楊 俊，李午麗，陳龍杰，蔣承智，朱 霞，趙守亮，

(1.同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙體牙髓科，上海 200072;2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院口腔科，上海 200040)

牙胚發(fā)育過程中組織和細(xì)胞的分化都是由許多分子組成的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的，這些信號(hào)網(wǎng)絡(luò)包括生長(zhǎng)因子、受體分子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和轉(zhuǎn)錄因子等。受體分子在生長(zhǎng)因子的作用下，將信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子被激活，從而活化轉(zhuǎn)錄因子使其轉(zhuǎn)位至核內(nèi)最終活化靶基因，由此調(diào)控牙胚的發(fā)育。鈣離子是細(xì)胞生命活動(dòng)的重要分子，作為細(xì)胞內(nèi)二級(jí)信使調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種功能，從細(xì)胞分裂、分化直至凋亡。近年來，研究［1］揭示了經(jīng)典瞬時(shí)受體電位通道(transient receptor potential canonical channel，TRPC)是一種重要的具有多種功能的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，由TRPC通道調(diào)節(jié)的鈣離子流動(dòng)直接引起細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)改變從而影響后續(xù)信號(hào)活動(dòng)及細(xì)胞功能?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物的TRPC超家族包括7個(gè)成員即TRPC 1～TRPC7。其中TRPC1與外胚層發(fā)育而來的表皮及神經(jīng)組織密切相關(guān)［2-3］，而對(duì)于同一胚層發(fā)育而來的牙齒，它們的關(guān)系尚未見報(bào)道。本研究探討TRPC1在大鼠牙胚發(fā)育過程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

TRPC1的兔抗鼠的多克隆抗體購(gòu)自以色列Alomone公司;多聚甲醛、乙二胺四乙酸二鈉、石蠟、無水乙醇、二甲苯等購(gòu)自上海生物工程有限公司;蘇木精、伊紅染液購(gòu)自南京建成科技有限公司;免疫組化SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司;枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司;石蠟切片機(jī)、石蠟展片機(jī)、石蠟烤片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)自上海躍進(jìn)生物器械有限公司;光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)購(gòu)自日本Nikon公司。

1.2 動(dòng)物模型及標(biāo)本制備

取3月齡SD大鼠(同濟(jì)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，以雌雄比2∶1合籠，陰栓出現(xiàn)當(dāng)天中午定為胚胎發(fā)育的第0.5天(E0.5)。選擇磨牙發(fā)育各期標(biāo)本，牙齒發(fā)育第 14.5、16.5、18.5 天(E14.5、E16.5、E18.5)以及出生后第1、7天(P1、P7)的 SD 大鼠各5只。乙醚過量處死孕鼠及出生后大鼠，E14.5、E16.5、E18.5組可取大鼠頭部，出生后大鼠可在體式顯微鏡下分離并切取含下頜第一磨牙的下頜骨。標(biāo)本置于4%的多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)過固定后的組織常規(guī)脫水，透明，石蠟定向包埋，行冠狀5 μm切片。P1、P7標(biāo)本需置于100 g/L EDTA中脫鈣完全后，再行常規(guī)脫水、透明、包埋、切片。

1.3 方法

1.3.1 H-E染色 石蠟切片脫蠟至水后，使用H-E染色劑，按說明書進(jìn)行H-E染色，觀察組織形態(tài)變化。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片脫蠟至水后，使用SABC試劑盒，按說明書進(jìn)行免疫組化染色，一抗使用1∶50稀釋的TRPC1多克隆抗體。滴加新鮮配制DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染后脫水、透明、封片。以PBS代替一抗設(shè)為空白對(duì)照。

1.3.3 陽性結(jié)果判定 根據(jù)細(xì)胞胞漿或胞膜染色強(qiáng)度可分為:陰性(胞漿內(nèi)無棕黃色顆?；虺示鶆蛞恢碌牡S色，與背景一致);弱陽性(胞漿內(nèi)可見淡黃色顆粒明顯于背景);陽性(胞漿內(nèi)可見棕黃色顆粒);強(qiáng)陽性(胞漿內(nèi)可見大量深棕色顆粒)，TRPC1陽性表達(dá)細(xì)胞膜或胞質(zhì)呈棕黃色。

2 結(jié) 果

2.1 H-E 染色結(jié)果

E14.5大鼠磨牙牙胚處于蕾狀期，可見牙板末端的上皮細(xì)胞增生，形成上皮芽狀如花蕾，其構(gòu)成細(xì)胞類似基底細(xì)胞，呈立方或矮柱狀。上皮下方和周圍的外胚間充質(zhì)細(xì)胞增生、聚集包繞上皮芽(圖1A)。E16.5大鼠磨牙處于帽狀期，上皮芽繼續(xù)向外胚間充質(zhì)延伸生長(zhǎng)，基底部向內(nèi)凹陷如帽狀，此時(shí)形成的成釉器分化為3層細(xì)胞:外釉上皮層、內(nèi)釉上皮層和星網(wǎng)狀層。外胚間充質(zhì)形成了牙乳頭和牙囊(圖1B)。E18.5大鼠磨牙牙胚處于鐘狀早期，在該期隨著成釉器的發(fā)育，內(nèi)釉上皮凹陷更深，形似吊鐘，成釉器分化為4層:外釉上皮層、內(nèi)釉上皮層、星網(wǎng)狀層和中間層(圖1C)。P1大鼠磨牙牙胚處于鐘狀晚期，內(nèi)釉上皮細(xì)胞分化為高柱狀的成釉細(xì)胞，相鄰的牙乳頭細(xì)胞分化為具有分泌功能的前成牙本質(zhì)細(xì)胞，有少許牙本質(zhì)形成(圖1D)。P7大鼠磨牙處于牙根形成期，P7已有牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)及牙髓組織形成，頸環(huán)處形成赫特維希上皮根鞘(HERS)(圖1E)。

圖1 大鼠牙齒發(fā)育 E14.5、E16.5、E18.5、P1、P7 標(biāo)本 H-E 染色結(jié)果Fig.1 H-E staining results of developing rat tooth germ on the days of E14.5、E16.5、E18.5、P1、P7

A為E14.5大鼠磨牙，處于蕾狀期;B為E16.5大鼠磨牙，處于帽狀期;C為E18.5大鼠磨牙，處于鐘狀早期;D和E分別為

P1和P7大鼠磨牙，處于鐘狀晚期;D、E放大倍數(shù)為100，A、B、C放大倍數(shù)為200;OE:口腔上皮;DL:牙板;DP:牙乳頭;

DF:牙囊;EM:外胚間充質(zhì);OEE:外釉上皮層;IEE:內(nèi)釉上皮層;SR:星網(wǎng)狀層;SI:中間層

圖 2 大鼠牙齒發(fā)育 E14.5、E16.5、E18.5、P1、P7 標(biāo)本TRPC1免疫組化染色結(jié)果Fig.2 TRPC1 immunohistochemical staining of developing rat tooth germ on the days of E14.5、16.5、18.5、P1、P7

2.2 免疫組化結(jié)果

TRPC1在蕾狀期(E14.5)表達(dá):牙板上皮、牙蕾上皮及其下方周圍間充質(zhì)細(xì)胞呈弱陽性表達(dá)(圖2A);帽狀期(E16.5)表達(dá):外釉上皮、內(nèi)釉上皮及口腔牙板上皮細(xì)胞可見陽性表達(dá)，牙囊呈弱陽性表達(dá)，星網(wǎng)狀層細(xì)胞呈陰性表達(dá)(圖2B);鐘狀早期(E18.5)表達(dá):外釉上皮、內(nèi)釉上皮、牙板上皮、中間層細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá)，牙囊及部分牙乳頭細(xì)胞呈弱陽性表達(dá)，星網(wǎng)狀層細(xì)胞呈陰性表達(dá)(圖2C);鐘狀晚期(P1)表達(dá):成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞及近成牙本質(zhì)細(xì)胞層的牙乳頭細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá)，外釉上皮、星網(wǎng)狀層細(xì)胞及牙囊呈弱陽性表達(dá)(圖2D、圖2E);硬組織形成期(P7)表達(dá):在成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞可見陽性表達(dá)，牙乳頭細(xì)胞皆為陰性表達(dá)(圖2F、圖 2G)。

3 討 論

經(jīng)典瞬時(shí)受體電位通道是近年來備受重視的具有多種功能的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，被認(rèn)為是受體門控式鈣通道(receptor operated calcium channel，ROC)和鈣池操縱式鈣通道(store-operated calcium channel，SOC)的分子基礎(chǔ)［4］。哺乳動(dòng)物的 TRPC超家族中共發(fā)現(xiàn)7個(gè)成員即TRPC 1～TRPC7，其中TRPC1已被證實(shí)在各種細(xì)胞類型中與SOC密切相關(guān)［5-6］。將TRPC1表達(dá)于人HSG(下頜下腺細(xì)胞)可以呈數(shù)倍地增強(qiáng)該細(xì)胞的鈣庫(kù)依賴性鈣流入(store-operated calcium entry，SOCE)，并且細(xì)胞內(nèi)源性SOCE可以因TRPC1的反義cDNA表達(dá)而大大削弱［7］。Cai等［8-9］發(fā)現(xiàn)，TRPC 通道在人的牙齦角化上皮細(xì)胞上有表達(dá)，其中TRPC1在牙齦角質(zhì)細(xì)胞分化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在帕金森病的小鼠模型中，TRPC1對(duì)于維持鈣平衡，促進(jìn)神經(jīng)元存活抑制神經(jīng)元的退化從而減緩或者預(yù)防疾病的發(fā)展過程起到了關(guān)鍵作用［10］。TRPC1參與了外胚層組織細(xì)胞內(nèi)鈣平衡調(diào)節(jié)，從而影響細(xì)胞的移動(dòng)、增殖和分化。TRPC1是否參與同一胚層發(fā)育而來的牙齒的發(fā)育過程是目前研究的熱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)在大鼠牙胚發(fā)育過程中TRPC1呈動(dòng)態(tài)時(shí)空表達(dá)模式:(1)從牙胚發(fā)育早期上皮細(xì)胞就表達(dá)TRPC1，尤其鐘狀早期內(nèi)釉細(xì)胞及鐘狀晚期(硬組織形成期)成釉上皮細(xì)胞質(zhì)TRPC1強(qiáng)陽性表達(dá);(2)成釉細(xì)胞及成牙本質(zhì)細(xì)胞在鐘狀晚期時(shí)TRPC1呈強(qiáng)陽性表達(dá)，至牙根形成期時(shí)成釉細(xì)胞及成牙本質(zhì)細(xì)胞質(zhì)陽性表達(dá)TRPC1，而牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞變?yōu)槿蹶栃员磉_(dá)，至牙根形成期時(shí)未見表達(dá)。本研究從細(xì)胞水平定位TRPC1在牙胚發(fā)育過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TRPC1的表達(dá)可能與成釉器的發(fā)展階段有關(guān)。帽狀期和鐘狀期屬于牙胚發(fā)育早期，此期上皮細(xì)胞中TRPC1通道呈陽性表達(dá)并且信號(hào)逐漸增強(qiáng)，該通道可能對(duì)上皮細(xì)胞有重要作用，而牙囊等間充質(zhì)細(xì)胞TRPC1通道呈弱陽性表達(dá)，該通道可能部分參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程。雖然TRPC1通道的精確調(diào)節(jié)機(jī)制并不十分清楚，其在牙胚發(fā)育中的表達(dá)變化可能與由TRPC1通道調(diào)節(jié)的鈣離子流動(dòng)有關(guān)。鈣離子與機(jī)體各項(xiàng)生理活動(dòng)都有著十分密切的關(guān)聯(lián)，由TRPC1通道調(diào)節(jié)的鈣離子流動(dòng)對(duì)于機(jī)體神經(jīng)等組織細(xì)胞的增殖分化起重要作用，同時(shí)，TRPC1通道可以與其他通道相互作用形成具有不同特性的通道，如在人下頜下腺細(xì)胞中TRPC1通道與TRPC家族其他通道相互作用可以形成具有相對(duì)地鈣離子選擇性的陽離子通道，另外，TRPC1通道也可與廣泛的信號(hào)蛋白相互作用，該通道信號(hào)復(fù)合體包含關(guān)鍵的鈣離子信號(hào)蛋白可作用于激動(dòng)劑激活信號(hào)如PLC、CaM等的上游，對(duì)細(xì)胞的信號(hào)調(diào)節(jié)具有重要作用［1］。牙胚發(fā)育早期，上皮與間充質(zhì)相互作用，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)，需要大量鈣離子參與，推測(cè)由TRPC1通道調(diào)節(jié)的鈣離子流動(dòng)可能參與了上皮細(xì)胞的增殖與分化，這提示TRPC1可能在牙胚細(xì)胞增殖、分化和發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

隨著成釉器的發(fā)育，內(nèi)釉細(xì)胞分化為成釉細(xì)胞，當(dāng)成釉細(xì)胞分化成熟后誘導(dǎo)牙乳頭細(xì)胞分化為早期的成牙本質(zhì)細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞已具備合成蛋白的功能，而后前成牙本質(zhì)細(xì)胞再分化成熟為成牙本質(zhì)細(xì)胞，在成釉器鐘狀晚期時(shí)開始形成牙本質(zhì);硬組織形成期分化成熟的成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌有機(jī)基質(zhì)并礦化，此期釉質(zhì)與牙本質(zhì)完成礦化過程。而TRPC1在鐘狀晚期的成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá)，在硬組織形成期陽性強(qiáng)度減弱，提示TRPC1可能與成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化成熟密切相關(guān)，但對(duì)于成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞調(diào)控的礦化過程所起作用相對(duì)減弱。此外，最近的研究發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞的增殖與TRPC1密切相關(guān)。Abed等［11］采用干擾RNA的方法證實(shí)TRPC1對(duì)于成骨細(xì)胞中鈣離子內(nèi)流和細(xì)胞增殖起關(guān)鍵作用，由于牙齒和骨組織二者組成相似，形成機(jī)制相仿，提示TRPC1通道可能與成釉細(xì)胞及成牙本質(zhì)細(xì)胞中鈣離子內(nèi)流有密切關(guān)系，推測(cè)TRPC1在硬組織形成和礦化中起重要作用，這對(duì)于了解TRPC1的功能提供了新的視野，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了新的研究方向。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)TRPC1在早期牙胚發(fā)育各階段的表達(dá)具有一定時(shí)空表達(dá)特異性，并與之前研究發(fā)現(xiàn)的 TRPC1通道的生理功能進(jìn)行探討，提示TRPC1可能在牙發(fā)育過程中對(duì)于牙胚細(xì)胞增殖、分化和上皮-間充質(zhì)相互作用的起重要影響，并與成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化、成熟及功能發(fā)揮密切相關(guān)。

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