李秀娟，崔玲玲，趙 冬，潘 琢，高偉利

基于全自動毛細管電泳技術建立的單核細胞增生李斯特氏菌MLVA分型方法

李秀娟1，崔玲玲2，趙 冬1，潘 琢1，高偉利1

目的 建立針對食品來源的單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，Lm)分離株的多位點串聯(lián)重復序列分型(Multiple-Locus Variable number tandem repeat Analysis ，MLVA)方法，為暴發(fā)確認和溯源檢測提供實驗室支持。方法 對2005—2014年間分離自食品的91株Lm進行14個可變數(shù)目串聯(lián)重復序列(Variable Number of Tandem Repeats, VNTR)位點的檢測，評估最優(yōu)檢測位點組合并分析檢測結果。結果 通過采用軟件分析，由LMV1、LMV2、LMV7、Lm10、Lm11、Lm23、LM-TR6、TR3和Lm15 等9個VNTR位點組成的位點組合為最優(yōu)MLVA檢測位點，可以將91株Lm分離株分為70個型別，分型能力達到0.987 1。結論 本研究建立的基于全自動毛細管電泳的由9個檢測位點組成的Lm的MLVA分型方法，具有操作簡便、快速、結果客觀、操作標準化、易于在不同實驗室間比較的優(yōu)勢，可作為一線檢測方法用于李斯特菌病的暴發(fā)確認和溯源檢測。

單核細胞增生李斯特氏菌；多位點串聯(lián)重復序列分型；毛細管電泳

李斯特菌屬為革蘭染色陽性兼性厭氧無莢膜桿菌，有7個菌種，分別為單核細胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes，Lm)、綿羊李斯特菌(Listeriaiuanuii)、英諾克李斯特菌(Listeriainnocua)、威爾斯李斯特菌(Listeriainnocua)、西爾李斯特菌(Listeriaseeligeri)、格氏李斯特菌(Listeriagrayi)和默氏李斯特菌(Listeriamurrayi)[1-2]。Lm是唯一能引起人類疾病的李斯特菌，作為一種人畜共患病的病原菌，它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多[3]。盡管李斯特菌病的發(fā)病率相對較低，但對老年人和有免疫缺陷的感染者，致死率可達30%[4]。李斯特菌病主要通過食源性途徑感染，可引起散發(fā)和暴發(fā)事件的發(fā)生。由于該病的發(fā)病率較低，潛伏期長，最長可達71 d，導致在確認李斯特菌病暴發(fā)以及追查污染源方面有較大的困難。而建立可靠的Lm分型方法，擁有分型數(shù)據(jù)庫對于暴發(fā)確認和溯源檢測具有十分重要的意義。本研究旨在通過對分離自食品的Lm的14個可變數(shù)目串聯(lián)重復序列(Variable Number of Tandem Repeats, VNTR)位點的檢測，通過評估檢測位點組合，建立針對食品中Lm分離株的MLVA分型方法，確定優(yōu)勢型別，建立MLVA分型數(shù)據(jù)庫，為以后的溯源檢測和暴發(fā)確認提供實驗室資料支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 91株Lm為2005—2014 年分離自生禽肉、生畜肉、水食產(chǎn)品、速凍米面制品及涼拌色拉，均經(jīng)李斯特菌API Listeria生化鑒定試劑條檢測確認。其中43株Lm分離株由石家莊市疾病預防控制中心分離，48株由河北省疾病預防控制中心饋贈。

1.1.2 主要設備與試劑 9700型PCR儀(ABI公司)，Qiaxcel型全自動毛細管電泳儀(Qiagen 公司)，GoTaq?Colorless Master Mix(Promega公司)，高分辨率的毛細管電泳卡夾(DNA High Resolution Kit Gel Cartridge，Qiagen公司)。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板制備 從血平板上挑取過夜培養(yǎng)的Lm新鮮菌落至400 μL×TE(pH8.0)緩沖液中，震蕩混勻，煮沸5 min，冰上冷卻，10 000 r/min離心5 min，取上清于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 MLVA檢測 本研究所用MLVA檢測位點及引物參考文獻[5-9]。為了避免檢測位點的重復，全部22個位點均經(jīng)過比對確認，最后確認14個位點作為篩選位點，見表1。所有14個位點均采用單重PCR檢測，PCR體系：2 ×Gotaq?Colorless Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL，加水補足體積至25 μL。PCR參數(shù)：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。采用高分辨率的毛細管電泳卡夾經(jīng)全自動毛細管電泳儀檢測PCR擴增結果。

1.2.3 串聯(lián)重復序列數(shù)目的確認 對每個位點的不同長度的擴增產(chǎn)物均送上海生工公司進行雙向測序，參考串聯(lián)重復序列分析軟件Tandem Repeat Finder，確定重復序列數(shù)目。對于無擴增產(chǎn)物的位點，重復序列數(shù)目確定為0；有擴增產(chǎn)物而無重復序列的位點，相應重復序列數(shù)目為1；其余所有菌株重復序列數(shù)目均為實際重復序列數(shù)目+1。

1.2.4 分子血清型檢測 參考文獻[10]，采用一個多重PCR進行Lm的分子血清學檢測。每次PCR均使用陽性對照，陽性對照菌株為09M692(1/2c)和11M5102(4b)，由澳大利亞昆士蘭州法醫(yī)與科學研究所饋贈。

1.2.5 譜系檢測 參考文獻[11]，基于毒力基因actA序列第259位至437位氨基酸的測定，采用Mega5.0軟件將各序列與文獻中公布的譜系特異性氨基酸序列進行比較分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析 采用辛普森指數(shù)(Simposon’s index of diversity，DI)作為計算分辨力的方法[12]，檢測位點的最優(yōu)組合計算采用Optimal Combination Finder (OCT)軟件進行[13]。采用BioNumerics Version 6.6軟件對MLVA分型結果以UPGMA方法構建進化樹。

2 結 果

2.1 14個VNTR位點檢測結果 通過對14個VNTR位點的PCR擴增，絕大多數(shù)位點均可擴增出唯一的目的條帶，但也有些位點無擴增產(chǎn)物(表1)。在91 株Lm中，LM-TR6位點有70株菌無擴增產(chǎn)物，其次為Lm11、LMV9、LMV7和Lm23位點，菌株數(shù)分別為17、14、1和1株。Lm11位點無擴增產(chǎn)物的17株菌株均為1/2a血清型，LMV9位點無擴增產(chǎn)物的14株菌株均為1/2b血清型，LMV7和Lm23位點無擴增產(chǎn)物的菌株分別為1 株1/2a血清型和1 株1/2b血清型；而LM-TR6位點在28株1/2b血清型菌株中均無擴增產(chǎn)物，在15株4b型菌株中有14株無擴增產(chǎn)物，在1/2a型和1/2c型中，分別有27株和1株菌株無擴增條帶。其余9個位點均有不同長度的擴增產(chǎn)物。在14個檢測位點中LMV2位點的分型能力最強，將91株菌分為15個型別，分型指數(shù)為0.891 5，其次為Lm23，分型指數(shù)為0.879 1。而LM-TR2位點的分型能力最弱，91株菌為同一型別。

2.2 MLVA位點最優(yōu)組合的選擇 通過采用OCT軟件計算由2-10個檢測位點組成的所有組合的分型能力(表2)，發(fā)現(xiàn)隨著組合位點數(shù)目的增多，大體呈現(xiàn)分型能力提高的趨勢，但在組合位點達到9個和10個時，分型能力并無增加，而是停留在0.987 1。由此可見，由LMV1、LMV2、LMV7、Lm10、Lm11、Lm23、LM-TR6、TR3和Lm15等9 個位點組成的MLVA檢測體系是最優(yōu)的檢測位點組合，將91株菌分為70個型別，分型能力達到0.987 1。

表1 14個VNTR位點檢測結果

2.3 最優(yōu)的9個VNTR位點組合對不同血清型菌株的分型檢測 利用分子血清分型方法，可將91株Lm分為四種血清類型，分別為1/2a型(1/2a和3a)41株、1/2b型(1/2b、3b和7)28株、1/2c型(1/2c和3c)7株 和4b型(4b、4d和4e)15株。新建立的最優(yōu)的9個位點組合對不同血清型Lm菌株的分型能力均較好，DI值除1/2a型為0.948 7以外，余均大于0.95(表3)。各血清型的主要基因型別非常集中，且該主要基因型同時是該血清型的獨特基因型，在其他血清型中均未檢出。

2.4 進化樹分析 采用BioNumerics Version 6.6軟件以UPGMA方法構建進化樹(圖1)，進化樹分析可將91株Lm分為兩大分支，分別為譜系Ⅰ和譜系Ⅱ，譜系Ⅰ由1/2b和4b血清型的菌株組成，譜系Ⅱ由1/2a和1/2c血清型的菌株組成。譜系Ⅰ的1/2b和4b血清型混雜在一起，不能進一步區(qū)分。而譜系Ⅱ中的7株1/2c血清型菌株單獨聚集成一支。

3 討 論

圖1 以UPGMA方法對MLVA檢測結果構建進化樹

Fig.1 UPGMA dendrogram of MLVA results for 91L.monocytogenesisolates

表2 不同位點組合的分型能力

表3 新建立MLVA方法對不同血清型菌株的分型結果

細菌分型檢測的主要意義在于暴發(fā)確認和污染源追蹤，根本目的是為了確認關聯(lián)菌株。PFGE分型方法采用單一酶切，并不能很好的分辨不同的Lm菌株，需同時進行兩種酶切才能增加分辨力。PFGE雖目前已作為金標準用于分型和暴發(fā)溯源檢測，但該方法的缺點如儀器昂貴、方法難于標準化、結果分析不可避免的主觀化、結果分析需采用專門軟件等，已明顯限制了該方法的推廣應用。目前已有多篇文獻報道，MLVA分型方法可區(qū)分流行病學相關菌株和非相關菌株[7,14-16]以及相關克隆和非相關克隆[17]。2007年，Murphy[8]等首次報道了采用MLVA方法進行Lm的分型檢測，至目前也已有多篇文獻對該方法的建立進行了報道。但由于各文獻采用不用的檢測位點和組合，且沒有穩(wěn)定的標準對位點組合進行評估，因此到目前為止還沒有一套穩(wěn)定的位點組合作為Lm的MLVA分型檢測標準。在目前報道的一些檢測位點中，有些位點的分型能力較弱，有些檢測位點則互相重疊，另還有一些位點出現(xiàn)較多的無擴增現(xiàn)象。篩選合適的檢測位點組合，建立標準化的位點組合和分型策略，對分型檢測結果的確定和比對具有十分重要的意義。

Chenal-Francisque等[17]曾根據(jù)VNTR位點在染色體中位置的不同，選用了18個VNTR位點作為檢測對象，根據(jù)每個位點擴增結果是否滿意，即是否有非特異性擴增，是否有無擴增產(chǎn)物的菌株出現(xiàn)，串聯(lián)重復序列數(shù)目是否容易計算等原因，選擇了11個VNTR位點作為優(yōu)化位點組合，但由于未考慮位點組合不同會導致不同分型結果，因此該方法的DI值只有0.945，低于PFGE方法。筆者曾在澳大利亞采用該14個位點對澳大利亞的183株Lm菌株進行MLVA檢測，DI值最高可達0.991 4，最優(yōu)組合同樣也是9個位點的組合。其中與本研究相同的位點有LMV1、LMV2、LMV7、Lm10 Lm11、Lm23、LM-TR6，不同的位點是以TR3、Lm15替換了LMV6和Lm32。提示菌株來源的不同可能會導致不同的檢測結果，即需要不同的位點組合進行MLVA分型的檢測。Lindstedt[6]也曾報道采用相同的位點組合針對挪威和瑞典兩個國家的Lm分型時顯示出不同的分辨能力，作者認為分辨能力的不同是由于選取菌株來源不同所致。由于MLVA檢測方法的建立是基于具有較高變異率的VNTR位點，因此可能會表現(xiàn)出由于菌株來源不同，而導致分型能力的差異，同時也會出現(xiàn)不同的位點組合導致不同的分型能力的結果，因此建立一套適合我國的、穩(wěn)定的Lm的MLVA方法在李斯特菌病的防控上具有十分重要的意義。本研究最初采用14個VNTR位點對91株Lm進行了檢測，通過采用OCT軟件進行不同位點組合的DI值計算，考慮了不同位點組合對分辨力的影響，確定了由9個檢測位點組成的Lm 的MLVA檢測體系。

多篇文獻報道[7-10,14]顯示LMV2位點的分型能力最強，這與本研究的結果相同，提示該位點變異較大。Sperry報道[9]LM-TR6位點不能擴增1/2b、3b和4b型菌株，本研究結果同樣顯示該位點在1/2b血清型中不存在，而分子血清型為4b的15株菌株中，同樣有14株無擴增產(chǎn)物，而僅有的一株有擴增產(chǎn)物的菌株有可能為4d或4e型菌株，還有待進一步做血清凝集證實。而lm11位點在Sperry[9]首次使用該位點進行MLVA分析時，并未顯示出所有的1/2a菌株均無擴增條帶，本研究顯示的17株1/2a菌株均無擴增條帶，可能為樣本量少，也可能為菌株來源差異所致。LMV9位點在14株1/2b菌株中無擴增條帶，這與Lindstedt[6]文獻中顯示的部分1/2b菌株無擴增條帶的結果相同，但目前由于文獻中菌株量較少，尚無能確定該位點僅在1/2b菌株中會出現(xiàn)缺失。

在17種Lm的血清型中，引起人類李斯特菌病的主要為1/2a、1/2b和4b型菌株。Lindstedt[6]報道采用針對4b型菌株的VNTR位點進行的MLVA分析，檢測結果經(jīng)進化樹分析可見4b型菌株形成不同于1/2血清型的單一簇，可以用于快速區(qū)分4b型菌株。本研究采用優(yōu)化的9個位點進行MLVA分型檢測，對不同血清型均有很好的分辨力，但進化樹分析并不能進一步將4b型菌株區(qū)分開來，但能區(qū)分譜系Ⅰ和譜系Ⅱ的菌株，提示該結果同樣也可為暴發(fā)和菌株的確認提供支持。

本研究優(yōu)化的9個位點，雖然有LM-TR6等可產(chǎn)生較多無擴增條帶的位點，但在確定整體優(yōu)化組合時，LM-TR6位點的加入可使分型數(shù)目由69增加至70，增加了一個基因型，DI值達最大。本研究結果還顯示，Lm23與Lm15兩個位點的組合，DI值即可達到0.950 9，可滿足區(qū)分不同菌株的能力，提示當檢測菌株數(shù)量較多，時間較緊時，可以通過減少檢測位點的數(shù)量，同樣可達到很好的分析結果，可作為實驗室的一線方法用于李斯特菌病暴發(fā)調查和監(jiān)測。

本研究所用的Lm均來源于食品，雖然來源較單一，但采用本研究確定的MLVA方法仍可將91株菌分為70個基因型別，分型能力達0.987 1，可用于不同血清型Lm菌株的分型檢測。該方法建立在普通PCR基礎之上，聯(lián)合使用高分辨率的全自動毛細管電泳，具有操作簡便、快速、價廉、高通量、重復性好，可對食品樣品直接進行檢測[16]的優(yōu)點，另外該方法將檢測結果數(shù)字化，而非采用圖片分析形式，減少了在結果分析過程中的主觀影響，更易實現(xiàn)結果客觀化和操作標準化，因此便于不同實驗室間的結果比較。據(jù)此可建立類似于PulseNet網(wǎng)絡的在線數(shù)據(jù)庫，進行全國范圍的結果比較，從而為該菌在大范圍內的暴發(fā)事件確認提供支持。

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Development of a multiple-locus variable number of tandem repeat typing method forListeriamonocytogenesupon the capillary electrophoresis

LI Xiu-juan1,CUI Ling-ling2,ZHAO Dong1,PAN Zhuo1,GAO Wei-li1

(1.DepartmentofMicrobiology,ShijiazhuangCenterforDiseaseControlandPrevention,Shijiazhuang050011,China; 2.HebeiNormalUniversity,Shijiazhuang050000,China)

In order to develop a multiple-locus variable number tandem repeat analysis (MLVA) method forListeriamonocytogenes(L.monocytogenes), a total of 14 variable number of tandem repeats (VNTR) loci were used to detect the 91L.monocytogenesisolated from food. Results showed that the optimal combination of loci consisted of 9 loci (LMV1, LMV2, LMV7, Lm10, Lm11, Lm23, LM-TR6, TR3, Lm15), which produced the high level of discriminatory ability with Simpson index of 0.987 1 for foodborneL.monocytogenes, could divided 91L.monocytogenesisolates into 70 subtypes. This method required only one conventional PCR followed by automated capillary electrophoresis, providing high discriminatory ability. It was simple, easy to perform, relatively fast, inexpensive, objective, standardized operating and could provide conveniently interlaboratory comparisons, which would be useful in outbreak investigations and listeriosis surveillance as a first line screening method.

Listeriamonocytogenes; multiple-locus variable number tandem repeat analysis (MLVA); capillary electrophoresis

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.09.012

1.石家莊市疾病預防控制中心,石家莊 050011 2.河北師范大學,石家莊 050000; Email:wsws1120@126.com

R378.99

A

1002-2694(2015)09-0839-06

2015-03-12；

2015-06-12