朱麗英， 肖卿玉， 楊 柳， 潘 衛(wèi)， 李 興

(貴州醫(yī)科大學 醫(yī)學檢驗學院， 貴州 貴陽 550004)

應用雙向電泳、免疫印跡和質(zhì)譜技術篩選乳腺癌相關抗原*

朱麗英， 肖卿玉， 楊 柳， 潘 衛(wèi)， 李 興**

(貴州醫(yī)科大學 醫(yī)學檢驗學院， 貴州 貴陽 550004)

目的： 篩選乳腺癌相關抗原。方法： 提取乳腺癌T-47D細胞株總蛋白，采用雙向電泳技術進行分離后轉(zhuǎn)膜，分別采用乳腺癌患者血清和對照血清作為一抗進行Western blot分析，比較雜交蛋白點的差異，取差異蛋白點行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析并通過數(shù)據(jù)庫查詢，鑒定抗原。結果： 篩選出10個差異蛋白，取其中3個僅與乳腺患者血清反應的蛋白行質(zhì)譜分析顯示，這3個蛋白分別為脯氨酰-4-羥化酶β亞基、人類真核翻譯延伸因子1γ、磷酸甘油酸變位酶1。結論： 成功鑒定了3個可能的乳腺癌相關抗原。

乳腺腫瘤； 癌； 抗原； 電泳； 免疫印跡法； 質(zhì)譜分析

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率逐年上升，且發(fā)病人群越來越年輕，因此受到人們的廣泛關注。早期診斷是治療乳腺癌、降低死亡率的關鍵[1]，傳統(tǒng)的乳腺檢查方法不能早期診斷乳腺癌，尋找乳腺癌特異性抗原將有助于乳腺癌早期診斷和導向治療。目前，以蛋白質(zhì)雙向電泳、免疫印跡和質(zhì)譜技術為代表的蛋白質(zhì)組學技術已被廣泛應用于腫瘤的研究，但其在乳腺癌中的研究報道尚少[2-3]。本研究的目的是通過雙向電泳、免疫印跡技術和質(zhì)譜分析篩選乳腺癌相關抗原。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 收集2008年12月～2009年3月收治的20例女性乳腺癌患者(無其它自身免疫性疾病)的靜脈血清作為病例組，患者采血前和手術前未進行放療、化療和內(nèi)分泌治療，年齡34～78歲，平均49.5歲；所有患者組織標本均經(jīng)病理結果證實。另外同期采集20例體檢健康女性靜脈血清作為對照組，年齡36～75歲，平均52.8歲。對照組均經(jīng)系統(tǒng)健康體檢，無乳腺相關疾病史、其它自身免疫性疾病和惡性腫瘤家族史。采所有被檢者空腹靜脈血5 mL，盡快分離血清，-80 ℃保存。人乳腺癌細胞株T-47D細胞購自中國科學院細胞庫。

1.1.2 主要試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，線性固相pH梯度(immobilized pH gradient，IPG)干膠條(pH 3～10，13 cm)、裂解液、胰蛋白酶均購自Amershan biosciences 公司，辣根過氧化物酶標記的兔抗人IgG購自武漢博士德公司，聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自美國Millpore公司，ECL化學發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 T-47D細胞培養(yǎng)及總蛋白的制備 T-47D細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期的細胞，加入5倍體積裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫尿，4% CHAPS，65 mmol/L DTT，0.2% Bio-Lyte)混勻，液氮中反復凍融3～4次(每次置液氮中3 s，室溫融化)，加入20 mg/L脫氧核糖核酸酶，離心1 h(4 ℃，20 000×g)，取上清即為細胞總蛋白。用Bradford法檢測蛋白濃度，將樣品分裝并且于-80 ℃保存。

1.2.2 雙向電泳 700 μg T-47D細胞總蛋白與水化液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫尿，4%CHAPS，65 mol/L DTT，0.2%兩性電解質(zhì)，0.001%溴酚藍)混勻，上樣總體積為250 μL。將IPG膠條(pH 3～10，13 cm)再水化，室溫溶脹14 h。將溶脹好的膠條轉(zhuǎn)移至EttanIPGphorⅡ等電聚焦儀進行第一向等電聚焦。膠條經(jīng)兩次平衡后轉(zhuǎn)至12.5% SDS-PAGE凝膠進行第二向電泳，起始電流為5 mA，待溴酚藍至分離膠后調(diào)至25 mA，待溴酚藍前沿達底部停止電泳。

1.2.3 Western blot分析 T-47D細胞總蛋白經(jīng)雙向電泳分離后，經(jīng)半干轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)印至PVDF膜并封閉2 h，分別與1:100稀釋的病例組或?qū)φ战M血清(一抗)于室溫孵育2 h，用TBST洗膜液洗膜(10 min×3次)；與辣根過氧化物酶標記的兔抗人二抗(1∶3 000)室溫孵育2 ，再經(jīng)TBST溶液洗膜(10 min×3次)，最后經(jīng)ECL化學發(fā)光檢測得到膠片，觀察雜交信號點，并確定發(fā)生免疫反應的蛋白在雙向電泳凝膠上的位置。

1.2.4 圖像掃描和質(zhì)譜分析 完成考馬斯亮藍染色的雙向電泳凝膠以及曝光的膠片經(jīng)Imagescaner進行掃描，且采用圖像分析軟件Imagemasters6.0對掃描圖像進行強度校正、點檢測、背景消減和點匹配等。質(zhì)譜分析：取雙向電泳凝膠上候選蛋白質(zhì)斑點經(jīng)胰酶酶解[4]，肽段經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)分析，用Mascot搜索引擎搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫，獲知氨基酸序列。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件對每一個蛋白與病例組血清和對照組血清反應的頻率進行統(tǒng)計學分析。兩組間率的比較用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 雙向電泳凝膠蛋白圖譜分析

使用圖像分析軟件對T-47D細胞總蛋白雙向電泳圖譜進行分析，在分子量為14.4.0～94 kDa和等電點pI 3.0～10.0的范圍內(nèi)，發(fā)現(xiàn)約630個蛋白質(zhì)點。

2.2 Western blot結果

圖1A為T-47D細胞總蛋白與1份對照血清發(fā)生免疫反應，發(fā)生反應的蛋白較少，大約為4個蛋白點；圖1B為T-47D細胞總蛋白與1份乳腺癌患者血清發(fā)生免疫反應，發(fā)生反應蛋白較多，大約為15個蛋白點，其中有1個蛋白點與患者血清和對照血清都發(fā)生反應，只與患者血清發(fā)生反應的蛋白點有14個。

2.3 差異蛋白表達

經(jīng)統(tǒng)計學分析后發(fā)現(xiàn)有10個蛋白點與對照組和病例組血清發(fā)生反應的頻率之間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1、圖2。這10個差異蛋白點在雙向電泳凝膠上的位置見圖3。

注：A、B分別為對照組及病例組血清與T-47D細胞總蛋白發(fā)生免疫反應結果，圖中藍點代表該蛋白只與對照血清發(fā)生免疫反應，紅點代表該蛋白只與患者血清發(fā)生免疫反應，綠點代表該蛋白與對照血清和患者血清都發(fā)生免疫反應

表1 T-47D細胞總蛋白與正常血清或乳腺癌血清反應頻率

圖2 10個蛋白點與對照組(N)和病例組(BC)血清發(fā)生免疫反應印跡圖

圖3 10個蛋白點在雙向電泳凝膠圖上的位置

2.4 差異蛋白質(zhì)譜鑒定

選取只與病例組血清反應的2號、6號和9號蛋白點經(jīng)切割、脫色、酶解，再經(jīng)LC-MS/MS分析顯示分別為脯氨酰-4-羥化酶β亞基(prolyl 4-hydroxylase, beta subunit precursor，P4HB)、 人類真核翻譯延伸因子1γ(eukaryotic translation elongation factor 1 gamma, EEF1G)及磷酸甘油酸變位酶1(phosphoglycerate mutase，PGAM1)，見表2。

3 討論

腫瘤相關抗原產(chǎn)生的免疫應答可以發(fā)生在腫瘤形成的早期階段,分離鑒定腫瘤相關抗原有可能發(fā)現(xiàn)新的候選腫瘤標志物,這些腫瘤相關抗原可以作為臨床免疫治療的潛在靶標[5]。據(jù)此，本研究采用雙向電泳技術對乳腺癌細胞株T-47D總蛋白進行分離，分別采用乳腺癌患者血清和對照組血清作為一抗進行Western blot分析，對每一個蛋白與正常血清和患者血清反應的頻率進行統(tǒng)計學分析后，發(fā)現(xiàn)有10個蛋白與兩者發(fā)生反應的頻率之間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，取其中3個僅與乳腺患者血清反應的蛋白行質(zhì)譜分析顯示,這3個抗原為P4HB、EEF1G及PGAM1。

表2 差異蛋白質(zhì)譜鑒定結果

P4HB是脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase, PHD) 的一個 β 亞基。P4HB屬于分子伴侶蛋白，是原核和真核生物細胞在應激狀態(tài)下可被誘導表達的一類具有重要生理功能和高度保守的多肽類蛋白質(zhì)，其在促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化并促進腫瘤轉(zhuǎn)移方面具有重要作用。研究表明，P4HB濃度升高時，它可以抑制錯誤折疊蛋白的聚集，濃度降低時，可以促進它的聚集[6]。研究顯示P4HB在乳腺癌患者體內(nèi)表達升高[7]。在本研究中，P4HB與乳腺癌患者血清發(fā)生反應，與對照血清不發(fā)生反應。乳腺癌患者血清中出現(xiàn)P4HB的自身抗體可能是機體針對該抗原的免疫應答產(chǎn)物，因此血清表達水平增高。

EEF1G屬于信號類蛋白，含有N-末端谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶域，可與氨基酰-tRNA結合，將其運至核糖體，使肽鏈延長。研究表明，EEF1G在人的結直腸癌患者體內(nèi)表達升高[8]。目前尚未見EEF1G在乳腺癌中表達情況的報道。本研究結果顯示EEF1G只與乳腺癌患者血清發(fā)生反應，與對照血清不發(fā)生反應。乳腺癌患者血清中出現(xiàn)EEF1G的自身抗體可能是機體針對該抗原的免疫應答產(chǎn)物，EEF1G可能與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關。

PGAM1是一種糖分解酶，主要在糖酵解過程中起作用，因而能促進癌細胞等糖酵解旺盛的細胞生存[9]。研究發(fā)現(xiàn)，PGAM1在肺癌、肝癌和食管癌中表達明顯升高[10-11]，但在乳腺癌腫瘤抗原方面的研究罕見報道[12]。在本研究中，PGAM1與乳腺癌患者血清發(fā)生反應，與對照血清不發(fā)生反應。乳腺癌患者血清中出現(xiàn)PGAM1的自身免疫抗體可能是機體針對該抗原的免疫應答產(chǎn)物。PGAM1可能與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關，其具體機制有待進一步研究。

綜上所述，乳腺癌患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的自身免疫抗體所對應的3種蛋白可能與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關，而它們在乳腺癌發(fā)病和診斷中的作用還需進一步深入的研究。

[1] 沈松杰，孫強，徐雅莉，等．乳腺癌常用早期診斷方法的比較研究[J]．中華腫瘤雜志， 2012(11)：877-880．

[2] Grandjean M, Sermeus A, Branders S, et al. Hypoxia integration in the serological proteome analysis unmasks tumor antigens and fosters the identification of anti-phospho-eEF2 antibodies as potential cancer biomarkers[J].Plos One, 2013(10):76508-76520.

[3] Grandjean M, Dieu M, Raes M, et al. A new method combining sequential immunoaffinity depletion and differential in gel electrophoresis to identify autoantibodies as cancer biomarkers[J]. J Immunol Methods, 2013(1):23-32.

[4] Yang Z, Chevolot Y, Géhin T, et al. Improvement of protein immobilization for the elaboration of tumor-associated antigen microarrays: application to the sensitive and specific detection of tumor markers from breast cancer sera[J]. Biosens Bioelectron, 2013 (1):385-392.

[5] 張道強，張春江，隋秀梅，等．乳腺癌患者血清抗核抗體的表達[J]．中華乳腺病雜志， 2013 (5) ：334-337．

[6] Kosuri P, Alegre-Cebollada J, Feng J, et al. Protein folding drives disulfide formation[J]. Cell, 2012(4):794-806.

[7] Yang Z, Chevolot Y, Géhin T, et al. Improvement of protein immobilization for the elaboration of tumor-associated antigen microarrays: application to the sensitive and specific detection of tumor markers from breast cancer sera [J]. Biosens Bioelectron, 2013(1):385-392.

[8] Matassa DS, Amoroso MR, Agliarulo I, et al. Translational control in the stress adaptive response of cancer cells: a novel role for the heat shock protein TRAP1[J]. Cell Death Dis， 2013(4):851.

[9] Hallows WC, Yu W, Denu JM. Regulation of glycolytic enzyme phosphoglycerate mutase-1 by Sirt1 protein-mediated deacetylation[J]. J Biol Chem， 2012(6):3850-3858.

[10]Ren F, Wu H, Lei Y, et al. Quantitative proteomics identification of phosphoglycerate mutase 1 as a novel therapeutic target in hepatocellular carcinoma[J]. Mol Cancer, 2010 (81):1-17.

[11]高紅軍，岳志岡，鄭敏，等．一種腫瘤相關抗原在食管鱗狀細胞癌中的鑒定與表達[J]．中國醫(yī)學科學院學報， 2012(3)：244-248．

[12]Buffa FM, Harris AL, West CM, et al. Large meta-analysis of multiple cancers reveals a common, compact and highly prognostic hypoxia metagene[J]. Br J Cancer, 2010(2):428-435.

(2015-06-09收稿，2015-07-21修回)

中文編輯： 周 凌； 英文編輯： 趙 毅

Application of Two-Dimensional Electrophoresis, Western Blot and Mass Spectrum to Screen Breast Cancer Associated Antigens

ZHU Liying, XIAO Qingyu, YANG Liu, PAN Wei, LI Xing

(SchoolofMedicalLaboratoryScience,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To investigate breast cancer associated antigens. Methods: T-47D cell total proteins were extracted and separated by two-dimensional electrophoresis (2-DE), then transferred to PVDF membrane, following by incubation with sera samples from women with and without breast cancer for further Western blot analysis. The proteins hybridized differences were analyzed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and were identified through NCBInr database. Results: Ten different proteins were found, three of which were identified as prolyl 4-hydroxylase, beta subunit precursor, eukaryotic translation elongation factor 1 gamma and phosphoglycerate mutase. Conclusions: Three possible breast cancer antigens have been successfully identified.

breast neoplasms; carcinoma; antigens; electrophoresis; immunoblotting; mass spectrum

貴州省科學技術基金項目(黔科合J字2007-2086)； 貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長專項資金項目(2005-298)； 貴州省省長基金資助項目[黔科教辦(2005)14號]

時間：2015-08-07

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150807.2232.006.html

R737.9; R34

A

1000-2707(2015)09-0922-04

**通信作者 E-mail:lixing_1211@sina.com