秦亮 陳安民 郭風(fēng)勁 楊卿 任曄 徐飛 廖暉

·實(shí)驗(yàn)研究論著·

羅格列酮對前列腺癌細(xì)胞血管生成擬態(tài)的影響

秦亮 陳安民 郭風(fēng)勁 楊卿 任曄 徐飛 廖暉

目的 探討過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)配體羅格列酮(rosiglitazone，RGZ)對前列腺癌PC-3細(xì)胞血管生成擬態(tài)的影響。方法 體外培養(yǎng)人前列腺癌PC-3細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞增殖與毒性檢測(Cell Counting Kit-8，CCK-8)法觀察羅格列酮不同濃度和不同作用時(shí)間對前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖的影響；體外建立matrigel三維培養(yǎng)系統(tǒng)，觀察羅格列酮對PC-3細(xì)胞血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM) 形成的影響；應(yīng)用RT-qPCR和ELISA的方法檢測血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)、EphA2、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)mRNA和 VEGF蛋白的表達(dá)。結(jié)果 羅格列酮在48 h后明顯抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖,且呈時(shí)間和劑量依賴性。前列腺癌PC-3細(xì)胞在體外三維培養(yǎng)條件下能夠形成環(huán)狀和網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)。羅格列酮能夠抑制PC-3細(xì)胞VEGF、VE-cadherin、EphA2 mRNA及VEGF蛋白的表達(dá)，并使其形成血管生成擬態(tài)的能力明顯降低。結(jié)論 羅格列酮可能通過下調(diào)前列腺癌細(xì)胞VEGF、VE-cadherin、EphA2的表達(dá)抑制血管生成擬態(tài)形成。

前列腺腫瘤；過氧化物酶體增殖物激活受體；羅格列酮；血管生成擬態(tài)

近年來由于我國人口老齡化及生活習(xí)慣的改變，前列腺癌在我國男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病率中已躍升至第三位[1]。血液供應(yīng)在前列腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等環(huán)節(jié)起到了重要作用。在腫瘤中，除了傳統(tǒng)的血管生成外，還有許多沒有內(nèi)皮細(xì)胞附著的管腔、竇腔存在，這些管腔是由腫瘤細(xì)胞圍成的，并且存在過碘酸Schiff(periodic acid-Schiff，PAS)染色陽性的基底膜。這種被稱為血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)的機(jī)制可能是一種不同于經(jīng)典的腫瘤細(xì)胞(特別是腫瘤中沒有血管化區(qū)域)獲得營養(yǎng)而生長的腫瘤血管生成途徑[2]。多種原代腫瘤切片中已經(jīng)被證實(shí)存在這種結(jié)構(gòu)，并且與不良預(yù)后、高轉(zhuǎn)移潛能強(qiáng)相關(guān)[3-5]。

過氧化物酶體增殖體激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)屬于核激素受體超家族的成員。PPARγ是噻唑烷二酮類(TZDs)藥物的分子靶點(diǎn)，后者是一類胰島素增敏劑，包括曲格列酮(TGZ)、環(huán)格列酮(CGZ)、羅格列酮(RGZ)、吡格列酮(PGZ)。PPARγ在多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用，例如：促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化，激活胰島素，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，抑制腫瘤細(xì)胞增殖及對炎癥過程的多種影響[6]。除了代謝方面的機(jī)制外，PPARγ激動(dòng)劑顯示了多種抗腫瘤作用,抑制腫瘤細(xì)胞生長和侵襲，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化，在體內(nèi)模型中抑制自發(fā)性轉(zhuǎn)移[7，8]。

鑒于TZDs可以調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，包括腫瘤細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和其受體，而VEGF(又稱VEGF-A)是血管生成擬態(tài)的重要效應(yīng)分子，是重要的促血管生成因子之一，對內(nèi)皮細(xì)胞生長的生理調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用。作者于2011年1月至2012年1月對PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮(rosiglitazone，RGZ)在前列腺癌血管生成擬態(tài)形成中的作用進(jìn)行了研究，并進(jìn)一步探討其可能機(jī)制。

材料與方法

一、材料

人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，RPMI1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司，胎牛血清購自Gibco公司，胰蛋白酶和羅格列酮購自Sigma公司，CCK-8試劑盒購自北京碧云天公司，基質(zhì)膠Matrigel購自BD公司，TRIzol及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司，RT-qPCR試劑盒購自Toyobo公司，PCR引物由Invitrogen合成，人VEGF ELISA試劑盒及DMSO購自武漢博士德公司。

二、方法

(一)細(xì)胞培養(yǎng)

1. 二維細(xì)胞培養(yǎng) 將前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3 d更換培養(yǎng)基，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行三維培養(yǎng)及其他實(shí)驗(yàn)。

2. 基質(zhì)膠Matrigel三維培養(yǎng) 參考El Hallani等[9]的方法，6孔培養(yǎng)板中每孔放入1張經(jīng)消毒的18 mm×18 mm蓋玻片。在每張蓋玻片的中央均勻滴加50 μl matrigel原液，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)凝固30 min；胰酶消化重懸前列腺癌PC-3細(xì)胞后制成單細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，每孔在凝膠表面接種2 ml細(xì)胞，羅格列酮實(shí)驗(yàn)組分別調(diào)整濃度為0.1% DMSO或0.1、1.0、10.0 μmol/L(由于噻唑烷二酮類藥物濃度>10.0 μmol/L時(shí)會(huì)激活PPARα和PPARδ受體[10]，所以本實(shí)驗(yàn)使用<10.0 μmol/L濃度)，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48 h后倒置顯微鏡觀察，拍照(×100)，每孔拍攝3個(gè)隨機(jī)視野，對形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行手工計(jì)數(shù)，以細(xì)胞間形成的1個(gè)完整管腔為1個(gè)計(jì)數(shù)單位，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

(二)CCK-8實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3制成單細(xì)胞懸液，以1×104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板,在常規(guī)培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h(5%CO2、37 ℃)加入含0.1%DMSO或不同濃度羅格列酮(0.1、1.0、10.0 μmol/L)的培養(yǎng)液100 μl。分別培養(yǎng)1～6 d，加入10 μl CCK-8試劑，避光37 ℃孵育60 min后，于酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇450 nm波長。測定各孔A450值，每組重復(fù)3孔。

(三)RT-qPCR檢測血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)，EphA2、VEGF mRNA表達(dá)

前列腺癌PC-3細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期前列腺癌PC-3細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后轉(zhuǎn)入6孔板。分0.1% DMSO對照組和羅格列酮刺激組(0.1、1.0、10.0 μmol/L)干預(yù)細(xì)胞48 h后以TRIzol抽提不同實(shí)驗(yàn)組總RNA，取1 μg mRNA為模板并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書用隨機(jī)引物合成第一鏈cDNA，然后以cDNA為模板進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測。

引物如下：VEGF上游引物為5′-AGGGCAG-AATCATCACGAAGT-3′，下游引物為5′-GCTGCGCTGATAGACATCCA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為52 bp；EphA2上游引物為5′-TGGCTCACACACCCGTATG-3′，下游引物為5′-CATGTAGATCGGCATGTCATTCA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為72 bp；VE-cadherin上游引物為5′-TTGGAACCAGATGCACATTGAT-3′，下游引物為5′-TCTTGCGACTCACGCTTGAC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為86 bp。內(nèi)參GAPDH上游引物為5′-CCATGAGAAGTATGACAACAGCC-3′，下游引物為5′-GGGTGCTAAGCAGTTGGTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物70 bp。

反應(yīng)按照Toboyo RT-qPCR檢測試劑盒說明書，在BIO-RAD實(shí)時(shí)定量PCR儀上完成，且應(yīng)用GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行歸一化。反應(yīng)完成后，目的基因的相對表達(dá)量由2-ΔΔCT計(jì)算得到，其中ΔΔCT=ΔCT實(shí)驗(yàn)組-ΔCT對照組。

(四)ELISA法檢測PC-3細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF表達(dá)

前列腺癌PC-3細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期前列腺癌PC-3細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后轉(zhuǎn)入24孔板，貼壁生長24 h后，分別按0.1%DMSO對照組和羅格列酮刺激組(0.1、1.0、10.0 μmol/L)濃度更換等量無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，離心取上清，ELISA法檢測VEGF含量，按試劑說明書進(jìn)行檢測。每組重復(fù)3次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料及計(jì)數(shù)資料間的兩兩比較分別采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、羅格列酮體外抑制PC-3細(xì)胞增殖

使用羅格列酮0.1、1.0、10.0 μmol/L及0.1% DMSO處理對數(shù)生長期的前列腺癌PC-3細(xì)胞1～6 d，前2天CCK-8比色法顯示，各組A450值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。自第3天開始，加藥組細(xì)胞分別較對照組增殖明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

二、前列腺癌細(xì)胞可以形成VM，羅格列酮可抑制其VM形成

PC-3細(xì)胞接種6 h后，可見細(xì)胞貼附在膠表面，彼此間呈鑲嵌樣生長。12 h以后，部分前列腺癌PC-3細(xì)胞伸出細(xì)長突起，彼此之間相互連接，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。DMSO對照組中，三維培養(yǎng)48 h后可見前列腺癌PC-3細(xì)胞形成環(huán)狀和網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)(圖2a、b)。而羅格列酮刺激48 h后，前列腺癌PC-3細(xì)胞形成環(huán)狀和網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)較對照組明顯減少。0.1、1.0 μmol/L組可見前列腺癌PC-3細(xì)胞能夠形成條索狀和長條形，可形成少量環(huán)狀結(jié)構(gòu)，但數(shù)量明顯減少(圖2c、d)；而10.0 μmol/L組中，前列腺癌PC-3細(xì)胞基本不能形成條索狀和長條形(圖2e)。得到DMSO對照組、0.1、1.0、10.0 μmol/L羅格列酮刺激組環(huán)狀結(jié)構(gòu)數(shù)目分別為(31.33±4.53)個(gè)、(19.67±3.15)個(gè)、(11.67±0.58)個(gè)、(5.33±1.53)個(gè)，羅格列酮刺激組分別與對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，且抑制作用呈明顯劑量正相關(guān)性。

acbed圖2 PC?3細(xì)胞VM形態(tài)學(xué)觀察及不同濃度羅格列酮對其影響 a：對照組前列腺癌PC?3細(xì)胞VM形成×100；b：前列腺癌PC?3細(xì)胞×400；c：0．1μmol/LRGZ組×100；d：1．0μmol/LRGZ組×100；e：10．0μmol/LRGZ組×100

三、羅格列酮抑制VEGF、VE-cadherin和EphA2 mRNA表達(dá)

與對照組DMSO處理細(xì)胞比較，羅格列酮0.1、1.0、10.0 μmol/L刺激細(xì)胞后，VEGF mRNA相對表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)：(1.00±0.06)vs.(0.59±0.06)vs.(0.39±0.05)vs.(0.29±0.04)。VE-cadherin mRNA和EphA2 mRNA相對表達(dá)水平也較對照組明顯降低，10.0 μmol/L組對其抑制作用最強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，對照組及0.1、1.0、10.0 μmol/L羅格列酮刺激組比值分別為(1.00±0.05)vs.(0.74±0.05)vs.(0.71±0.04)vs.(0.59±0.04)，(1.00±0.05)vs.(0.68±0.05)vs.(0.61±0.04)vs.(0.56±0.04)(圖3)。

四、羅格列酮抑制VEGF蛋白表達(dá)

與對照組DMSO刺激前列腺癌PC-3細(xì)胞比較，羅格列酮刺激細(xì)胞48 h后，細(xì)胞培養(yǎng)上清VEGF蛋白表達(dá)水平明顯降低，0.1、1.0和10.0 μmol/L羅格列酮刺激組分別與DMSO對照組比較，抑制率分別達(dá)到37.44%、55.64%和63.08%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05，圖4)。

討 論

PPARγ對VEGF的影響尚存在爭議。Peeters等[11]報(bào)道顯示羅格列酮通過PPARγ反應(yīng)元件與VEGF啟動(dòng)子作用抑制VEGF表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，羅格列酮在0.1、1.0、10.0 μmol/L濃度時(shí)均可明顯抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞VEGF的表達(dá)，其抑制率分別達(dá)到37.44%、55.64%和63.08%。另外，Terrasi等[12]得出結(jié)論相反的報(bào)道稱TZDs增加VEGF的表達(dá)。這些差異考慮與不同的試驗(yàn)中使用的細(xì)胞系不同有關(guān)。但是目前尚不清楚這些爭論是由哪些特殊機(jī)制引起的。

本研究顯示，羅格列酮可明顯抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞VM形成，而其同時(shí)可以抑制VEGF的分泌，對于羅格列酮是否是通過抑制VEGF的分泌而進(jìn)一步抑制下游VE-cadherin和EphA2等效應(yīng)分子從而最終影響VM形成，臨床上尚有疑問。目前關(guān)于VEGF對惡性腫瘤形成血管生成擬態(tài)現(xiàn)象中的作用也存有爭議。而有些研究通過siRNA沉默VEGF基因等方法證實(shí)了VEGF在黑色素瘤、卵巢癌和骨肉瘤等實(shí)體腫瘤血管生成擬態(tài)形成過程中起到了重要作用，是VM形成的關(guān)鍵影響因素[4，13，14]。然而郄碩等[15]研究發(fā)現(xiàn)有血管生成擬態(tài)現(xiàn)象存在的腫瘤組織中VEGF表達(dá)不增加，甚至下調(diào)。其可能原因是腫瘤組織通過血管生成擬態(tài)獲得了足夠的血供，氧氣供應(yīng)充足，故而VEGF表達(dá)降低。Schnegg等[16]報(bào)道稱使用VEGF抑制劑會(huì)增加HIF1α表達(dá)及VM的形成。這可能是由于使用VEGF抑制劑后腫瘤組織血供減少，繼而腫瘤組織通過自身血管生成擬態(tài)的形成增加血供的一種適應(yīng)性選擇。

本實(shí)驗(yàn)希望通過對VEGF、VE-cadherin和EphA2等分子的研究了解羅格列酮對前列腺癌血管模擬的影響及相關(guān)作用機(jī)制。羅格列酮在作用前列腺癌PC-3細(xì)胞48 h后明顯抑制其增殖。為排除細(xì)胞增殖差異對結(jié)果的影響，血管生成擬態(tài)實(shí)驗(yàn)時(shí)間選為48 h。結(jié)果顯示，羅格列酮作用于三維培養(yǎng)的細(xì)胞48 h后形成環(huán)狀或網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)明顯減少，與血管模擬密切相關(guān)的VEGF、VE-cadherin和EphA2等效應(yīng)分子表達(dá)均明顯降低，提示羅格列酮可能通過下調(diào)VEGF、VE-cadherin、EphA2的表達(dá)抑制血管生成擬態(tài)形成。為探討PPARγ配體藥物用于腫瘤治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

0.20.4mRNA表達(dá)對照組0.00.60.1μmolL/組1.0分組0.8EphA21.2VE-cadherinVEGF1.0μmolL/組10.0μmolL/組*********圖3 不同濃度羅格列酮對PC?3細(xì)胞VEGF、VE?cadherin和EphA2mRNA表達(dá)的影響 羅格列酮刺激細(xì)胞48h后，PC?3細(xì)胞VEGF、VE?cadherin和EphA2mRNA相對表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(?P<0．05)

200400VEGF(pgmL)/對照組06000.1μmolL/組分組8001.0μmolL/組10.0μmolL/組***1000圖4 不同濃度羅格列酮對PC?3細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響 細(xì)胞培養(yǎng)上清VEGF蛋白表達(dá)水平明顯降低，不同羅格列酮刺激組分別與對照組比較，抑制率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(?P<0．05)

目前，針對血管生成擬態(tài)分子機(jī)制的研究尚有很大爭議，其與傳統(tǒng)的內(nèi)皮依賴性血管之間的關(guān)系尚不明確，但其在腫瘤血液供應(yīng)中的重要作用正受到越來越多的重視，而VEGF、VE-cadherin、EphA2及PPARγ等相關(guān)基因在血管生成擬態(tài)中作用還有待進(jìn)一步的研究。

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Effect of rosiglitazone on vasculogenic mimicry in prostate cancer cell line PC-3.

QINLiang,CHENAnmin,GUOFengjin,YANGQing,RENYe,XUFei,LIAOHui.

DepartmentofOrthopaedics,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China

LIAOHui,E-mail:liaohui0001@yahoo.com

Objective To investigate the effect of rosiglitazone (RGZ), the ligand of peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ), on vasculogenic mimicry in human prostate cancer cell line PC-3invitroand to reveal the related molecular mechanisms. Methods PC-3 cells were culturedinvitro. The effect of RGZ with different concentrations (0.1, 1.0 and 10.0 μmol/L) and different action durations (1 to 6 days) on the growth of PC-3 cells was detected by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay. A 3-dimensional cell culture system for PC-3 cells was established to observe vasculogenic mimicry formation. The change of vasculogenic mimicry formation under RGZ treatment was observed. Realtime-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was used to detect the effect of RGZ on the mRNA expression of VEGF, VE-cadherin, and EphA2, respectively. The expression of VEGF protein was analyzed by ELISA. Results RGZ significantly inhibited the cell proliferation after 48 h in a dose- and time-dependent manner. PC-3 cells could form patterned matrix VM or tubular VM in 3-demintional culture system. RGZ markedly reduced VM density or formed shorter tubular VM in 0.1, 1.0, 10.0 μmol/L groups than in control group. After treatment with RGZ for 48 h, the expression levels of VEGF, VE-cadherin, and EphA2 mRNA were decreased in RST-treated group as compared with control group. Meantime, RGZ inhibited VEGF protein secretion, respectively. Conclusion The results indicated that activation of PPARγ by RGZ can inhibit VM formation in PC-3 cells, which may be through down-regulation of the expression of VEGF, VE-cadherin and EphA2.

Prostatic neoplasms; Peroxisome proliferator-activated receptors; Rosiglitazone; Vasculogenic mimicry

10.3969/j.issn.1674-8573.2015.06.002

教育部新教師基金項(xiàng)目(200804871051)；湖北省衛(wèi)生廳青年人才基金(QJX2010-5)

430030 武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院骨科

廖暉，E-mail：liaohui0001@yahoo.com

2015-07-21