楊一沖，李從發(fā)，鄧健，劉龍祥，胡淇淞，畢繼才，陳華美，章翠，劉四新

（海南大學(xué)，海南海口570228）

椰纖果（nata de coco），又名椰果，是在食品工業(yè)中應(yīng)用的細(xì)菌纖維素。椰纖果食品因富含膳食纖維、熱值低、不含膽固醇，且口感脆嫩爽滑一直在中國(guó)及其他東南亞地區(qū)熱銷不衰。其實(shí)，椰纖果由于就是細(xì)菌纖維素、具有許多優(yōu)良特性，如化學(xué)純度高、生物相容性好、可生物降解等而在醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域具有更廣闊、附加價(jià)值更高的應(yīng)用，是世界上公認(rèn)的性能優(yōu)異的新型生物材料[1-4]。

椰子水因富含營(yíng)養(yǎng)、一直是海南和其他東南亞地區(qū)生產(chǎn)椰纖果的主要原料。本實(shí)驗(yàn)室及海南生產(chǎn)企業(yè)長(zhǎng)期的實(shí)踐表明，椰子水經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的自然發(fā)酵，其椰纖果產(chǎn)量遠(yuǎn)較使用新鮮椰子水高。但據(jù)了解，各地區(qū)生產(chǎn)nata的椰子水處理方式不完全相同，如泰國(guó)是用新鮮椰子水生產(chǎn)、越南是用發(fā)酵椰子水生產(chǎn)，印尼既用發(fā)酵椰子水也用新鮮椰子水、菲律賓則多用椰漿。椰子水原料在不同地區(qū)處理方式的不同，可能與所用菌種、菌株的不同有關(guān)，也與發(fā)酵條件和工藝不盡相同有關(guān)。在海南，椰纖果生產(chǎn)由于都使用自然發(fā)酵的椰子水，椰子加工廠常將椰子水隨意放置，甚至發(fā)酸、變味。由于不同廠家環(huán)境、或不同季節(jié)、甚至原料椰子的產(chǎn)地不同，都會(huì)使椰子水的前期發(fā)酵呈現(xiàn)復(fù)雜和多變的狀況，因此給椰纖果生產(chǎn)的直接影響就是椰纖果產(chǎn)量和品質(zhì)很不穩(wěn)定。并且由于是自然發(fā)酵，不排除有害微生物生長(zhǎng)的可能，這也給椰纖果生產(chǎn)帶來(lái)不安全隱患。

因此，研究椰子水在自然發(fā)酵過(guò)程中的成分及微生物群落變化是非常必要的，可以為進(jìn)而研究其菌相變化、為闡明對(duì)椰纖果生產(chǎn)有促進(jìn)作用以及負(fù)向作用的主要微生物和成分等奠定基礎(chǔ)，特別是為探明椰子水自然發(fā)酵狀態(tài)下是否有、哪些是不安全因素、以及如何防范等做好前期工作。相關(guān)文獻(xiàn)鮮見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 椰子水樣品

?？谑惺酆Ｄ媳镜匦迈r椰子，破殼取水，紗布過(guò)濾、分裝于潔凈礦泉瓶，無(wú)菌透氣封口膜封口，室溫下靜置存放，自然發(fā)酵0 d～8 d，每天取樣。將每瓶樣品分為兩份：一份用于微生物的測(cè)數(shù)和分離，另一份做成分分析。

1.1.2 培養(yǎng)基

麥芽汁培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽（VRBG）培養(yǎng)基均購(gòu)自青島日水生物技術(shù)有限公司，PCA培養(yǎng)基、酸化MRS培養(yǎng)基、改良Chalmers培養(yǎng)基、醋酸菌（AAB）培養(yǎng)基[5-7]。

上述培養(yǎng)基于121℃滅菌20 min，待冷卻至50℃加入0.1%那他霉素（麥芽汁培養(yǎng)基除外），搖勻；固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂后滅菌，冷卻后加入0.1%那他霉素混勻、倒平板。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

1260液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；SKY-2112B立式雙層大容量恒溫培養(yǎng)箱：金壇市盛藍(lán)儀器有限制造公司；Delta320-SpH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；WYT手持折光糖度儀：成都市青年聯(lián)合光學(xué)儀器成套部。

1.2 方法

1.2.1 成分分析

用注射器取椰子水液面下5 cm處0.2 mL樣品滴于pHS-25數(shù)顯酸度計(jì)中測(cè)定pH；總酸測(cè)定采用氫氧化鈉溶液滴定法[8]；可溶性固形物測(cè)定采用手持糖度儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果以°Bx表示；還原糖測(cè)定采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法[9]。

乳酸和醋酸測(cè)定樣液的制備：將待測(cè)樣品與硫酸鋅（72 g/L），三水合鐵氰化鉀（36 g/L），以 1∶1∶1的比例混合，10 000 r/min離心 10 min，0.22 μm 的微孔濾膜過(guò)濾過(guò)濾，進(jìn)樣量為10 μL，重復(fù)進(jìn)樣3次，用各有機(jī)酸的回歸方程計(jì)算各種成分的含量。

液相色譜條件：分析儀器為Agilent1260型高效液相色譜儀，色譜柱為AgilentZORBAX-SB-Aq（250 mm×4.6 mm），流動(dòng)相為用高氯酸調(diào)pH2.5的水溶液作為流動(dòng)相；流速：0.6 mL/min；柱溫 55℃，檢測(cè)器為VWDVL+，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm進(jìn)樣量：10 μL。采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

1.2.2 椰子水自然發(fā)酵過(guò)程中微生物的分離計(jì)數(shù)

在不同平板培養(yǎng)基上分別分離純化真菌和細(xì)菌。30℃恒溫培養(yǎng)48 h～72 h，選擇合適的稀釋濃度觀察并記錄菌落個(gè)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 椰子水自然發(fā)酵過(guò)程中可溶性固形物及還原糖變化

椰子水自然發(fā)酵過(guò)程中可溶性固形物及還原糖變化見(jiàn)圖1。

圖1 椰子水發(fā)酵過(guò)程中可溶性固形物及還原糖變化Fig.1 Changes in soluble solidsand reducing sugar during the natural fermentation of coconut water

還原糖的下降趨勢(shì)與可溶性固形物基本一致，發(fā)酵前3 d還原糖下降速度較快，因其作為速效碳源能迅速被各種微生物利用，用于細(xì)胞繁殖。3 d后還原糖消耗減緩?？扇苄怨绦挝镆蚱錁?gòu)成較復(fù)雜，被利用和消耗的變化幅度較緩和，推測(cè)這也與其中的微生物會(huì)同時(shí)產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物有關(guān)。

2.2 椰子水自然發(fā)酵過(guò)程中pH及總酸變化

新鮮椰子水的原始pH一般在4.5～5.3左右[10]，此次測(cè)定值為5.14，椰子水自然發(fā)酵過(guò)程中pH變化見(jiàn)圖2。

圖2 椰子水自然發(fā)酵過(guò)程中pH及總酸變化Fig.2 Changes of pH and titratable acid value during the natural fermentation of coconut water

在發(fā)酵前3 d，pH迅速下降，到發(fā)酵第4天～第5天后趨于平穩(wěn)、最后保持在3.8左右。這較前人研究的椰子水經(jīng)自然發(fā)酵5 d的pH3.64為高[11]，這可能是環(huán)境不同，所生長(zhǎng)的微生物區(qū)系不同所致。

新鮮椰子水的總酸含量在前2 d迅速升高，隨后降低，到第4天后又緩慢上升。這可能是一些耐酸微生物在初期繁殖起來(lái)后代謝了一部分有機(jī)酸類、導(dǎo)致總酸下降，然后后期可能是一些兼性厭氧微生物持續(xù)生長(zhǎng)、產(chǎn)酸又使總酸上升。但后期pH變化較之總酸緩和可能與體系里復(fù)雜多樣的產(chǎn)物使其具有一定緩沖能力有關(guān)。

2.3 椰子水自然發(fā)酵過(guò)程中乙酸和乳酸變化

在椰纖果的生產(chǎn)中，劉四新等曾直接用新鮮椰子水，但須用乙酸調(diào)節(jié)pH值，若用其他常用無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸調(diào)節(jié)則可能產(chǎn)量降低或不產(chǎn)。故推測(cè)自然發(fā)酵椰子水中乙酸等對(duì)椰纖果合成具有重要意義[12]。本研究以液相色譜法著重測(cè)定了乙酸和乳酸變化情況，在椰子水自然發(fā)酵過(guò)程中其變化見(jiàn)圖3。

圖3 乳酸和乙酸濃度變化Fig.3 Changes lactic acid and acetic acid concentration

顯示椰子水自然發(fā)酵過(guò)程中，乙酸產(chǎn)量并不大、且變化不顯著，而乳酸產(chǎn)量極顯著高于乙酸，推測(cè)自然發(fā)酵椰子水體系中有大量各種乳酸菌的繁殖和消長(zhǎng)，且產(chǎn)生的乳酸可能對(duì)椰纖果的合成起到一定的促進(jìn)作用。

2.4 椰子水自然發(fā)酵過(guò)程中微生物數(shù)量變化

椰子水自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌和真菌菌落數(shù)量變化見(jiàn)圖4。

圖4 細(xì)菌和真菌菌落數(shù)量變化Fig.4 Changes of aerobic plate count of bacteria and fungi

在椰子水自然發(fā)酵過(guò)程中同時(shí)存在細(xì)菌和真菌兩類微生物，且細(xì)菌類數(shù)量更多，真菌中又以酵母菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，霉菌數(shù)量很少。圖4顯示，細(xì)菌的增殖十分旺盛，第1天數(shù)量就達(dá)到1×1010，且第2天達(dá)到高峰，隨后稍降并維持在1×109以上，第6天又一次超過(guò)1×1010。而真菌數(shù)量高峰稍滯后于細(xì)菌、于第3天達(dá)到約1×109，隨后一直呈緩慢下降趨勢(shì)。可見(jiàn)，微生物總數(shù)變化規(guī)律與還原糖、可溶性固形物和總酸、pH的變化是基本吻合的，即在前3天是微生物總數(shù)呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的階段，而后真菌數(shù)量減少，但細(xì)菌類數(shù)量始終維持較高水平。

2.5 椰子水自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落變化

發(fā)酵體系中細(xì)菌群落變化如圖5所示。

圖5 椰子水自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落變化Fig.5 Changes in APC values of bacteria during the natural fermentation of coconut water

乳酸菌和醋酸菌在體系中數(shù)量最多、占主要優(yōu)勢(shì)，且都在第2天達(dá)到峰值，隨后3 d～6 d稍降，又都在第7天小幅回升。結(jié)合乙酸和乳酸成分變化，說(shuō)明這兩類菌的增殖變化趨勢(shì)基本一致，且兩類菌對(duì)成分變化有較大影響。另外，大腸菌群和芽孢菌的變化趨勢(shì)也比較接近，最高數(shù)量都發(fā)生在第1天，之后呈持續(xù)下降的趨勢(shì)。這兩類菌是發(fā)酵椰子水中可能的不安全因素，雖然其數(shù)量會(huì)隨著發(fā)酵時(shí)間而下降，而且在椰纖果工業(yè)生產(chǎn)中會(huì)將自然發(fā)酵椰子水煮沸滅菌再使用，但因芽孢桿菌耐高溫的特點(diǎn)，也容易發(fā)生滅菌不徹底而導(dǎo)致椰纖果發(fā)酵的產(chǎn)量和品質(zhì)不穩(wěn)定等問(wèn)題。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)以自然發(fā)酵椰子水為研究對(duì)象，對(duì)其發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，在測(cè)定了發(fā)酵體系中常規(guī)成分變化的同時(shí)，解析了發(fā)酵過(guò)程中的微生物數(shù)量和群落的變化，獲得如下結(jié)論：

在實(shí)驗(yàn)室條件下，自然發(fā)酵的椰子水可溶性固形物及還原糖變化主要出現(xiàn)在發(fā)酵前3 d，在此期間，pH也急劇下降，然后穩(wěn)定在pH3.8左右；總酸含量在第2天達(dá)到第一個(gè)高峰，隨后先下降后上升；在觀察結(jié)束時(shí)體系中的乳酸和乙酸含量分別為1.54g/L和0.28g/L；發(fā)酵初期，各種微生物迅速増殖，也在前3 d達(dá)到最大值，而后真菌數(shù)量逐漸減少，細(xì)菌數(shù)量始終維持在較高水平。在細(xì)菌體系中檢測(cè)到了乳酸菌、醋酸菌、腸菌群、芽孢桿菌，其中乳酸菌和醋酸菌數(shù)量最多，且對(duì)成分變化有較大影響，而腸菌群和芽孢桿菌的存在也使得自然發(fā)酵椰子水存在一定安全隱患。雖然在椰纖果工業(yè)生產(chǎn)中會(huì)將自然發(fā)酵椰子水煮沸滅菌，但因芽孢桿菌耐高溫的特點(diǎn)容易發(fā)生滅菌不徹底而導(dǎo)致的產(chǎn)量不穩(wěn)定及存在安全隱患。

根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，可進(jìn)一步研究自然發(fā)酵椰子水中的菌相變化，并在此基礎(chǔ)上，結(jié)合后期的深入研究，有可能分析出對(duì)產(chǎn)量穩(wěn)定和產(chǎn)品安全不利的有害菌，為有效避免不穩(wěn)定的自然發(fā)酵，避免其可能產(chǎn)生的安全隱患問(wèn)題而奠定良好的基礎(chǔ)。這將為海南椰纖果行業(yè)擺脫椰子水的放任式自然發(fā)酵，走向高產(chǎn)、高效、安全的生產(chǎn)新模式尋找出路，也對(duì)提升海南椰纖果行業(yè)現(xiàn)行生產(chǎn)水平和品質(zhì)安全產(chǎn)生深遠(yuǎn)的意義。

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