培養(yǎng)24 h后，部分大圓形細(xì)胞開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，少量細(xì)胞呈現(xiàn)短梭形改變；培養(yǎng)48～72 h后，貼壁細(xì)胞明顯增多，形態(tài)上以圓形和短梭形為主(圖1)；傳至第3代時(shí)細(xì)胞增殖迅速，幾乎全部貼壁生長(zhǎng)，以長(zhǎng)梭形為主，體積小，核漿比大，呈明顯的同向性改變，漩渦狀盤(pán)旋排列(圖1)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)傳代 BMSCs中高表達(dá)CD29，陽(yáng)性細(xì)胞率為(96.62±0.42)%；部分表達(dá)CD71，陽(yáng)性細(xì)胞率為(25.14±2.28)%；低表達(dá)CD34，陽(yáng)性細(xì)胞率為(2.81±0.75)%；低表達(dá)CD45，陽(yáng)性細(xì)胞率為(12.98±2.11)%(圖2)。誘導(dǎo)2周后成骨誘導(dǎo)細(xì)胞堿性磷酸酶染色呈陽(yáng)性;脂肪誘導(dǎo)體系中細(xì)胞經(jīng)油紅0染色,蘇木素復(fù)染后,鏡下觀察細(xì)胞核呈淺蘭色,胞漿內(nèi)橘紅色脂肪滴清晰可見(jiàn)。成軟骨誘導(dǎo)體系中,蕃紅花于亮綠染色和n型膠原染色陽(yáng)性，證明該細(xì)胞能在體外經(jīng)誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞。

2.2 基因轉(zhuǎn)染后BMSCs中CYP2E1表達(dá)檢測(cè)

含CYP2E1的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs后，被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平CYP2E1表達(dá)的量大于對(duì)照組，分子量標(biāo)準(zhǔn)由上至下分別為600、500、400、300、200及100 bp,目的條帶所在位置約為365 bp(見(jiàn)圖3)。熒光顯微鏡檢測(cè)顯示，BMSCs表達(dá)EGFP，提示含有EGFP的腺病毒載體已攜帶CYP2E1成功轉(zhuǎn)染BMSCs(圖4)。

2.3 裸鼠皮下移植瘤模型的鑒定

所有觀察的裸鼠接種后4～5周接種部位均有局部皮下腫塊隆起，之后逐漸增大，但未見(jiàn)明顯的色素沉著，顏色加深，形成腫瘤結(jié)節(jié)，為單發(fā)，分葉或不分葉，表面光滑，部分有壞死或潰瘍。腫瘤結(jié)節(jié)形成平均潛伏期為36 d(圖5)。 2.4 轉(zhuǎn)基因CYP2E1-BMSCs體內(nèi)向腫瘤部位聚集

實(shí)驗(yàn)裸鼠各重要臟器病理組織切片HE染色提示肺、脾等臟器出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移灶，瘤組織排列結(jié)構(gòu)復(fù)雜，呈巢狀、或彌散分布，可見(jiàn)較多大小不等的黑色素顆粒。瘤細(xì)胞形態(tài)多種多樣有上皮樣、梭形、小痣細(xì)胞樣、氣球樣細(xì)胞及單核或多核瘤巨細(xì)胞等類(lèi)型。細(xì)胞體積大，多邊形，核呈空泡狀，核仁明顯，胞漿豐富，淡染。部分可見(jiàn)核分裂象(圖6)。用免疫組化Elivision二步法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)S100蛋白和HMB45，見(jiàn)胞漿，胞膜均呈棕黃色，提示為陽(yáng)性反應(yīng)(圖7、8)，進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)移灶為黑色素瘤細(xì)胞。CYP2E1-BMSCs經(jīng)熒光染色后，細(xì)胞核染成淡藍(lán)色(圖9)。將經(jīng)熒光染色的CYP2E1-BMSCs注射到實(shí)驗(yàn)裸鼠后，可用熒光顯微鏡在轉(zhuǎn)移灶內(nèi)觀察到發(fā)出藍(lán)色熒光的細(xì)胞，體內(nèi)無(wú)自發(fā)熒光細(xì)胞，所以它們是CYP2E1-BMSCs，這些細(xì)胞向腫瘤部位聚集，而不在周?chē)＝M織中被發(fā)現(xiàn)(圖10)。2.5 轉(zhuǎn)基因CYP2E1-BMSCs體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)檢測(cè)

試驗(yàn)動(dòng)物背部腫瘤病理切片顯示，CYP2E1-BMSCs聯(lián)合達(dá)卡巴嗪協(xié)同治療組(1組)腫瘤組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量的凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒，且明顯多于BMSCs治療組(2組)、達(dá)卡巴嗪治療組(3組)及生理鹽水治療組(4組)(圖11)。TUNEL法檢測(cè)各組腫瘤細(xì)胞凋亡情況結(jié)果顯示，各組腫瘤組織中細(xì)胞凋亡率(PI)分別為：CYP2E1-BMSCs及達(dá)卡巴嗪協(xié)同治療組(35.2±2.1)%，CYP2E1-BMSCs治療組(12±1.2)%，達(dá)卡巴嗪治療組(21.2±0.4)%，生理鹽水治療對(duì)照組(11.2±1.1)%。

3 討論

今天轉(zhuǎn)移性黑色素治療進(jìn)入百家爭(zhēng)鳴的時(shí)代，各種小分子靶向治療，免疫治療的涌現(xiàn)為改善患者的預(yù)后帶來(lái)曙光，然而經(jīng)典化療并未退出歷史舞臺(tái)，一項(xiàng)含423例晚期黑色素瘤患者臨床研究提示，生物化療能延長(zhǎng)患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存期，療效明顯優(yōu)于大劑量干擾素治療[1]。提高經(jīng)典化療藥物的治療效果同樣也是改善疾病預(yù)后的有效途徑。

提高化療藥物腫瘤局部殺傷效應(yīng)以減少全身治療副反應(yīng)是有效提高化療效果的途徑。而基因介導(dǎo)的酶前藥治療(gene directed enzyme prodrug therapy，GDEPT)應(yīng)運(yùn)而生[5]。GDEPT靶向殺傷腫瘤的效應(yīng)是通過(guò)引入外源代謝酶基因和前藥例如環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、達(dá)卡巴嗪，使其聚集在腫瘤周?chē)砸鲆环N強(qiáng)大的“旁觀者效應(yīng)”，殺傷周?chē)槐磉_(dá)具有活化前藥活性的酶的腫瘤細(xì)胞[5-6]。在肝臟的眾多酶類(lèi)中，以P450為代表的混合功能氧化酶系(mixed functional oxidase, MFO)起著重要作用，人類(lèi)已合成的近25萬(wàn)個(gè)化合物中絕大多數(shù)為P450的底物的代謝酶[7]。本研究所涉及CYP2E1屬于P450酶系的微粒體P450。在哺乳動(dòng)物CYP2家族中，CYP2E1同功酶最為保守，表現(xiàn)在人和大鼠的CYP2E1共享75%核苷酸和78%氨基酸序列同源性；在大鼠、小鼠、家兔和人的CYP2E亞家族僅發(fā)現(xiàn)唯一基因CYP2E1。它主要存在于肝細(xì)胞和腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，參與藥物、致癌物、類(lèi)固醇激素和脂肪酸的氧化代謝，代謝底物達(dá)70多種，為前致癌物(procarcinogen)、前毒物(protoxin)和臨床藥物[7]，其中包括了抗腫瘤藥物達(dá)卡巴嗪，該藥為治療黑色素瘤等惡性腫瘤的重要化療藥物，其特點(diǎn)是本身并無(wú)毒性或致癌作用，但在體內(nèi)經(jīng)CYP2E1氧化代謝后，可生成損傷DNA的代謝產(chǎn)物，因此成為極有潛力的化療前藥[8-9]。將目的基因CYP2E1定位于腫瘤，使其能夠聯(lián)合前藥發(fā)揮殺傷腫瘤的效應(yīng)，是實(shí)現(xiàn)靶向治療腫瘤的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。BMSCs是一種多潛能干細(xì)胞,能在體外增殖維持非分化狀態(tài),并具有分化成骨、軟骨、心肌、血管內(nèi)皮細(xì)胞等中胚層組織的潛能。BMSCs易于培養(yǎng)和遺傳修飾，多次傳代后分化能力和增殖能力基本保持不變；進(jìn)入宿主體內(nèi)后能長(zhǎng)期存活且能持續(xù)表達(dá)所攜帶的目的基因；另外BMSCs具有低免疫原性，小鼠BMSCs給大鼠注射，異種BMSCs未被排斥，在骨髓腔內(nèi)持續(xù)存在[10-13]。更重要的是，BMSCs可以產(chǎn)生某種生物因子并定位于腫瘤，并證實(shí)了腫瘤的微環(huán)境構(gòu)建過(guò)程中更優(yōu)先的選擇了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞而不是其他的組織細(xì)胞，顯示了BMSCs潛在的腫瘤靶向聚集的特點(diǎn)[14]。

A B注：A骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)72 h(200×),B骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)72 h(100×)

圖2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表型鑒定

圖3 RT-PCR 電泳圖檢測(cè)CYP2E1表達(dá) 圖4 BMSCs上EGFP的表達(dá)(400×)

圖5 人黑色素瘤裸鼠移植模型 圖6 腫瘤組織切片HE染色(200×)

圖7 腫瘤組織HMB45表達(dá)(Elivisian法，×200) 圖8 腫瘤組織S-100表達(dá)(Elivisian法，×200)

注：黃色箭頭所指為正常肺組織，紅色 箭頭所指為黑色素瘤轉(zhuǎn)移灶

1組 2組 3組 4組

在本研究中，將轉(zhuǎn)染了CYP2E1的大鼠BMSCs體外熒光染色后輸入人黑色素瘤裸鼠模型體內(nèi)，實(shí)驗(yàn)終止后對(duì)其腫瘤和重要器官組織的病理切片用倒置熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)BMSCs聚集在腫瘤組織及臟器腫瘤轉(zhuǎn)移灶，而不在其他非腫瘤組織中。提示CYP2E1-BMSCs有向腫瘤聚集及參與腫瘤構(gòu)建的特點(diǎn)，這個(gè)結(jié)果與Matus Studeny等[14]人的研究結(jié)果一致。原位末端標(biāo)記法(TUNEL 染色)檢測(cè)結(jié)果顯示CYP2E1-BMSCs聯(lián)合達(dá)卡巴嗪協(xié)同治療組及達(dá)卡巴嗪治療組的腫瘤組織內(nèi)有大量灶性分布的凋亡細(xì)胞，且前者較后者更多，CYP2E1-BMSCs聯(lián)合達(dá)卡巴嗪可有效提高達(dá)卡巴嗪體內(nèi)抗腫瘤作用，為提高惡性黑色素瘤化療效果及綜合治療策略上提供了新的思路。

[1] Ives NJ,Stowe RL, Lorigan P, et al. Chemotherapy compared with biochemotherapy for the treatment of metastatic melanoma: a meta-analysis of 18 trials involving 2,621 patients[J] . J Clin Oncol, 2007(34):5426-5434.

[2] Flaherty LE, Moon J. Phase III trial of high-dose interferon alpha-2b versus cisplatin, vinblastine, DTIC plus IL-2 and interferon in patients with high-risk melanoma (SWOG S0008): An intergroup study of CALGB, COG, ECOG, and SWOG [J]. J Clin Oncol, 2012(15 Suppl): abstr 8504.

[3] Lian B, Mao LL, Cui CL, et al. Phase II randomized study of high-dose interferon alfa-2b(HDI) versus chemotherapy as adjuvant therapy in patients with resected mucosal melanoma[J].J ClinOncol, 2012(15 Suppl):abstr 8506.

[4] Seetharamu N, Ott PA, Pavlick AC. Muscosal melanomas: a case-based review of the literature [J]. Oncologist, 2010(7):772-781

[5] Marais R, Spooner RA, Light Y,et al. Gene-directed enzyme prodrug therapy with a mustard prodrug/carboxypeptidase G2 combination[J]. Cancer Res, 1996(20):4735-4742.

[6] Kyriakou CA. Human mesenchymal stem cells (hMSCs) expressing truncated soluble vascular endothelial growth factor receptor (tsFlk-1) following lentiviral-mediated gene transfer inhibit growth of Burkitt's lymphoma in a murine model[J].J Gene Med, 2006(3):253-264.

[7] Wang JS, Chen ZX, Xia XM, et al. A bicistronic retroviral vector to introduce drug resistance gene into human umbilical cord blood CD34+ cells to improve combination chemotherapy tolerance[J]. Chinese Medical Journal, 2001(1):25-29.

[8] Blum JS，Barry MA，Mikos AG，et al．In vivo evaluation of gene therapy vectors in ex vivo-derived marrow stromal cells for bone regeneration in a rat critical-sized calvarial defect mode1[J]. Hum Gene Ther, 2003(18):1689-1701.

[9] Turpeinen M, Raunio H, Pelkonen O. The functional role of CYP2B6 in human drug metabolism: substrates and inhibitors in vitro, in vivo and in silico[J]. Curr Drug Metab, 2006(7):705-714.

[10]Chen L, Waxman DJ. Intratumoral activation and enhanced chemotherapeutic effect of oxazaphosphorines following cytochrome P-450 gene transfer: development of a combined chemotherapy/cancer gene therapy strategy[J]. Cancer Res, 1995(3):581-589.

[11]Wei MX, Tamiya T, Chase M, et al. Experimental tumor therapy in mice using the cytochrome P450 2B1 gene[J]. Hum Gene Ther, 1994(5):969-978.

[12]On Kan, Leigh G, Dilair B, et al. Direct retroviral delivery of human cytochrome P450 2B6 for gene-directed enzyme prodrug therapy of cancer[J]. Cancer Gene Ther, 2001(7):473-82.

[13]McErlane V, Yakkundi A, McCarthy HO, et al. A cytochrome P450 2B6 meditated gene therapy strategy to enhance the effects of radiation or cyclophosphamide when combined with the bioreductive drug AQ4N[J]. J Gene Med, 2005(7):851-859.

[14]Studeny M, Marini FC, Champlin RE, et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells as vehicles for interferon-? delivery into tumors[J]. Cancer Research, 2002(62):3603-3608.

(2015-05-30收稿，2015-07-04修回)

中文編輯： 周 凌； 英文編輯： 劉 華

Stem Cells Modified by Mediated Prodrug Gene inTargeted Therapy of Human Melanoma

HU Xiaoyan1, WANG Jishi2, WU Chenglong3, LIU Xia4, ZHONG Yu5

(1.DepartmentofHematologyOncology,theFirstPeople'sHospitalofGuiyang,Guiyang550002,Guizhou,China; 2.DepartmentofHematology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.DepartmentofMicrobiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 4.GuiyangUniversityofTCM,Guiyang550002,Guizhou,China; 5.DepartmentofPathology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To enhance the local chemotherapy effect of human melanoma by utilizing rats' bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) modified by mediated prodrug gene. Methods: BMSCs were separated from rat's bone marrow of femur and tibia, culturedinvitroand identified, which were transfected by recombinant adenovirus mediate CYP2E1 gene (pAd5CMV-CYP2E1-EGFP). RT-PCR method and fluorescence microscope were adoped to detect the expression of CYP2E1 in genetic modified BMSCs (CYP2E1-BMSCs). The cells of MV3 were injected subcutaneously into back of nude mice to build the MV3 transplantation tumor model. Then the MV3 transplantation tumor model mice were divided into 4 groups: group 1 received treatment of CYP2E1-BMSCs combined with dacarbazine; group 2 received treatment of CYP2E1-BMSCs alone; group 3 dacarbazin alone; goup 4 physiological saline alone(control group). Results: The rats' BMSCs were successfully separated and cultured. BMSCs were uniform in morphology, featured by adherent growth, small size, long spindle shape, large karyoplasmic ratio, obvious same direction change, and swirling and spiral arrangment. Flow cytometry detection indicated high expression level of CD29, CD71, and low expression level of CD29, CD71. Incubation in different induction systeminvitroindicated that BMSCs had potential in osteogenesis, adipogenesis and chondrogenesis. After identification and transfection, EGFP expression in transgenosis targeted cells could be observed under fluorescence microscope and CYP2E1 target gene expression in mRNA expression level could be detected by RT-PCR. Under fluorescence microscope, after treatment, tissue slice of nude mices' tumor and other organs showed that CYP2E1-BMSCs could gather around tumor tissue and metastatic foci, and the apoptosis rate of group 1 (CYP2E1-BMSCs combined with dacarbazine) was significantly higher than that of group 3 (dacarbazine alone) and control group (physiological saline alone). Conclusion: CYP2E1-BMSCs can significantly improve the potency of dacarbazineinvivo, and can gather around tumor tissue. Therefore CYP2E1-BMSCs play a role in synergistic effect of chemotherapy drugs on tumor.

bone mesenchymal stem cells; adenoviridae; vector; cytochrome P450 CYP2E1; melanoma

時(shí)間：2015-08-07

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150807.2303.042.html

R456.9; R739.5

A

1000-2707(2015)09-0947-07