雷智東,孫華庚,趙艷敏,郭曉玲,劉岱琳,*

(1.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院,天津 300162;2.廣東藥學(xué)院,廣東廣州 510006;3.天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司,天津 300457)

大孔樹脂純化鹽酸育亨賓的工藝研究

雷智東1,2,孫華庚3,趙艷敏1,郭曉玲2,劉岱琳1,*

(1.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院,天津 300162;2.廣東藥學(xué)院,廣東廣州 510006;3.天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司,天津 300457)

研究大孔樹脂對(duì)鹽酸育亨賓的純化條件。以靜態(tài)飽和吸附量和解吸率為指標(biāo),比較了八種不同類型的大孔樹脂對(duì)鹽酸育亨賓的純化效果。結(jié)果表明,D101樹脂對(duì)鹽酸育亨賓的純化效果較好,對(duì)D101樹脂的純化條件進(jìn)行了靜態(tài)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定最佳純化條件為上樣濃度:1.0mg/mL,樣液pH2～3,上樣流速為4.0mL/min,樹脂對(duì)樣品的吸附量38.2mg/g,洗脫劑為50%乙醇,洗脫體積6BV。經(jīng)D101大孔樹脂純化后,鹽酸育亨賓的純度相對(duì)于提取粗品提高4～5倍。

鹽酸育亨賓,大孔樹脂,吸附,解吸

鹽酸育亨賓是一種α-腎上腺素受體拮抗劑,通過(guò)選擇性的阻斷突觸前α-腎上腺素能,令血管平滑肌擴(kuò)張,增加外周副交感神經(jīng)的張力,降低交感神經(jīng)張力[1],有著廣泛的藥理作用。有報(bào)道,用于臨床治療動(dòng)脈硬化,還可用于保護(hù)內(nèi)毒素引起的急性肺損傷的α2腎上腺素能受體[2],目前最主要的應(yīng)用于男性性功能障礙[3-4],多用于男性保健品原料?，F(xiàn)在市場(chǎng)上天然植物來(lái)源的育亨賓提取物含量較低。劉璇[5]等用大孔樹脂對(duì)云南蘿芙木中的育亨賓進(jìn)行分離純化,由于蘿芙木中的鹽酸育亨賓含量非常低,盡管通過(guò)大孔樹脂進(jìn)行純化,但其純度僅達(dá)到5.9%。李鵬[6]等用離子交換樹脂對(duì)育亨賓總生物堿進(jìn)行了分離純化,用氨水加80%乙醇溶液洗脫,該精制過(guò)程生產(chǎn)成本較高。本文首次利用來(lái)源非洲塞拉利昂的育亨賓樹的干燥樹皮為原料利用酸水提取。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

育亨賓藥材購(gòu)自非洲塞拉利昂,經(jīng)沈陽(yáng)藥科大學(xué)孫啟時(shí)教授鑒定為非洲植物育亨賓Corynante Yohimbe的干燥樹皮,該標(biāo)本保存在武警后勤學(xué)院生藥學(xué)與藥劑學(xué)教研室,編號(hào)YLDL-2009061;鹽酸育亨賓對(duì)照品 成都曼斯特生物科技有限公司,批號(hào)MUST-13021005,純度≥98%;甲醇和乙腈(色譜純)、95%乙醇 天津市康科德科技有限公司;水為超純水,ADS-7、ADS-8、806大孔樹脂 天津南開合成科技有限公司;D101、D293、D301、D315大孔樹脂 滄州寶恩吸附材料科技有限公司;HP20大孔樹脂 日本三菱。

日本島津公司LC-20AT型高效液相色譜儀(自配SPD-M20A型紫外檢測(cè)器、CTO-20柱溫箱);cosmosil C18柱(2.5μm,4.6mm×250mm);EYEL4型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛(ài)朗公司;NewClassicMS105DU半微量天平 梅特勒-托利多;FA1204B電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;MYB型調(diào)溫電熱套 天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司;FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鹽酸育亨賓粗提液的制備 參照文獻(xiàn)[7],稱取粉碎后的育亨賓藥材150g,加入3000mL 0.5%鹽酸水溶液,在圓底燒瓶中回流提取,溶劑沸騰后計(jì)時(shí)3h。過(guò)濾保留濾液,減壓蒸餾至2000mL,得到以鹽酸育亨賓為標(biāo)量的1.0mg/mL溶液。

1.2.2 鹽酸育亨賓高效液相色譜含量測(cè)定方法及工作曲線的制作 色譜柱:Cosmosil C18柱(4.6mm×250mm,2.5μm);流動(dòng)相,甲醇∶乙腈∶水∶磷酸(60∶1∶90∶0.4);檢測(cè)波長(zhǎng):226nm;流速為1.0mL/min;柱溫為30℃,進(jìn)樣量10μL,測(cè)定鹽酸育亨賓峰面積,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密稱取鹽酸育亨賓1.11mg,加1mL甲醇溶解定容至10mL,搖勻,得0.111mg/mL作為鹽酸育亨賓標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分別量取鹽酸育亨賓標(biāo)準(zhǔn)品溶液,用甲醇稀釋配制成0.555、1.11、1.39、1.67、2.22μg/mL的溶液。按上述色譜條件各進(jìn)樣10μL,記錄與其對(duì)應(yīng)的峰面積,將樣品濃度(X)與經(jīng)高效液相色譜測(cè)定的峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸。

1.2.3 大孔樹脂預(yù)處理 將806、D101、D293、D301、D315、HP20、ADS-7、ADS-8等,八種樹脂分別用95%乙醇充分溶脹浸泡24h。用蒸餾水沖洗,至無(wú)明顯乙醇味為止。用5% NaOH浸泡4h,用蒸餾水沖洗至中性,再用0.5%鹽酸水溶液浸泡4h,用蒸餾水沖洗至中性。

1.2.4 最佳樹脂篩選

1.2.4.1 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取預(yù)處理過(guò)的樹脂1.00g于250mL錐形瓶中,加入定量的吸附原液,避光密閉,置于振蕩器中,25℃,100r/min震蕩,定時(shí)從上清液中取樣,測(cè)定育亨賓的量[8-10]。根據(jù)以下公式計(jì)算吸附量:

吸附量(mg/g)=(C0-C1)·V1/M

式中:C0、C1-吸附前、后原吸附液中鹽酸育亨賓濃度,mg/mL;V1-原吸附液體積,mL,M-樹脂重量,g。

1.2.4.2 靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn) 將充分吸附的樹脂過(guò)濾,用水沖洗后濾干,置于250mL錐形瓶中,加入30%的乙醇水溶液150mL,置于密閉的振蕩器中,25℃,100r/min震蕩,定時(shí)從上清液中取樣,測(cè)定鹽酸育亨賓的量。根據(jù)以下公式計(jì)算吸附量:

解吸率(%)=CV2×150/W

式中：C-洗脫液中鹽酸育亨賓的濃度,mg/mL;W-吸附總量,mg;V2-洗脫總體積,mL。

分別稱取1.00g處理好的806、D101、D301、D315、D293、ADS-7、ADS-8、HP20樹脂于250mL錐形瓶中,按上述方法,使其充分吸附飽和,檢測(cè)其吸附量,計(jì)算吸附率,并用30%乙醇溶液解吸,計(jì)算其解吸率。

1.2.5 D101樹脂靜態(tài)實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 料液濃度對(duì)樹脂吸附量的影響 準(zhǔn)確稱取處理好的D101樹脂1.00g,置于250mL錐形瓶中,分別加入濃度為0.5、1.0、2.0、2.5、3.0mg/mL的鹽酸育亨賓溶液120、60、30、24、20mL,進(jìn)行靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)。

1.2.5.2 不同洗脫溶劑對(duì)解吸的影響 為提高鹽酸育亨賓的回收率,通常都選用解吸率較高的溶劑作為解吸溶劑,但考慮到鹽酸育亨賓應(yīng)用在醫(yī)藥行業(yè)中,因此,本實(shí)驗(yàn)只考慮選擇不同濃度的乙醇作為洗脫劑[11]。

考察不同濃度乙醇溶液對(duì)解吸的影響。分別稱取處理好的樹脂1.00g共6份,置于錐形瓶中,加入等量的原吸附液,使其充分吸附后,將樹脂過(guò)濾,分別加入相同體積的10%乙醇水溶液、20%乙醇水溶液、30%乙醇水溶液、40%乙醇水溶液、50%乙醇水溶液、60%水乙醇溶液,使其充分解吸,測(cè)定其結(jié)果。

1.2.6 D101樹脂動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1 流速吸附的影響 樹脂裝量30g,樣品動(dòng)態(tài)吸附時(shí)的流速分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL/min,測(cè)定室溫下,流速對(duì)D101樹脂的動(dòng)態(tài)吸附影響。

1.2.6.2 樣品最大吸附量的確定 精密量取處理好的濕樹脂250mL裝柱,以流速為4mL/min上樣,考察上樣體積對(duì)吸附量的影響。

1.2.6.3 洗脫體積對(duì)解吸的影響 吸附飽和的D101樹脂,用少量水洗去吸附的水溶性雜質(zhì)類,再用50%的乙醇洗脫,洗脫速度為4mL/min,測(cè)定室溫下50%乙醇水溶液對(duì)樹脂吸附的鹽酸育亨賓的動(dòng)態(tài)洗脫效果,確定洗脫曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽酸育亨賓標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

由圖1可知,鹽酸育亨賓標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=3528509X-35903(R2=0.9997),結(jié)果表明,鹽酸育亨賓在0.555～2.22μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve

2.2 樹脂篩選

結(jié)果如表1所示。

表1 不同樹脂的吸附率與解吸率

結(jié)果顯示,各樹脂的靜態(tài)吸附率差異顯著,吸附順序依次是D101>ADS-8>HP20>D315>D301>ADS-7>806>D293;各樹脂的靜態(tài)解吸率率差異顯著,解吸順序依次是HP20>D101>ADS-8>ADS-7>D315>D293>D301>806,此現(xiàn)象說(shuō)明,大孔樹脂對(duì)鹽酸育亨賓吸附解吸有較強(qiáng)的選擇性,其吸附解吸性能的大小與樹脂的類型有較大關(guān)系。

綜合樹脂對(duì)鹽酸育亨賓的吸附與解吸,表明八種大孔樹脂中D101、ADS-8兩種樹脂對(duì)鹽酸育亨賓有較強(qiáng)的吸附能力,HP20、D101、ADS-8、ADS-7這四種樹脂對(duì)鹽酸育亨賓有著較強(qiáng)的解吸能力。無(wú)論是吸附還是解吸,D101樹脂都優(yōu)于其他樹脂,因此,綜合考慮本實(shí)驗(yàn)選用D101樹脂對(duì)鹽酸育亨賓進(jìn)行精制純化。

2.3 D101樹脂的靜態(tài)吸附解吸研究

2.3.1 料液濃度對(duì)樹脂吸附量的影響 結(jié)果如圖2,在鹽酸育亨賓濃度較低,樹脂吸附鹽酸育亨賓的能力隨著濃度的增加而增加,當(dāng)料液濃度提高超過(guò)1mg/mL時(shí),吸附量隨濃度增加反而減少。這可能與接觸面積有關(guān),但超過(guò)一定濃度其雜質(zhì)也影響樹脂表面與鹽酸育亨賓的接觸機(jī)會(huì),因此,本實(shí)驗(yàn)的樣品液濃度控制在1mg/mL。

圖2 不同濃度的樣品溶液對(duì)吸附的影響Fig.2 Effects of different concentration of sample solution on absorption

本實(shí)驗(yàn)考察上樣濃度時(shí),如果溶液濃度過(guò)大,會(huì)有沉淀出現(xiàn),此會(huì)影響樹脂對(duì)溶液的吸附,因此,濃度應(yīng)較低些,有利于樹脂吸附。

2.3.2 不同洗脫溶劑對(duì)解吸的影響 結(jié)果如圖3,不同濃度乙醇溶液的解吸率,隨著乙醇濃度的增加,解吸率先升高后下降,當(dāng)乙醇濃度達(dá)到50%,解吸率達(dá)到92.8%,因此,本實(shí)驗(yàn)選用50%乙醇水溶液作為洗脫劑。

圖3 不同濃度乙醇溶液的D101樹脂靜態(tài)解吸曲線Fig.3 Static desorption curve of D101 resin at different ethanol solution

在選擇洗脫溶劑時(shí),選取50%乙醇水溶液,可能是當(dāng)乙醇濃度過(guò)大時(shí),在洗脫鹽酸育亨賓的同時(shí)將大量的雜質(zhì)一同洗脫,從而導(dǎo)致結(jié)果降低。

2.4 D101樹脂的動(dòng)態(tài)吸附解吸研究

2.4.1 流速吸附的影響 結(jié)果如圖4,上料液流速對(duì)吸附率的影響差異不大,當(dāng)流速為4mL/min時(shí),吸附率相對(duì)較高,達(dá)到87.9%。此外流速過(guò)慢消耗時(shí)間太多,延長(zhǎng)生產(chǎn)周期,流速過(guò)快吸附較差,且易流失。因此,綜合考慮選擇流速為4mL/min較為適宜。

圖4 流速對(duì)吸附的影響Fig.4 Effects of velocity of flow on adsorption

流速的控制也是本實(shí)驗(yàn)中較為關(guān)鍵的步驟,流速較慢效果較好,但同時(shí)考慮到周期,因此綜合結(jié)果,選擇出最佳流速,如果速度過(guò)快,會(huì)提前泄漏鹽酸育亨賓,導(dǎo)致樣品損失。

2.4.2 樣品最大吸附量的確定 結(jié)果如圖5,當(dāng)上樣體積為1800mL,達(dá)到吸附飽和,流出液與原液中鹽酸育亨賓量達(dá)到相近,這時(shí)吸附率達(dá)到92.5%,此時(shí)為D101樹脂對(duì)鹽酸育亨賓純品的最大吸附量44.74mg/g,如果選擇最大吸附量時(shí)作為上樣體積,則會(huì)有大量的鹽酸育亨賓泄漏,造成資源浪費(fèi);當(dāng)上樣體積為1100～1200mL時(shí),剛剛開始有泄漏,考慮到整體純化效率、節(jié)約生產(chǎn)成本,確定250mL樹脂的最佳上樣體積為1200mL。因此我們選擇在達(dá)到泄漏點(diǎn)時(shí)的吸附量作為上樣體積,即樹脂的吸附量為38.2mg/g,上樣體積為1200mL。吸附過(guò)程中鹽酸育亨賓漏出的時(shí)間較晚,開始泄漏時(shí),泄漏迅速,說(shuō)明D101樹脂的吸附并不是緩慢型,在考察靜態(tài)吸附和解吸時(shí)也同樣表現(xiàn)出這樣的結(jié)果,飽和前不易漏出,吸附較好。

圖5 動(dòng)態(tài)吸附曲線Fig.5 Dynamic adsorption curve

2.4.3 洗脫體積對(duì)解吸的影響 結(jié)果如圖6,在前1000mL(4BV)時(shí),鹽酸育亨賓解吸率達(dá)到91.6%,前250mL解吸液中就有大量的鹽酸育亨賓流出,因此,從一開始就要收集解吸液。D101樹脂上吸附的鹽酸育亨賓,易被解吸,只用很少量的洗脫劑即可使樹脂柱上吸附的鹽酸育亨賓解吸下來(lái),在解吸到1500mL(6BV)時(shí),洗脫解吸率能達(dá)96.5%,解吸較完全。最終測(cè)定經(jīng)D101大孔樹脂精制純化后的鹽酸育亨賓含量高達(dá)17%。

圖6 動(dòng)態(tài)解吸曲線Fig.6 Dynamic desorption curve

3 結(jié)論與討論

在所選的8種大孔樹脂中,D101樹脂對(duì)鹽酸育亨賓有較好的吸附和解吸能力,可用于鹽酸育亨賓的純化。通過(guò)D101樹脂靜態(tài)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn),確定了最佳純化條件:上樣濃度為1mg/mL,上樣流速為4mL/min,鹽酸育亨賓上樣量38.2mg/g,洗脫劑為50%乙醇水溶液,洗脫體積6BV。通過(guò)該條件的純化,可將提取的粗品鹽酸育亨賓提取物純度從3.7%提高到17%以上,提高4～5倍。

本實(shí)驗(yàn)的吸附原液是用0.5%鹽酸水溶液提取,吸附原液的pH為2～3,當(dāng)調(diào)節(jié)pH為4以上,就會(huì)出現(xiàn)分層或沉淀,故本實(shí)驗(yàn)不考察pH對(duì)樹脂吸附的影響,直接將原吸附液pH為2～3進(jìn)行吸附,并且在此條件下育亨賓處于鹽酸育亨賓,極性變大,更容易吸附在樹脂上。

本研究利用D101大孔樹脂,對(duì)育亨賓樹皮粗提液進(jìn)行精制純化,其工藝過(guò)程簡(jiǎn)單,并且所用洗脫溶劑僅為乙醇水溶液,安全環(huán)保。工藝中D101樹脂,乙醇均可重復(fù)利用,不僅節(jié)約能源并且降低成本。通過(guò)最優(yōu)純化工藝,將鹽酸育亨賓的純度提高,效果明顯,具有很高的應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)為生產(chǎn)較高純度的鹽酸育亨賓提供參考。

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Purification of Yohimbine Hgydrochloride by macroprous resin

LEI Zhi-dong1,2,SUN Hua-geng3,ZHAO Yan-min1,GUO Xiao-ling2,LIU Dai-lin1，*

(1.Logistics College of Chinese People’s Armed Police Forces,Tianjin 300162,China;2.Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China;3.Tianjin Jianfeng Natural Product R&D Co.,Ltd.,Tianjin 300457,China)

The purification of yohimbine hydrochloride with macroporous resin was studied. The static adsorption and desorption performance of 8 kinds of resins for yohimbine hydrochloride were compared with static adsorption capacity and elution ratio as evaluation factors. The results showed that the optimum conditions of the static and dynamic adsorption and desorption for separating yohimbine hydrochloride by D101 resin were studied.The optimal conditions were:the concentration of the sample solution of 1.0mg/mL,pH2～3,the colume of the sample quantity of 38.2mg/g,best velocity 4.0mL/min,eluting with 50% ethanol,eluting 6BV. The yohimbine hydrochloride with respect to the purity improved 4～5 times.

Yohimbine hydrochloride;macroporous resin;adsorption;desorption

2014-07-24

雷智東(1989- )，男，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物活性成分研究。

天津市科技特派員項(xiàng)目(14JCTPJC00469)。

TS201.2

B

1002-0306(2015)07-0237-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.042

*通訊作者:劉岱琳(1973- )，女，博士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物活性成分研究。