范新濤，閆鳳鳴，朱家超，吳 彪，王高平

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，河南鄭州450002)

黏蟲Mythimna separata(Walker)是夜蛾科重要的一種農(nóng)業(yè)害蟲，需要取食補充營養(yǎng)才能進行正常的遷飛、發(fā)育和繁殖.黏蟲卵巢在成蟲取食后才能發(fā)育成熟，不同種類和濃度的補充營養(yǎng)物對生殖和發(fā)育具有影響［1－3］。遷飛地蜜源植物分泌花蜜情況可能是黏蟲是否能夠進行遷飛和發(fā)生量的重要影響因素之一。研究表明，黏蟲危害程度與蟲源地、遷飛中轉(zhuǎn)地紫云英Astragalus sinicus L.種植面積呈極顯著相關(guān)性，而與該地區(qū)的油菜Brassica napus L.種植面積的相關(guān)性不明顯［4］。有研究表明，成蟲期取食葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、棉子糖、甘油、甘露醇等的黏蟲能夠正常生殖，而攝食水、木糖、山梨糖、乳糖、糊精、淀粉、糖原的黏蟲成蟲僅產(chǎn)極少數(shù)卵［5］。紫云英花蜜中含有葡萄糖、果糖和蔗糖3種主要的糖，而油菜花蜜中主要有葡萄糖和果糖2種糖，同時還存在少量的麥芽糖。劉保玲等［6］利用氨基酸自動分析儀分析了黏蟲蜜源植物花蜜中游離氨基酸成分，在油菜和紫云英花蜜中檢測到17種常見蛋白氨基酸?；壑邪被岢煞謱a(chǎn)卵量起到積極的作用已經(jīng)被證實，同時花蜜中氨基酸成分對雄蝶也存在影響作用［7，8］。本研究對黏蟲蟲源地廣西桂林地區(qū)紫云英和油菜花蜜中的游離氨基酸成分進行了分析，將有助于揭示紫云英比油菜花蜜更適合黏蟲補充營養(yǎng)的內(nèi)在原因。

1 材料與方法

1.1 油菜和紫云英花蜜的收集

于2013－03－19，在廣西桂林永福縣羅錦鎮(zhèn)隨機選取油菜和紫云英植株，用毛細管法收集其花蜜40～50 μL，放置于4℃冰箱保存。

1.2 天然花蜜中全譜氨基酸的測定方法

利用液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS/MS Q-TRAP)同位素內(nèi)標法檢測全譜游離氨基酸。包括20種蛋白氨基酸和21種非蛋白氨基酸:磷酸乙醇胺、?；撬帷⒁掖及?、磷酸絲氨酸、瓜氨酸、1-甲基組氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、3-甲基組氨酸、a-氨基已二酸、α-氨基正丁酸、鳥氨酸、羥基脯氨酸、肌氨酸、精氨(基)琥珀酸、肌肽、鵝肌肽、羥化胍氨酸、β-氨基異丁酸、胱硫醚、同型半胱氨酸。

1.2.1 樣本衍生化處理 移取40 μL樣品置于試管內(nèi)，加入 10 μL磺基水楊酸，漩渦混勻 30 s，10 000倍重力加速度離心2 min沉淀蛋白。移取10 μL上層液置于另一試管。加入40 μL標記緩沖液，漩渦混勻，旋轉(zhuǎn)離心。移取10 μL上層液置于另一試管。每個樣品管中加入5 μL稀釋的iTRAQ試劑，漩渦混勻，旋轉(zhuǎn)離心。于室溫下孵化至少30 min。管中加入5 μL羥胺，漩渦混勻，旋轉(zhuǎn)離心。每支管中加入32 μL內(nèi)標，漩渦混勻，旋轉(zhuǎn)離心。使用液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀檢測樣本。

1.2.2 液相條件和質(zhì)譜參數(shù) 液相條件:柱溫為50℃，進樣量3 μL，A流動相為水和0.1%甲酸混合液，B流動相為乙腈和0.1%甲酸混合液;質(zhì)譜檢測梯度見下表1。根據(jù)分析出氨基酸峰值計算花蜜中氨基酸的含量，質(zhì)譜檢測花蜜中全譜氨基酸中各氨基酸種類。

表1 質(zhì)譜檢測梯度表Table 1 The gradient of mobile phases for MS detection

2 結(jié)果與分析

油菜和紫云英花蜜中檢測出的游離氨基酸包括蛋白質(zhì)組分氨基酸和非蛋白氨基酸，分別見表2和表3。

從表2可以看出，花蜜中存在20種蛋白質(zhì)組分氨基酸中的19種，未檢測到半胱氨酸。其中色氨酸在2種花蜜中所占蛋白質(zhì)組分氨基酸總量的比例最低，分別為0.29%和0.14%，甲硫氨酸其次，分別為 0.46%和 0.53%。

表2 油菜和紫云英花蜜中20種游離蛋白質(zhì)組分氨基酸含量Table 2 Content of 20 free protein amino acids in nectar of milk vetch and rape

續(xù)表 Continuing table

從表2可以看出，同種氨基酸在2種花蜜中的比例各不相同。在油菜花蜜中，甘氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、丙氨酸、谷氨酸和脯氨酸含量明顯高于其他氨基酸;而在紫云英花蜜中，天門冬酰胺所占比例最高，其含量可達 1 323.93 mg·L－1，其次是絲氨酸，達271.08 mg·L－1。在紫云英花蜜中，谷氨酰胺、天門冬氨酸、組氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和谷氨酸含量也均在100 mg·L－1以上。

紫云英花蜜中各蛋白質(zhì)組分氨基酸含量明顯高于油菜花蜜中的各氨基酸含量。其中天門冬酰胺是油菜花蜜中的271.80倍，天門冬氨酸含量也是油菜花蜜中的54.83倍，苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸和蘇氨酸分別是油菜花蜜中同種氨基酸的 28.49 倍、25.85 倍、22.19 倍、21.89 倍和24.69倍，含量最低的色氨酸也是油菜花蜜中氨基酸的9.13倍。

表3 油菜和紫云英花蜜中的非蛋白質(zhì)組分氨基酸種類及含量Table 3 Content of free non-protein amino acids in nectar of milk vetch and rape

從表3可以看出，紫云英和油菜花蜜中分別檢測出12種和10種非蛋白質(zhì)組分氨基酸。這些非蛋白質(zhì)組分氨基酸主要有牛磺酸、乙醇胺、瓜氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸和鳥氨酸。其中以γ-氨基丁酸含量最高，油菜和紫云英2種花蜜中含量分別為45.19、48.76 mg·L－1，其次是乙醇胺，在油菜和紫云英花蜜中含量分別為13.45、17.11 mg·L－1。

紫云英花蜜中還存在磷酸絲氨酸和3-甲基組氨酸，這2 種成分含量只有 0.04 mg·L－1和 0.45 mg·L－1，但是在油菜花蜜中并未檢測到。

3 結(jié)論與討論

1)紫云英和油菜花蜜均檢測出19種蛋白質(zhì)組分氨基酸，紫云英和油菜花蜜分別檢測出12種和10種非蛋白質(zhì)組分氨基酸，油菜花蜜未檢測出磷酸絲氨酸和3-甲基組氨酸。紫云英花蜜中?；撬岷挺?氨基正丁酸含量低于油菜花蜜，而其他氨基酸含量則高于油菜花蜜。油菜花蜜中甘氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、丙氨酸、谷氨酸和脯氨酸含量明顯高于其他氨基酸成分;而在紫云英花蜜中，天門冬酰胺所占的比例最高，其次是絲氨酸。

2)NICOLSON［9］分析了蘆薈屬 Aloe和刺桐屬Erythrina花蜜中的氨基酸成分，16種蘆薈屬植物的花蜜氨基酸總量各不相同;10種刺桐屬植物的氨基酸總量也不同;在20種常見氨基酸中，有些氨基酸成分在花蜜中能夠檢測到，但有些氨基酸并未檢測到。西葫蘆Cucurbita pepo雌花和雄花花蜜中，除了存在16種蛋白氨基酸外，同時還存在?；撬帷ⅵ?丙氨酸、a-氨基丁酸和γ-氨基丁酸等非蛋白氨基酸，以脯氨酸含量最高，蘇氨酸、組氨酸、β丙氨酸和丙氨酸依次降低;雌花和雄花花蜜氨基酸的含量也存在不同［10］。劉保玲等［6］利用氨基酸自動分析儀分析了黏蟲蜜源植物花蜜中游離蛋白質(zhì)組分氨基酸成分，在油菜和紫云英花蜜中檢測到17種蛋白質(zhì)組分氨基酸，油菜花蜜中蘇氨酸、丙氨酸和谷氨酸含量最高，達100 mg·kg－1以上，精氨酸含量最低，只有2.78 mg·kg－1;而紫云英花蜜只有蘇氨酸含量達100 mg·kg－1以上，其余氨基酸含量都低于100 mg·kg－1，酪氨酸含量最低，只有0.37 mg·kg－1。本研究所得的蛋白氨基酸數(shù)據(jù)與劉保玲等［6］的研究結(jié)果不同，分析其原因可能有3方面:(1)品種不同。在單一植物間、同一種群和不同種群間花蜜成分花蜜氨基酸成分變化都均比較明顯，同時氨基酸含量也會隨著花齡變化而變化，通常新花含量低、中齡花含量較高(急劇增長的天冬氨酸是個例外)、老花中很高［11］;(2)環(huán)境條件不同。二氧化碳的濃度可引起花蜜氨基酸成分的變化，溫、濕度也影響花蜜的產(chǎn)生;(3)生長條件不同?；郯被峤M成也受植物生長條件的影響，如麥仙翁在增施化肥條件下可顯著改變花蜜氨基酸的組成，特別是增加谷氨酰胺、脯氨酸和天冬酰胺的比例。

通常情況下植物所產(chǎn)的花蜜量極少，很難直接用采集花蜜飼喂昆蟲的方法來研究花蜜對昆蟲的影響，分析花蜜中存在的各種成分、研究組配模擬花蜜對昆蟲的影響是一種更容易實現(xiàn)的方法?；壑邪被岬莫毺刂幵谟谶@些化合物對花蜜口感味道的影響，氨基酸比糖成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)更加多樣性，并且味道也隨著濃度的變化而發(fā)生變化。

［1］ 林昌善.黏蟲生理生態(tài)學(xué)［M］.北京:北京大學(xué)出版社，1990.

［2］ 曹雅忠，羅禮智，李光博，等.黏蟲飛翔能源物質(zhì)及其消耗［J］.昆蟲學(xué)報，1995，38(3):290－295

［3］ 羅 晨，曹雅忠，李克斌.補充營養(yǎng)對黏蟲成蟲能源物質(zhì)含量的影響［J］.昆蟲學(xué)報，2000，43(增刊):207－210.

［4］ WANG G P，ZHANG Q W，YE Z H，et al.The role of nectar plants in severe outbreaks of armyworm Mythimna separata(Lepidoptera:Noctuidae)in China［J］.Bulletin of Entomological Research，2006，96(5):445－455.

［5］ 郭 郛，劉金龍.粘蟲生殖的研究:Ⅱ.補充營養(yǎng)對生殖力的效應(yīng)［J］.昆蟲學(xué)報，1964，13(6):785 －794.

［6］ 劉保玲，王高平，胡京枝.黏蟲蜜源植物花蜜中游離氨基酸的測定與分析［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)2012，41(4):93－96.

［7］ FABICN C，ANDREAS E.Enhancing offspring quality or quantity?Different ways for using nectar amino acids in female butterflies［J］.Oecologia，2012，169(4):1005－1014.

［8］ FABICN C，ANDREAS E.Nectar amino acids enhance reproduction in male butterflies［J］.Oecologia，2013，171(1):197－205.

［9］ NICOLSON S W.Amino acid concentrations in the nectars of Southern African bird-pollinated flowers，especially Aloe and Erythrina［J］.Journal of Chemical Ecology，2007，33(9):1707－1720.

［10］ NEPI M，SOLIGO C，NOCENTINI D，et al.Amino acids and protein profile in floral nectar:much more than a simple reward［J］.Flora-Morphology，Distribution，F(xiàn)unctional Ecology of Plants，2012，207(7):475 －481.

［11］ LANZA J，SMITH G C，SACK S，et al.Variation in nectar volume and composition of Impatiens capensis at the individual，plant，and population levels［J］.Oecologia，1995，102(1):113－119.