周小紅,李學(xué)英,楊憲時,劉尊雷

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所,上海 200090)

環(huán)境因子及接種量對單增李斯特菌生長/非生長界面的影響

周小紅,李學(xué)英,楊憲時*,劉尊雷

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所,上海 200090)

單增李斯特菌在實(shí)驗設(shè)定的環(huán)境條件下,通過10倍梯度稀釋將菌懸液分別稀釋到101、103、105、107CFU/mL四個接種水平,然后接種到TSB-YE肉湯中，培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),然后通過肉眼觀察培養(yǎng)基濁度并結(jié)合涂布TSA-YE平板對其生長/非生長情況進(jìn)行判定,通過Logistics多項式回歸模型對處理的數(shù)據(jù)建立了單增李斯特菌生長/非生長的界面模型。實(shí)驗結(jié)果表明不同生長溫度,pH和鹽度的交互作用對單增李斯特菌的生長/非生長界面的影響較大,接種量的大小也會影響單增李斯特菌生長/非生長過渡區(qū)域的具體位置,但具體原因和作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。該研究為抑制單增李斯特菌生長的環(huán)境因子條件范圍和實(shí)際產(chǎn)品中的污染嚴(yán)重程度提供一定的參考依據(jù),對于有潛在單增李斯特菌污染的產(chǎn)品來說,這為加強(qiáng)產(chǎn)品的柵欄因子,優(yōu)化工藝條件以提高其安全度也提供了重要的參考。

單增李斯特菌,生長/非生長界面,影響

微生物生長/非生長模型描述了柵欄因子的協(xié)同作用對微生物生長的影響,這些模型特別適合用來評估溫和加工食品中微生物暴露量的風(fēng)險性[1]。大部分已建立的生長/非生長模型是基于環(huán)境因素如溫度、鹽度(水分活度)、pH和抑菌劑等,而這些研究是在含有較高接種量的實(shí)驗培養(yǎng)基進(jìn)行的[2]。然而食品中發(fā)生致病或?qū)е轮卸镜葯z測到的微生物濃度往往較低。許多食源性致病菌在較低劑量就能使人感染或中毒,尤其是對于一些免疫力低下的人群[3]。

一些研究中有報道微生物的污染程度對于微生物的生長有顯著影響,因此在建立微生物生長模型中應(yīng)該考慮微生物的接種水平。本文探討了不同溫度、鹽度和pH的交互作用對單增李斯特菌生長/非生長情況的影響,并且測定了所設(shè)定環(huán)境條件下不同接種水平對單增李斯特菌生長狀況的影響,旨在分析除了溫度、鹽度和pH交互作用對微生物生長的影響外,進(jìn)一步探討不同微生物接種水平對微生物生長的影響,為微生物生長/非生長界面受環(huán)境因子及微生物接種水平的影響提供定量的參考數(shù)據(jù),并為實(shí)際生產(chǎn)過程中食品中微生物生長/非生長界面模型的建立提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗菌種單核細(xì)胞增生李斯特菌(LM54001) 購自中國藥品生物制品研究所;含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE),含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE),腦心浸液(BHI) 均為北京陸橋技術(shù)有限公司提供。

Sensitire Automated Microbiology System微生物鑒定和藥敏分析儀 英國TECK Diagnostic Systems公司;ESCO CA2-4A1生物安全柜 上海生叉儀器有限公司;LabMASTER-aw型水分活度儀 瑞士Novasina公司;YXQ-LS-50SII全自動立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;Sanyo MIR 253、553高精度培養(yǎng)箱 日本三洋科研設(shè)備公司;Sanyo MIR 150、153恒溫培養(yǎng)箱 日本三洋科研設(shè)備公司;pHS-3C型數(shù)顯酸度計 上海偉業(yè)儀器廠;SA-960-II SHJ-系列凈化工作臺 上海凈化設(shè)備廠;721型可見光分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司。

鄰苯二甲酸氫鉀、硼砂、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、鹽酸等化學(xué)試劑(AR) 均由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海分公司提供。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 菌懸液的準(zhǔn)備 菌株采取斜面低溫保藏法[4]于4℃冰箱中保藏。每月移種一次,實(shí)驗前用無菌接種環(huán)挑取一至兩環(huán)加入無菌TSB-YE液體培養(yǎng)基中,37℃[5]下培養(yǎng)至菌液濃度達(dá)到108CFU/mL[6],以作為菌懸液備用。

1.2.2 實(shí)驗設(shè)計 為了了解單增李斯特菌在各環(huán)境因子和不同接種水平下的生長/非生長界面,本實(shí)驗采用部分分析因子設(shè)計方案。因子和水平的選擇主要基于前期實(shí)驗的單因素實(shí)驗[7]以及一些相關(guān)參考文獻(xiàn)[8]。選擇接種量、溫度、鹽度和pH四個因素,其中接種量分別為101、103、105、107CFU/mL,溫度分別為0、4、10、15、20、25、30℃,鹽度分別為0.5%、2.5%、4.5%、6.5%、8.5%,pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,實(shí)驗結(jié)合TSB-YE培養(yǎng)基和涂布TSA-YE平板對單增李斯特菌的生長與非生長狀況進(jìn)行了全因子實(shí)驗。

1.2.3 生長/非生長實(shí)驗 根據(jù)實(shí)驗設(shè)計,配制TSB-YE液體培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)其鹽度、pH到各實(shí)驗所需的條件下,然后將各培養(yǎng)基分裝到各個試管中,121℃下滅菌20min。將菌懸液分別以10倍梯度稀釋到101、103、105、107CFU/mL四個接種水平,單增李斯特菌的初始接種量通過涂布TSA-YE平板計算得到。各試管震蕩混勻后放入相應(yīng)溫度的恒溫培養(yǎng)箱,根據(jù)前期的實(shí)驗結(jié)果,分別培養(yǎng)不同的時間,每組實(shí)驗做兩個平行,培養(yǎng)結(jié)束后觀察各試管的混濁度。如果試管中菌液混濁度明顯,則判定其生長,并記為1,對于菌液混濁度不明顯或者有質(zhì)疑的試管。則對該試管進(jìn)行涂布確認(rèn),并將菌種培養(yǎng)48h后的菌落總數(shù)與初始接種菌數(shù)進(jìn)行比較,如果最終的菌量比初始接種量多于0.5logCFU/mL[9],則判定單增李斯特菌生長,并記為1,否則記為0。對于實(shí)驗結(jié)果與預(yù)測結(jié)果有偏差的實(shí)驗數(shù)據(jù),按上述方法再次進(jìn)行重新測定確認(rèn),如果還是與預(yù)測結(jié)果不符,則作為異常點(diǎn)保留。

1.2.4 模型的建立 采用多項式logistic回歸模型來擬合實(shí)驗數(shù)據(jù),分析方法通過R軟件的GLM函數(shù)實(shí)現(xiàn)。該模型是由Ratowsky[10]等人通過微生物生長動力學(xué)模型修正而來,此模型為概率模型,通過似然比卡法統(tǒng)計量來檢驗?zāi)Ｐ偷臄M合效果。該模型描述了微生物的生長概率與不同的培養(yǎng)溫度,培養(yǎng)基的pH,NaCl濃度之間的關(guān)系,具體模型如下:

Logit(p)=ln[p/(1-p)]=F

式(1)

式(1)中,p為微生物生長概率,p∈(0,1),F如下:

F=a0+a1T+a2pH+a3bw+a4TpH+a5Tbw+a6pHbw+a7T2+a8pH2+a9bw2

式(2)

式中ai為模型擬合參數(shù)(i=0,1,2,3……9);T為微生物培養(yǎng)溫度;pH為培養(yǎng)基的pH;bw=(1-aw)0.5,aw為培養(yǎng)基水分活度。

為了更好地闡述該回歸模型在描述單增李斯特菌的生長/非生長界面的生物學(xué)意義,令p=0.1、0.5、0.9并用Microsoft Excel Solver來計算這三種情況下生長/非生長界面上的預(yù)測T、pH和bw值。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長/非生長實(shí)驗設(shè)計數(shù)據(jù)及結(jié)果

不同接種量單增李斯特菌在不同生長溫度、鹽度和pH條件下的生長/非生長實(shí)驗設(shè)計及接種量為101CFU/mL時的生長/非生長情況如表1,其中“1”表示生長,“0”表示不生長。從所選的數(shù)據(jù)可以看出單增李斯特菌在低溫下(15℃以下)出現(xiàn)生長情況較少,溫度越低則出現(xiàn)生長情況越少,鹽度越高則出現(xiàn)的生長情況也越少;如在15℃、pH5.5時,單增李斯特菌生長較非生長多,pH≥6.0時,在所有測定的鹽度下生長的情況等于1,而pH為4.5時,生長的情況均為0。因此可以看出pH(4.0～7.5范圍內(nèi))高的環(huán)境更利于該菌株的生長。從所選數(shù)據(jù)可以得出溫度,pH和鹽度對單增李斯特菌的交互影響較為明顯。當(dāng)鹽度為4.5%,溫度為15℃,pH為5.0時,單增李斯特菌不生長,而保持鹽度,溫度不變,pH為6.0時,單增李斯特菌則生長;當(dāng)保持溫度,pH不變,鹽度為2.5%時,則單增李斯特菌出現(xiàn)生長。

表1 實(shí)驗設(shè)計表及結(jié)果

注:“*”表示異常點(diǎn)。

2.2 模型擬合結(jié)果及分析

單增李斯特菌在不同接種水平下的生長/非生長界面的logistic回歸模型相關(guān)參數(shù)的預(yù)測值和標(biāo)準(zhǔn)偏差如表2所示。所有實(shí)驗數(shù)據(jù)經(jīng)過Excel表處理后,通過R軟件的GLM函數(shù)對生長/非生長界面的logistic回歸模型擬合計算后,得到的各個參數(shù)預(yù)測值和標(biāo)準(zhǔn)差(p<0.05),從表中數(shù)據(jù)可看出,各預(yù)測值和標(biāo)準(zhǔn)差的相關(guān)性較好。

表2 不同接種量單增李斯特菌生長/非生長界面logistic回歸模型預(yù)測值和標(biāo)準(zhǔn)差

2.3 接種量對單增李斯特菌生長概率的影響

圖1為25℃條件下接種量分別為101、103、105、107CFU/mL的單增李斯特菌生長/非生長界面的橫截圖[11]。

圖1 不同接種量單增李斯特菌對應(yīng)的生長/非生長界面截面圖Fig.1 Predicted growth/no growth interfaces with respect to pH and salinity at 25℃,for Listeria monocytogenes注:圖中“○”表示單增李斯特菌生長概率為0;“●”表示單增李斯特菌生長概率為1。虛線表示p為0.1的生長/生長界線,實(shí)現(xiàn)表示p為0.5的生長/生長界線,點(diǎn)線表示p為0.9的生長/生長界線。三條線之間的區(qū)域為p∈[0.1,0.9]轉(zhuǎn)換區(qū)域,圖2～圖4同。

由圖1的截面圖可以看出,pH和鹽度對單增李斯特菌生長/非生長的交互影響較顯著,而隨著接種水平的變化,生長與非生長界面的過渡區(qū)域開始發(fā)生移動,在接種濃度較低如由101CFU/mL增加到103CFU/mL時,生長與非生長界面的變化還不是很明顯,而當(dāng)接種濃度達(dá)到105CFU/mL和107CFU/mL時,生長與非生長界面明顯向下移動。接種濃度越大,抑制微生物生長所需的條件越嚴(yán)苛。而且接種濃度不同,0.1、0.5、0.9三條生長/生長界線間的轉(zhuǎn)換區(qū)域?qū)挾纫膊煌?接種量為107CFU/mL時,生長非生長界面在p∈[0.1,0.9]轉(zhuǎn)換區(qū)域最平緩。所以接種量對微生物生長/非生長還是會產(chǎn)生一定的影響,這可能與初始接種菌數(shù)對微生物的生長起點(diǎn)會產(chǎn)生影響有關(guān),也可能與菌種細(xì)胞間的相互作用有關(guān),其具體作用機(jī)制和產(chǎn)生此結(jié)果的原因還有待進(jìn)一步的研究,

2.4 環(huán)境因子對單增李斯特菌生長概率的影響

繪制不同溫度,鹽度和pH下p=0.1、0.5、0.9時的生長/非生長界線,見圖2～圖4。轉(zhuǎn)換區(qū)域之外的空間即為微生物生長和不生長兩種狀態(tài),這對實(shí)際生產(chǎn)來說是最有意義。

2.4.1 溫度對單增李斯特菌生長概率的影響 15、20、25、30℃下鹽度和pH的交互作用對單增李斯特菌的生長概率影響的生長/非生長界面見圖2,從圖2中可以看出,隨著溫度的增加,轉(zhuǎn)化區(qū)域在下移,出現(xiàn)絕對增長的情況變多;隨著溫度的降低,三條曲線的距離逐漸縮短,轉(zhuǎn)換區(qū)域在縮小,即較低的溫度下,pH和水分活度發(fā)生較小的變化時,便會對單增李斯特菌的生長概率造成極大的影響。這個和其他文獻(xiàn)里面報道的情況相同[12-13]。單增李斯特菌是一種對環(huán)境耐受力極強(qiáng)的嗜冷菌,但是由于在低溫下其生長情況較不太穩(wěn)定,建模數(shù)據(jù)不及溫度高一些的理想,這樣會影響建模的結(jié)果,因此文章選取了10℃以上的溫度。從圖中可以看出,15℃下單增李斯特菌在鹽度較低,pH接近中性或偏堿性的情況下生長較旺盛。當(dāng)鹽度為6.5%,pH5.5時,只有在15℃以下,單增李斯特菌的生長才會受到抑制,而當(dāng)溫度越高時,鹽度處在單增李斯特菌生長較理想的鹽度時,單增李斯特菌的生長已經(jīng)不受pH的抑制。例如,當(dāng)T=30℃,鹽度為4.5%,pH5.0時,單增李斯特菌在p=0.5的生長概率為1,即判定為生長。很明顯地可以看出,溫度對p∈[0.1,0.9]轉(zhuǎn)換區(qū)域影響較大。

圖2 不同溫度時單增李斯特菌生長/非生長界線圖Fig.2 Growth/no growth boundaries at different tempreature for the predicted growth probability of Listeria monocytogenes

2.4.2 鹽度對單增李斯特菌生長概率的影響 NaCl濃度為2.5%、4.5%、6.5%和8.5%時,單增李斯特菌的生長/非生長界面見圖3。從圖3中可以看出,鹽度越高,其轉(zhuǎn)換區(qū)域往溫度和pH高的地方移動。圖中很明顯地看出,鹽度對單增李斯特菌生長概率的影響較大。pH很低時,鹽度對單增李斯特菌的抑制作用增強(qiáng)。當(dāng)鹽度較高時,可以在較高的溫度下,抑制單增李斯特菌的生長。例如當(dāng)鹽度為8.5%時,溫度在15℃以下時,單增李斯特菌在pH<6.0條件下均受到抑制,而當(dāng)鹽度為2.5%時,pH<5.0時其生長才受到抑制,說明溫度較低時,鹽度對單增李斯特菌生長的影響較大。當(dāng)鹽濃度較低時,溫度和pH的交互作用對單增李斯特菌生長抑制的影響較大。本實(shí)驗是通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基鹽度來測得其對單增李斯特菌生長的影響,而NaCl達(dá)到一定濃度會形成高滲透壓,會對細(xì)菌有著一定的抑制作用,所以鹽度對單增李斯特菌的生長會產(chǎn)生較大的影響。

2.4.3 pH對單增李斯特菌的生長概率的影響 pH在4.0、5.0、6.0和7.0時單增李斯特菌的生長/非生長界面見圖4。當(dāng)pH越高時,單增李斯特菌的生長狀況越好。當(dāng)pH=7.0時,在實(shí)驗設(shè)定的溫度和鹽度范圍內(nèi),單增李斯特菌的生長完全不受抑制,而當(dāng)pH=4.0時,不論溫度和鹽度如何變化,單增李斯特菌都不生長,即生長受到完全抑制。在pH=5.0和pH=6.0時,單增李斯特菌的生長/非生長轉(zhuǎn)換區(qū)域往鹽度高和溫度低的方向移動。當(dāng)pH越高時,或者處于微酸性或中性時,抑制單增李斯特菌生長時的鹽度和溫度條件越苛刻。而pH達(dá)到4.0時,其他兩個因子的交互作用對單增李斯特菌生長的影響不大。有學(xué)者報道單增李斯特菌的生長pH為4.3～9.6[14],最適pH為中性至弱堿性[15]。這說明當(dāng)微生物所處環(huán)境因子之一接近極限值時,其余因子對微生物生長的影響會很小[16-17]。實(shí)驗數(shù)據(jù)顯示,pH在7和7.5時,單增李斯特菌的生長情況較類似,這也說明單增李斯特菌較適宜在中性或弱堿性環(huán)境中生長。這個對于實(shí)際產(chǎn)品的生產(chǎn)尤為重要,為了抑制單增李斯特菌生長時,可以通過添加一些食用有機(jī)酸適當(dāng)?shù)亟档彤a(chǎn)品的pH。從圖4可以看出,當(dāng)pH為6.0,鹽度低于8.5%時,單增李斯特菌可以在各溫度下生長,溫度起不到抑制其生長的作用。

圖4 不同pH時單增李斯特菌的生長/非生長界線圖Fig.4 Growth/no growth boundaries at different pH for the predicted growth probability of Listeria monocytogenes

3 結(jié)論與討論

微生物安全問題是食品界最為突出的問題,如何抑制食品中有害微生物的生長并極大延長產(chǎn)品的貨架期是食品制造商最為關(guān)心的話題。隨著食品預(yù)測微生物的發(fā)展,有關(guān)微生物的各種預(yù)測模型被建立,這些模型不僅摒棄了傳統(tǒng)預(yù)測方法的耗時,耗力和耗財?shù)娜秉c(diǎn),同時也大大增加了預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性。根據(jù)預(yù)測模型,可以得到在不同的環(huán)境條件例如溫度、pH、鹽度(水分活度)下的微生物生長情況,從而制定出更為嚴(yán)格、更為安全的生產(chǎn)工藝。研究人員更多地是建立微生物生長動力學(xué)模型用來計算產(chǎn)品的貨架期,然而這類模型只能給出微生物生長的信息,卻不能給出微生物不生長的信息。與腐敗菌達(dá)到一定數(shù)量食品才會出現(xiàn)問題不同,致病菌處于任何生長期都有引起中毒的潛在危險,對于含有潛在致病菌和產(chǎn)毒素菌株的食品來說,描述其生長/非生長情況比描述其生長速率更有意義[18]。

從圖2～圖4中可以很明顯地看出不同生長溫度,pH和鹽度的交互作用對單增李斯特菌的生長/非生長界面的影響較大。同時實(shí)驗表明通過適當(dāng)降低生長溫度和pH以及提高培養(yǎng)基的鹽度可以有效地抑制單增李斯特菌的生長。生長/非生長界面圖可以很直觀地描述不同環(huán)境因子之間的交互作用對單增李斯特菌生長概率的影響。同時,如圖1所示,接種量對單增李斯特菌的生長/非生長過度界面也有一定的影響,這可能與初始接種菌數(shù)對微生物的生長起點(diǎn)會產(chǎn)生影響有關(guān),也可能與菌種細(xì)胞間的相互作用有關(guān)。但是具體作用機(jī)制和產(chǎn)生此結(jié)果的原因還有待進(jìn)一步的研究,因此本研究結(jié)果只能提供有限參考。生長/非生長模型能描述出微生物不生長情況,通過得到抑制微生物生長的環(huán)境因子組合可以有效地防止微生物對產(chǎn)品的污染,可以作為新產(chǎn)品研發(fā)或者風(fēng)險評估時的依據(jù),通過得到特定環(huán)境條件下產(chǎn)品中主要致病菌或腐敗菌的生長概率,更好地優(yōu)化生產(chǎn)工藝以抑制這類微生物的生長,提高產(chǎn)品的安全性。但是文中只選取了三個環(huán)境因子,而實(shí)際產(chǎn)品中由于多種防腐劑的添加,或者輻照等工藝的加入,環(huán)境條件要更為復(fù)雜。本文中建立的logistic回歸模型可以為抑制單增李斯特菌生長的環(huán)境因子條件范圍和實(shí)際產(chǎn)品中的污染嚴(yán)重程度提供一定的參考依據(jù),對于有潛在單增李斯特菌污染的產(chǎn)品來說,這為加強(qiáng)產(chǎn)品的柵欄因子,優(yōu)化工藝條件以提高其安全度也提供了重要的參考。但是由于實(shí)驗中采用的基質(zhì)是TSB-YE液體培養(yǎng)基,相對于實(shí)際產(chǎn)品來說,條件較為苛刻,而實(shí)際產(chǎn)品更利于微生物的生長,同時由于各企業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)不一樣,因此劃定生長/非生長的界線標(biāo)準(zhǔn)也與本文中不一樣,這樣也會導(dǎo)致生長/非生長界面模型的差異。因此需要進(jìn)一步以實(shí)際產(chǎn)品為基質(zhì),研究單增李斯特菌的生長情況并建立特定產(chǎn)品的生長/非生長界面模型。

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Impact of environmental factors on growth/no growth interface model ofListeriamonocytogenesunder different inoculum size

ZHOU Xiao-hong,LI Xue-ying,YANG Xian-shi*,LIU Zun-lei

(East China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Shanghai 200090,China)

The growth/no growth responses ofListeriamonocytogeneswere monitored at different environmental factors,and inoculated concentration at four levels(101,103,105,107CFU/mL)by means of 10-fold dilution into tryptic soy broth added with 0.6% yeast extract(TSB-YE),and then cultivated in constant temperature incubator. The study was carried on tryptic soy agar added with 0.6% yeast extract(TSA-YE)plates and growth was monitored visually by observing the turbidity of the medium combined with plate counts. The growth/no growth interface ofListeriamonocytogeneswas modeled by using logistic polynomial regression. Results showed that the hurdle effects of temperature,salinity and pH had a significant influence on the growth/no growth ofListeriamonocytogenes,and inoculation size also had certain impact on the specific position of transition areas on growth/no growth interface ofListeriamonocytogenes,but its mechanism and more details need to be further discussed. This study provided certain references for controlling environmental factors to inhibit the growth of theListeriamonocytogenesand predicting the pollution extent in practical products. For products which have a potential risk ofListeriamonocytogenescontamination,this study also provided an important reference in strengthening the hurdle factors,optimizing process conditions and improving safety for real products.

Listeriamonocytogenes;growth/no growth interface;impact

2014-05-04

周小紅(1988-)，女，碩士，研究方向：食品科學(xué)與工程。

*通訊作者:楊憲時(1954-)，男，本科，研究員，研究方向：水產(chǎn)品加工與貯藏。

農(nóng)業(yè)部引進(jìn)國際先進(jìn)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)項目 (2011-Z12)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)07-0053-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.002