郭 靜 姚丹丹 楊宏波 霍永久 趙國琦

(揚州大學動物科學與技術學院，揚州225009)

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飼糧精粗比對犢牛腸道小肽轉運蛋白mRNA表達的影響

郭 靜 姚丹丹 楊宏波 霍永久 趙國琦*

(揚州大學動物科學與技術學院，揚州225009)

本試驗旨在研究不同精粗比顆粒料對犢牛腸道黏膜小肽轉運蛋白PepT1、PepT2、PHT1和PHT2 mRNA表達的影響。選擇日齡、體重相近的中國荷斯坦公犢牛6頭，分為2個處理，每個處理3頭，各處理精粗比分別為75∶25(Ⅰ)和65∶35(Ⅱ)，預試期14 d，正試期56 d。結果表明：1)十二指腸和空腸PepT1 mRNA表達豐度極顯著高于回腸、盲腸和結腸(P<0.01)；處理Ⅰ犢牛十二指腸和空腸PepT1 mRNA表達豐度極顯著高于處理Ⅱ(P<0.01)；2)與PepT1 mRNA相比，PepT2 mRNA在犢牛腸道中表達豐度較低；處理Ⅰ十二指腸和結腸PepT2 mRNA表達豐度極顯著高于處理Ⅱ(P<0.01)；3)處理Ⅰ盲腸PHT1 mRNA表達豐度極顯著低于處理Ⅱ(P<0.01)，處理Ⅰ犢?；啬c和結腸PHT1 mRNA表達豐度顯著高于處理Ⅱ(P<0.05)；4)處理Ⅰ犢牛盲腸PHT2 mRNA表達豐度極顯著低于處理Ⅱ(P<0.01)，處理Ⅰ犢牛十二指腸和結腸PHT2 mRNA表達豐度極顯著高于處理Ⅱ(P<0.01)。以上結果說明，與精粗比為65∶35的飼糧相比，精粗比為75∶25的飼糧更能夠促進犢牛腸道中PepT1、PepT2、PHT1和PHT2 mRNA的表達。

PepT1；PepT2；PHT1；PHT2；小肽；小肽轉運蛋白；腸道；犢牛

傳統(tǒng)代謝模型認為蛋白質須被消化成游離氨基酸后方可吸收利用，而國內(nèi)外試驗研究表明，小肽是腸道中蛋白質分解的主要產(chǎn)物，且小肽比氨基酸更易被機體吸收。因小肽種類繁多，較難檢測，轉運小肽蛋白研究為小肽營養(yǎng)研究提供了新思路。且有研究表明，消化過程中形成寡肽的數(shù)量和比例與飼糧蛋白質品質有關。隨著分子克隆技術的出現(xiàn)，小肽轉運蛋白的功能和結構逐漸被人們發(fā)現(xiàn)。研究表明，質子依賴的寡肽轉運蛋白(proton-dependent oligopeptide transporters，POTs)利用質子的動力介導一系列短鏈肽和擬肽類物質的細胞轉運。目前POTs家族在哺乳動物中已確定出4個成員，分別是PepT1、PepT2、PHT1和PHT2[1-2]。近年來，小肽的營養(yǎng)學價值受到人們的不斷關注，小肽轉運蛋白的研究也成為了現(xiàn)在的研究熱點。而腸道是蛋白質消化吸收的主要場所，蛋白質經(jīng)胃和小腸內(nèi)蛋白酶和肽酶作用，降解為游離氨基酸和寡肽(二肽和三肽)，然后分別由氨基酸轉運載體蛋白以及寡肽轉運蛋白吸收并轉運進入體內(nèi)。Aguerre等[3]用粗蛋白質含量為16.2%，而精粗比不同的飼糧飼喂奶牛，發(fā)現(xiàn)隨著飼糧中粗料水平的增加，乳蛋白率呈線性下降。目前，已知屬于POTs家族的轉運蛋白包括PepT1、PepT2、PHT1和PHT2等[1]，但鮮見PepT1和PepT2在犢牛腸道小肽營養(yǎng)吸收的研究。本試驗旨在研究不同精粗比飼糧對犢牛各腸段PepT1、PepT2、PHT1和PHT2 mRNA表達的影響，并為進一步的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼糧

試驗于2014年3月至2014年5月在揚州大學實驗農(nóng)牧場進行。選擇6頭(104±2)日齡、平均體重為(121.25±4.12) kg的中國荷斯坦斷奶公犢牛。根據(jù)NRC(2001)營養(yǎng)需要配制各處理犢牛顆粒料。保證各處理顆粒料營養(yǎng)水平一致的前提下，通過調(diào)整精料中的玉米、豆粕、DDGS、麥麩和粗料的苜蓿、小黑麥草的含量來配制不同精粗比的顆粒料。處理Ⅰ和處理Ⅱ分別飼喂精粗比為75∶25和65∶35的顆粒料。粗料按照苜蓿和小黑麥草3∶1組成。所有原料經(jīng)粉碎后在揚州大學農(nóng)牧場采用20型顆粒料機組制成。顆粒料組成及營養(yǎng)水平見表1，營養(yǎng)水平檢測方法參照《飼料分析及飼料質量檢測技術》[4]。

表1 顆粒料組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)

1)預混料為每千克飼糧提供 Premix provided the following per kilogram of diets:Fe 90 mg,Cu 12.5 mg,Mn 60 mg,Zn 100 mg,I 1.5 mg,Se 0.3 mg,Co 1.0 mg,VA 15 000 IU,VD 5 000 IU,VE 50 mg。

2)營養(yǎng)水平除泌乳凈能、鈣、磷、賴氨酸和蛋氨酸為計算值外均為實測值。Nutrient levels were measured values except that NEL, Ca, P, Lys and Met were calculated values.

1.2 試驗設計與飼養(yǎng)管理

按日齡、體重相近，遺傳基礎相似的原則，試驗犢牛隨機分為2個處理，每個處理3頭。顆粒料每天于08:30、14:30、20:30飼喂3次，預試期14 d，正試期 56 d。根據(jù)3～6月齡犢牛采食量需要，每周調(diào)整1次飼喂量，并保證每個處理犢牛的干物質采食量基本一致。試驗期每個處理犢牛分欄飼養(yǎng)，自由飲水，保證每天有6～7 h戶外活動時間，每日清晨犢牛飼喂后打掃圈舍，且每周對牛舍至少2次消毒。

試驗結束后，宰前禁食12 h。沿縱向剖開腹腔，分離腸道，采集十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸的黏膜層，用少許4 ℃預冷的滅菌生理鹽水沖洗，分別分裝入1.5 mL的離心管中，至液氮速凍，-80 ℃冷凍保存，以備逐一測定。

1.3 試驗方法

1.3.1 腸道各段組織總RNA的提取及檢測

應用Grinder公司高通量組織研磨儀對組織進行勻漿，按照天根生化科技有限公司的RNA提取試劑盒提取。One Drop測定總RNA的濃度和純度，根據(jù)OD260 nm/OD280 nm來評價RNA純度。再進行1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA的亮度評價RNA是否有降解。

1.3.2 cDNA的合成

采用TaKaRa的反轉錄試劑盒。試驗于冰上進行，取PrimeScriptTMRT Master Mix 2 μL，dH2O和RNA組成10 μL體系，再在Eppendorf公司的PCR儀上進行反轉錄。反應條件：37 ℃擴增15 min，85 ℃變性5 s，4 ℃保存，長期保存于-20 ℃。

1.3.3 引物設計與實時熒光定量PCR條件

PCR引物采用Primer軟件設計，由Invitrogen公司合成，引物序列及參數(shù)見表2，將PepT1、PepT2、PHT1、PHT2引物濃度分別稀釋成10 μmol/L。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)標，對PepT1、PepT2、PHT1、PHT2 mRNA進行相對定量分析。

表2 引物設計

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

各樣品引物PCR擴增的Ct由各自的擴增曲線分別得出，并根據(jù)公式2-△Ct數(shù)學推導得出目的基因的量，在該公式中Ct是熱循環(huán)儀檢測到反應體系中熒光信號的強度值，△Ct=Ct目的基因-Ct管家基因，計算出樣品中PepT1、PepT2、PHT1、PHT2基因與管家基因GAPDH相對表達豐度。應用GraphPad Prism 5.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，用Tukey’s法進行多重比較，最后結果經(jīng)均一化處理后，取平均值和標準誤作柱狀分布圖。

2 結 果

2.1 總RNA質量及反轉錄效果

總RNA的OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0之間。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，從圖1可知，未降解的RNA樣品可見到28S、18S帶均很清晰、完整，且其亮度比基本符合2∶1，表明所提取的RNA純度較高，質量可靠。

圖1 總RNA凝膠電泳圖

2.2 GAPDH、PepT1、PepT2、PHT1和PHT2的實時熒光定量PCR電泳圖

GAPDH、PepT1、PepT2、PHT1和PHT2基因實時熒光定量PCR擴增產(chǎn)物的退火溫度(Tm)分別為87.16、86.42、84.67、88.90和86.42 ℃。GAPDH、PepT1、PepT2、PHT1和PHT2基因實時熒光定量PCR擴增產(chǎn)物的電泳結果如圖2所示，根據(jù)表1給出的產(chǎn)物大小判定相應的條帶是目的基因擴增產(chǎn)物。

M：分子質量標準 Molecular weight marker；1：甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH；2：PepT1；3：PepT2；4：PHT1；5：PHT2。

圖2GAPDH、PepT1、PepT2、PHT1和PHT2 mRNA實時熒光定量PCR電泳圖

Fig.2 The electrophoretogram ofGAPDH,PepT1,PepT2,PHT1 andPHT2 mRNA by real-time fluorescence quantitative PCR

2.3 犢牛腸道各段組織中PepT1和PepT2 mRNA的表達

由圖3可知，十二指腸和空腸PepT1 mRNA表達豐度分別極顯著高于回腸、盲腸和結腸(P<0.01)，結腸PepT1 mRNA表達豐度顯著高于盲腸(P<0.05)。

2.4 犢牛腸道各段組織中PepT1、PepT2、PHT1、PHT2 mRNA的表達

由圖4-A可知，處理Ⅰ犢牛十二指腸和空腸PepT1 mRNA表達豐度極顯著高于處理Ⅱ(P<0.01)，結腸PepT1 mRNA表達豐度顯著高于處理Ⅱ(P<0.05)。由圖4-B可知，處理Ⅰ犢牛十二指腸和結腸PepT2 mRNA表達豐度極顯著高于處理Ⅱ(P<0.01)。由圖4-C可知，處理Ⅰ犢牛盲腸PHT1 mRNA表達豐度極顯著低于處理Ⅱ(P<0.01)，回腸和結腸PHT1 mRNA表達豐度顯著高于處理Ⅱ(P<0.05)。由圖4-D可知，處理Ⅰ犢牛十二指腸、結腸PHT2 mRNA表達豐度極顯著高于處理Ⅱ(P<0.01)，盲腸PHT2 mRNA表達豐度極顯著低于處理Ⅱ(P<0.01)。

3 討 論

3.1 PepT1和PepT2 mRNA在犢牛腸道中的表達

前人在單胃動物[5-7]和反芻動物[8-9]的研究中，均發(fā)現(xiàn)PepT1 mRNA主要在小腸表達。Chen等[7]和Pan等[8]Northern Blot分析表明，綿羊和泌乳奶牛的PepT1 mRNA在空腸和回腸表達豐度最高，十二指腸較低，盲腸和結腸未檢測到。隨著檢測技術的更新，應用實時熒光定量PCR方法檢測牛消化道各段Ⅰ型肽載體的表達，李燕[10]發(fā)現(xiàn)牛各腸段PepT1 mRNA表達豐度由高到低的順序依次為回腸、空腸、十二指腸、盲腸和結腸，劉桂梅[11]的結果由高到低的順序依次為空腸、回腸、盲腸、十二指腸和結腸。本試驗結果表明，PepT1 mRNA主要在犢牛十二指腸和空腸表達，與前人反芻動物的檢測結果略有不同。出現(xiàn)這樣的差異，可能跟動物的日齡、品種、飼糧組成等有關，具體原因還有待進一步研究。且Xie等[12]認為奶牛十二指腸是小肽吸收的主要部位，與本試驗PepT1 mRNA表達結果一致。本試驗結果表明，精粗比為75∶25比65∶35飼糧更能促進PepT1 mRNA的表達，可能是因為飼糧中蛋白質來源不同。

數(shù)據(jù)柱形相同或無字母標注表示無顯著差異(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Values with the same or no letters mean no significant difference (P>0.05),while with different small letters mean significant difference(P<0.05), and with different capital letters mean significant difference (P<0.01).

圖3PepT1和PepT2 mRNA在犢牛腸道中的差異性表達

Fig.3 Differential expression ofPepT1 andPepT2 mRNA in intestine of calves

*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

* mean significant difference (P<0.05), ** mean extremely significant difference (P<0.01).

圖4PepT1、PepT2、PHT1和PHT2 mRNA在犢牛腸道中的差異性表達

Fig.4 Differential expression ofPepT1,PepT2,PHT1 andPHT2 mRNA in intestine of calves

PepT2是高親和力/低容量(high affinity/low capacity)的肽轉運蛋白[13]。在大鼠、兔子、牛等動物中檢測到腎臟、乳腺、大腦、肺、胰腺、巨噬細胞[14]等組織和細胞均有表達[15-16]。Zhang等[17]Northern Blot分析表明猴子的腸道中PepT2 mRNA不表達，實時熒光定量PCR分析表明人的腸道中少量表達，本試驗中，PepT2 mRNA在腸道中的表達豐度很低，與Zhang等[17]的研究結果一致。本試驗中，PepT2 mRNA在腸道中表達豐度雖低，但精粗比為75∶25飼糧處理十二指腸和結腸PepT2 mRNA表達豐度極顯著高于精粗比為65∶35飼糧處理，與對應的PepT1 mRNA表達一致，PepT1和PepT2之間是否存在一定的相互作用關系還有待進一步研究。

3.2 PHT1和PHT2 mRNA在犢牛腸道中的表達

PHT1又叫肽/組氨酸轉運蛋白，對組氨酸和肌肽表現(xiàn)出高親和力[18-19]。PHT1主要在大鼠腦和視網(wǎng)膜中表達，腸道中不表達[20]，而在孵化后的雞中各組織廣泛表達。Bhardwaj等[21]免疫組織化學分析表明PHT1在小腸的絨毛上皮表達。本試驗中PHT1 mRNA在犢牛腸中廣泛表達，且表達豐度由高到低依次為盲腸、回腸、空腸、十二指腸、結腸，精粗比為75:25飼糧處理回腸、結腸中表達豐度顯著高于精粗比為65∶35飼糧處理，而盲腸中卻相反，出現(xiàn)這種情況可能是反芻動物盲腸對粗纖維的消化率高的特點造成的[22]。

PHT2除識別二、三肽化合物為底物之外，還介導組氨酸的轉運，但不介導甘氨酸的吸收[20]。目前關于PHT2的研究鮮少，已知大鼠中主要在淋巴系統(tǒng)表達。本試驗中，PHT2 mRNA在犢牛腸道中廣泛表達，且表達豐度由高到低依次為盲腸、結腸、回腸、空腸、十二指腸，精粗比為75∶25飼糧處理十二指腸和結腸中的表達豐度顯著高于精粗比為65∶35飼糧處理，而盲腸中卻相反，出現(xiàn)這種情況可能也是反芻動物盲腸對粗纖維消化率高的特點造成的[21]。PHT2是582個氨基酸編碼的蛋白質，與PHT1具有49%的同一性。Shen等[20]報道鼠中PHT1、PHT2和PepT1、PepT2的同源性低于25%。POTs家族成員的結構、功能、特異性、調(diào)節(jié)作用及各成員之間的相關性還有待進一步闡明。

3.3 犢牛腸道POTs mRNA表達影響因素

研究報道，POTsmRNA的表達受動物的日齡、品種、激素、飼糧組成等因素的影響。Gilbert等[23]給雛雞飼喂等量優(yōu)質蛋白質飼糧(大豆蛋白粉)，從第3～14天肉雞體內(nèi)PepT1 mRNA表達豐度呈不斷上升的趨勢，同時雛雞體重顯著增加，可見飼糧蛋白質品質是影響PepT1活性的重要因素。本試驗中，精粗比為75∶25比65∶35飼糧更能促進犢牛十二指腸、空腸、回腸和結腸POTsmRNA的表達，說明犢牛腸道POTsmRNA的表達受飼糧中蛋白質來源的影響。而犢牛屠宰試驗結果表明，精粗比為65∶35飼糧處理犢牛屠宰性能和內(nèi)臟器官發(fā)育均比精粗比為75∶25飼糧處理略高[24]，且精粗比為65∶35飼糧處理犢牛胃腸道生長發(fā)育較好[25]，說明犢牛腸道POTsmRNA的表達并不能反映動物個體對蛋白質的吸收利用效率，具體原因還有待進一步研究。

4 結 論

①PepT1 mRNA主要在犢牛十二指腸和空腸表達，PepT2 mRNA在犢牛腸道中微弱表達。PHT1主要在犢牛盲腸、回腸、空腸、十二指腸表達，PHT2在犢牛十二指腸、盲腸和結腸表達，尤其是盲腸表達豐度最高。

② 精粗比為75∶25比65∶35飼糧更能促進犢牛十二指腸、空腸、回腸和結腸POTsmRNA的表達，而十二指腸作為小肽吸收的主要部位，說明精粗比75∶25處理隨著腸道轉運蛋白質分解產(chǎn)物POTs增加，蛋白質更易被吸收。

③ 腸道POTsmRNA的表達受飼糧蛋白質來源的影響，但其并不能反映動物個體對蛋白質的吸收利用效率。

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*Corresponding author, professor, E-mail: jszhaoguoqi@sohu.com

(責任編輯 王智航)

Effects of Dietary Concentrate to Forage Ratio on Intestinal Peptide Transporter mRNA Expressions of Calves

GUO Jing YAO Dandan YANG Hongbo HUO Yongjiu ZHAO Guoqi*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou225009，China)

This experiment was conducted to observe the effects of concentrate to forage ratio in pellet diet on the mRNA expressions of peptide transporters (PepT1,PepT2,PHT1 andPHT2) in intestinal mucosa of calves. Six Holstein bull calves with similar days of age and body weight were divided into 2 treatments with 3 calves per treatment. Calves were fed pellet diets with concentrate to forage ratio of 75∶25 (Ⅰ) and 65∶35(Ⅱ), respectively. The preliminary trial period was 14 d and the experimental period was 56 d. The results showed as follows: 1) the expression abundance ofPepT1 mRNA in duodenum and jejunum was significantly higher than that in ileum, cecum and colon (P<0.01), and duodenum and jejunum in treatment Ⅰ were significantly higher than those in treatment Ⅱ (P<0.01). 2) The expression abundance ofPepT2 mRNA intestine was little compared with that ofPepT1 mRNA. The expression abundance ofPepT2 mRNA in duodenum and colon in treatment Ⅰ was significantly higher than that in treatment Ⅱ (P<0.01). 3) The expression abundance ofPHT1 mRNA in cecum in treatment Ⅰ was significantly lower than that in treatment Ⅱ (P<0.01), and ileum and colon in treatment Ⅰ were significantly higher than those in treatment Ⅱ (P<0.05). 4) The expression abundance ofPHT2 mRNA in cecum in treatment Ⅰ was significantly lower than that in treatment Ⅱ (P<0.01), and duodenum and colon in treatment Ⅰ were significantly higher than those in treatment Ⅱ (P<0.01). The results show that compared with 65∶35, concentrate to forage ratio of 75∶25 can promote the expressions ofPepT1,PepT2,PHT1 andPHT2 mRNA.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2015, 27(12)：3951-3958]

PepT1;PepT2;PHT1;PHT2; peptide; peptide transporter; intestine; calve

10.3969/j.issn.1006-267x.2015.12.037

2015-06-17

國家自然科學基金(31572430)；國家“十二五”科技支撐計劃項目(2011BAD17B02)；江蘇省科技支撐項目(BE2013387)

郭 靜(1989—)，女，江蘇揚州人，碩士研究生，研究方向為動物營養(yǎng)與飼料科學。E-mail: yzguojing@hotmail.com

*通信作者：趙國琦，教授，博士生導師，E-mail: jszhaoguoqi@sohu.com

S823

A

1006-267X(2015)12-3951-08